sự trao đổi vật chất di truyền của vi khuẩn phân hủy 2,4-d bằng phương pháp tiếp hợp

Chi phí và số lần sử dụng thuốc BVTV trong một mùa vụ ở một số quốc gia Đông nam Á Thành phần phản ứng BOX-PCR Chương trình nhiệt và thời gian của phản ứng BOX-PCR ODạoo của dòng vi khu

SU TRAO DOI VAT CHAT DI TRUYEN CUA

VI KHUAN PHAN HUY 2,4-D BANG PHUONG

PHAP TIEP HOP

CAN BQ HUONG DAN: SINH VIEN THUC HIEN: Ths NGUYEN THI PHI OANH HUYNH MINH DUC

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân vả Cô hướng dẫn Các

số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất

kỳ luận văn nào trước đây

Ths Nguyễn Thị Phi Oanh Huỳnh Minh Đức

Tôi trân trọng gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến:

Thạc sĩ Nguyễn Thị Phi Oanh, Bộ môn Sinh học, Khoa khoa học tự nhiên,

Trường Đại học Cần Thơ luôn tạo điều kiện thuận lợi, hướng dẫn tận tình và đóng góp nhiều ý kiến quý báu cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Ban chủ nhiệm Khoa Khoa Học Tự Nhiên cùng quý Thầy, Cô Bô môn Sinh

học, Khoa Khoa Học Tự Nhiên đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ nhiệt tình cho

tôi hoàn thành tốt luận văn

Ban giám đốc, quý Thầy, Cô Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh

học đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành tốt các thí nghiệm phục vụ cho đề tài luận

văn này

Tập thể lớp Sinh học Khóa 33, anh Hứa Văn Ủ - học viên cao học chuyên ngành Sinh thái học Khóa 14, chị Lê Huyền Trân — học viên cao học chuyên ngành

Sinh thái học Khóa 15 đã ủng hộ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận văn

Gia đình và tất cả những người thân luôn động viên, tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Xin trân trọng cảm ơn với tắm lòng thành kính nhất!

Cần thơ, ngày 6 tháng 5 năm 2011

Huỳnh Minh Đức

MỤC LỤC

TRANG DANH MỤC TỪ VIẾT TẮTT 2-2 2£ £xSESE SE ke+EEEEEEEEEEEESEEEEkEeerxrrsrreerrrrrred i

2.1.1 Định nghĩa thuốc bảo vệ thực vật . - se xxx E191 SE gexee 3

2.1.2 Lịch sử phát minh thuốc bảo vệ thực vật . + 2 2s2scsecscesesreee 3

2.1.3 Tình hình sử thuốc bảo vệ thực vật trên thế giới - 2 2 2 sc+cscscs¿ 4

2.1.4 Tình hình sử dụng thuốc bảo vệ thực vật ở Việt Nam và ĐBSCL 5

2.2 KHAI QUAT VE 2,4-D 6 2.2.1 GiGi thiGu 2,4-Dio.ccccccccccccscsccscecssscsssssscssessscssssssssssssscssssssessssssessssesessessesees 6 2.2.2 Tình hình sử dụng 2,4-D trên thế giới .- ¿5-52 2s se ExeEeEsrksrerssred 7

2.2.3 Tình hình sử dụng 2,4-D ở Việt Nam và ĐBSC, << «<< << ssssss 7

2.3 SỰ PHÂN HỦY SINH HỌC 2,4-D - 2-2-2 52SeSx2EESEEEEEEEEsrrrrerrerrrre 8

2.3.1 Lộ trình phần hủy sinh học 2,4-Ï - G G0900 9 0010 0 10 mg 8

2.3.2 Vi khuân phân hủy 2,4-DD 26-2 ©5< SE SE 19 3 1511131215 10k, 9

2.3.3 Các gen liên quan đến khả năng phân hủy 2,4-D ở vi khuẩn 10

2.4 SỰ TIẾP HỢP Ở VI KHUẨN 5 2s sex Se EeESES ke SeSeEeEeEeEeeeerersreeeresrsree 11

2.5.2 Kỹ thuật điện đi AIDN 2+ s21 E1 E3 3 13113215 151132111112 crk 14 PHAN III: PHUONG TIEN VA PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 3.1 THOI GIAN VA DIA DIEM .ccecssessessssessssesssessssesssssssecsecsessessesseseessssssseseessessesscesees 15 3.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 2-2 2+2 +2 +2 E+#ES££ SE EE£ESEEEeEEeEszrkrred 15

3.2.1 Dòng vi khuân được sử dụng để khảo sát khả năng tiếp hợp 15

3.2.2 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm . + 2-2 s©z©#+x#+rvrxrrzcrxerxrrecree 16

3.2.3 Hóa chất thí nghiệm ¿2 +8 ©S£ E2 EE£S2EE#S#£xEEEEE E23 EEEEAEEESererrsrre 17

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2-2 2 2 2x + EE£Ee+ESEEzExeExerxrrsrrerrrree 17

3.3.1 Xác định thời gian tăng trưởng tối ưu của vi khuân S1 và AE§15 17

3.3.2 Tiếp hợp ở vi khuẩn phân hủy 2,4-D dòng S1 và vi khuân AE815 18

3.3.3 Xác định tần số tiếp hợp giữa vi khuẩn S1 và vi khuẩn AE815 bằng phương pháp đếm sống _ -. 5+ 2-52 E22 E331 EEESEEEEEEEEEEEEEEEETkEErrxrrererree 18

3.3.4 Trích ADN của vi khuẩn tiếp hợp và vi khuẩn AE§15 . -. 19

3.3.5 Box-PCR và điện di - - + 2s se S2 x11 13 1011071111111 1.11 1xx 19 PHAN IV: KET QUÁ VÀ THẢO LUẬN 2-2 te xe e+eseEerreeresrkered 22

4.1 THOI GIAN TANG TRUONG TOI UU CUA DONG VI KHUAN S1 VA AE815 22

4.2 TIẾP HỢP CỦA VI KHUAN S1 VA AEB 15 vocsccccccssccsessesssssessssssesssssssessesssstsessssssssees 23 4.3 TAN SO TIEP HOP CUA VI KHUAN S1 VA AEB 15 icccscscssessssccssssesscssssesseseessssees 24

4.4 BOX PCR VA DIEN D1 ececssccccscsssssessessssessssssscssssssscscsssssssessesssessessssesscesssssecsssesesees 29

PHAN V: KET LUAN VA DE NGHI.uu sccescccccssscsscsscsssesssssscsscsssssessscsssssesstessesseesseenes 30

5.1 KET LUAN .ccccccccccscscccsssceccssecescscssscscscscscsscssscsescsssssacsescscaescsssasacaeacasscsssaacanacseaeaessess 30

5.2 ĐỀ NGHỊ - G2 St E9 S999 SE E92 St E9 9E SE SE SE E991 T992 1g geerrerree 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO 2 - s66 EE SE SE EE SE SE SE EE SE SE EEEEEEEEEeEekereerrerrreree 31

Chi phí và số lần sử dụng thuốc BVTV trong một mùa vụ ở

một số quốc gia Đông nam Á

Thành phần phản ứng BOX-PCR

Chương trình nhiệt và thời gian của phản ứng BOX-PCR

ODạoo của dòng vi khuẩn S1 và dòng vi khuẩn AE815 theo

thời gian

Số lượng khuẩn lạc của nghiệm thức đối chứng AE8§15 trên

các loại môi trường chọn lọc khác nhau

Số lượng khuẩn lạc của nghiệm thức đối chứng S1 trên các

loại môi trường chọn lọc khác nhau

Số lượng khuẩn lạc của nghiệm thức tiếp hợp AE815 (pS1)

trên các loại môi trường chọn lọc khác nhau

DANH SÁCH HÌNH

TRANG

Hình 1 Công thức cầu tạo hóa học của 2,4-D 6

Hinh2 Lộ trình chuyển hóa 2,4-D theo Top, 1995 8

Hinh3 Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn S1 trên môi trường TSA 15

Hinh4 Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn AE815 trên môi trường TSA 16

có bồ sung Rif

Hinh6 Tăng trưởng của vi khuẩn S1 và vi khuẩn AE8§15 theo thời gian 22

Hình7 Hình thái khuẩn lạc của vi khuân tiếp hợp trên môi trường 23

khoáng tối thiểu có bố sung 2,4-D va Rif 50

Hình 8 Hình thái khuân lạc của vi khuẩn tiếp hợp trên môi trường TSA 24

có bố sung Rif 50

Hình9 Nhỏ giọt đếm sống vi khuẩn tiếp hợp AE815 (pS1) trên môi 25

trường TSA va Rif 50 ở độ pha loãng từ 10 !đến 10

Hình10 Phổ điện di sản phẩm BOX-PCR cùa vi khuẩn tiếp hop AE815 29

(S1)

Bovine serum albumin

Bao vé thuc vat

Cong tac vién Đồng Bằng Sông Cửu Long Dimetyl Sulfoxide

Deoxyribonucletide triphosphate Ethylene Diamine Tetracetic Acid Ethidium Bromide

Food and Agriculture Organization Mineral medium salt

Polymerase Chain Reaction Sodium Dodecyl Sulfate Tris-Borate-EDTA Trypticase Soy Borth

TÓM LƯỢC

Kết quả nghiên cứu sự trao đổi vật chất di truyền giữa dòng vi khuẩn S1 có

khả năng phân hủy 2,4-D được phân lập trên đất lúa ở Sóc Trăng và dòng vi khuẩn không có khả năng phân huý 2,4-D Cupriavidus metallotolerans AE815 bang phương pháp tiếp hợp cho thấy có sự trao đổi vật chất di truyền giữa hai dòng vi

khuẩn này Vi khuẩn tiếp hợp AE815 (pS1) đã được chọn lọc trên môi trường khoáng tối thiểu có bổ sung 2,4-D va Rif 50 Khuẩn lạc của dòng vi khuẩn AE815

(pS1) có màu trắng trong, trơn láng và bìa nguyên

Phô điện di sản phẩm BOX-PCR của vi khuẩn tiếp hợp AE815 (pS1) va vi

khuẩn đối chứng AE815 cho thấy các vạch (band) ADN hiện diện ở các vị trí giống

nhau trên øel agarose Điều này chứng tỏ gen phân hủy 2,4-D đã được chuyền từ vi khuẩn cho (S1) sang vi khuẩn nhận (AE815) bằng con đường tiếp hợp với tần số là

7,05%.

PHẢN I

DAT VAN DE

Theo thống kê của Tổng cục thống kê Việt Nam, dân số thế giới giữa năm 2009 khoảng 6810 triệu người (www.gso.gov.vn) Áp lực tăng dân số đòi hỏi các nhà khoa học nghiên cứu tìm giải pháp tăng sản lượng lương thực của thế giới Nhiều biện pháp được đưa ra như: tạo giỗng mới có năng suất cao, tăng cường sử dụng

phân bón, thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) để tăng năng suất, đảm bảo an ninh

lương thực

Chính vì vậy, nhiều quốc gia đã gia tăng năng suất cây trồng bằng cách sử dụng

phân bón và nông dược ngày càng tăng Hậu quả là môi trường ngày càng 6

nhiễm do thuốc BVTV bị tích tụ ngày càng nhiều trong môi trường đất, nước và không khí Vì thế nghiên cứu về sự phân hủy sinh học các loại thuốc BVTV là rất

cân thiết

Ở Việt Nam, thuốc BVTV đóng vai trò quan trọng trong sản xuất nông nghiệp

Mỗi năm cả nước sử dụng 36000 tấn thuốc BVTV cho nông nghiệp Lạm dụng thuốc BVTV trong sản xuất nông nghiệp sẽ gây ô nhiễm môi trường Bên cạnh

đó, sử dụng thuốc BVTV không đúng liều lượng và không tuân theo các nguyên

tắc an toàn khi sử dụng thuốc sẽ ảnh hưởng trực tiếp và gián tiếp đến sức khỏe cua con ngudi (FAO, FAO-STAT, 2004, Statistics downloaded for Vietnam, http://apps.fao.org/default.jsp)

2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) là một trong những loại thuốc diệt cỏ đã

và đang được sử dụng rất phô biến ở Việt Nam 2,4-D là thuốc diệt cỏ lá rộng,

nội hấp, có chọn lọc, có tác dụng kích thích sự phát triển không kiểm soát của tế

bào làm cho cỏ chết Thời gian bán hủy của 2,4-D tương đối dài: 393 ngày ttrong đất, 66 ngày trong không khí, và 39 ngày trong nước 2,4-D ít tan trong nước và bền với môi trường acid, dễ phân hủy ở môi trường kiềm và có thể bị phân hủy

bởi các vi sinh vật đất như: Achromobacter, Burkholderia, Delftia, Halomonas, Pseudomonas, (Huong và ctv., 2007) Hiện nay, 2,4-D vẫn được nông dân ở

ĐBSCL sử dụng rộng rãi để trừ cỏ lá rộng trên ruộng lúa sau khi trồng 10 đến 15

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

CHUYÊN NGÀNH SINH HỌC

ngày, liều lượng dùng khoảng 1,2-2lít/ha Các vi khuẩn phân hủy 2,4-D cũng đã

được phân lập trên đất lúa ở Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) (Hứa Văn Ủ,

2010) Tuy nhiên, đặc điểm di truyền của các dòng vi khuẩn này vẫn chưa được

khảo sát Vì vậy đề tài “Sự rao đổi vật chất di truyền của vi khuẩn phân húy 2,4-D bằng phương pháp tiếp hợp” được thực hiện với mục tiêu:

> Chuyến gen có khả năng phân hủy 2,4-D từ dòng vi khuẩn phân hủy 2,4-D

phân lập trong đất lúa ở Sóc Trăng sang vi khuẩn nghiên cứu không có khả năng phân hủy 2,4-D Cupriavidus mefallotolerans AE815 bằng phương pháp tiếp hợp

> Xác định được tân sô tiêp hợp của các vi khuan nay

PHAN II

LUOC KHAO TAI LIEU

2.1 TONG QUAN VE THUOC BAO VE THUC VAT

2.1.1 Định nghĩa thuốc bảo vệ thực vật

Thuốc BVTV hay nông dược là những chất độc có nguôn gốc từ tự nhiên hay hóa chất tổng hợp được dùng để bảo vệ cây trồng và nông sản, chống lại sự phá hoại của những sinh vật gây hại đến tài nguyên thực vật Những sinh vật gây hại

chính gồm sâu hại, bệnh hại, cỏ dại chuột và các tác nhân khác

(www.ctu.edu.vn/colleges/agr1⁄/etrinh/bvtv/rau%20sach/source/nongDuoc/chuon g1.htm)

2.1.2 Lịch sử phat minh thuốc bảo vệ thực vật

Từ xa xưa khi nghề trồng trọt bắt đầu phát triển, con người đã biết dùng các chất độc để phòng trừ dịch hại Tuy vậy, do điều kiện sinh thái và quy luật cân

bằng tự nhiên, lúc đầu các loài dịch hại còn ít và chưa quen với chất độc, trình

độ kỹ thuật còn thấp, con người chủ yếu dùng các chất có sẵn trong tự nhiên, nhất là các cây có độc, được chế biến và sử dụng một cách đơn giản Sau đó, do sản xuất nông nghiệp ngày càng phát triển, dịch hại nhiều, thuốc bảo vệ thực vật cũng được phát minh và sử dụng ngày càng nhiều, nhất là từ đầu thế kỷ 20 đến nay (Phạm Văn Biên, 2000) Lịch sử phát minh có thé chia lam 4 giai doan:

Giai đoạn 1: Trước những năm 1940, chủ yếu sử dụng những hợp chat

vô cơ Trong đó thuốc trừ sâu và chuột phô biến là chất thạch tín (Asen), thuốc

trừ nắm bệnh có đồng (Cu), lưu huỳnh (S), thủy ngân (Hg), thuốc trừ cỏ có các

chat sodium chlorat, calcium cyanamid, Phần lớn những chất này có độ độc

cao và tôn lưu tương đôi lâu trong môi trường

Giai đoạn 2: Từ những năm 1940 đến 1960 là thời gian phát minh hàng

loạt các hợp chất hữu cơ, trước hết là thuốc trừ sâu nhóm Clo hữu cơ (DDT, BHC (Benzene hexachloride), tiếp đến là các thuốc trừ sâu nhóm lân hữu cơ và carbamat Trong giai đoạn này đáng chú ý nhất là các phát minh thuốc trừ sâu

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

CHUYÊN NGÀNH SINH HỌC

DDT (1939), BHC (1941), Carbamate (1947), Parathion và 2,4D (1944), thuốc trừ chuột chống đông máu

Giai đoạn 3: Từ những năm 1960 đến 1980, là thời gian phát minh các

hợp chất trừ sâu Pyrethroid tổng hợp (1970) và các thuốc trừ bệnh, trừ cỏ hữu

cơ Đây cũng là thời kỳ phát minh các thuốc trừ sâu, trừ bệnh có nguồn gốc sinh

học hoặc tác động sinh học, các chất kích thích, điều tiết sinh trưởng cây trồng

Khái niệm phòng trừ sâu bệnh tông hợp cũng được nêu ra trong giai đoạn này

Giai đoạn 4: Từ những năm 1980 đến nay, là thời kỳ phát minh nhiều

loại thuốc trừ sâu, bệnh, cỏ dại có nguồn gốc mới, trong đó chú ý nhiều đến các chất sinh học Đây cũng là thời kỳ quan điểm quản lý dịch hại tổng hợp

(Integrated Pest Management, IPM) duoc phé bién rộng rãi, các thuốc bảo vệ

thực vật cũng được phát minh và sử dụng theo hướng này Ngoài hiệu quả

phòng trừ dịch hại, tính an toàn của thuốc bảo vệ thực vật ngày càng được chú ý

nhiều hơn (Phạm Văn Biên, 2000)

2.1.3 Tình hình sử thuốc bảo vệ thực vật trên thế giới

Chỉ trong thời gian hơn nửa thế kỷ qua, nhất là từ những năm 1980 đến nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của các ngành khoa học, công nghệ, thuốc bảo

vệ thực vật cũng được phát minh và sử dụng ngày càng nhiều, đem lại những

lợi ích kinh tế to lớn Năm 2001, tông chỉ phí sử dụng thuốc BVTV của thế giới

lên đến 31,5 tỉ đô la, trong đó Mỹ đã chỉ 11 tỉ đô la tương đương 1,2 tỉ pound trong số 5 ti pound cả thế giới sử dụng (Fishel, 2007)

Hiện nay ở các nước Châu Âu, chính phủ đang quan tâm mạnh mẽ đến van dé 6 nhiễm mặt nước ngầm và nước mặt do thuốc BVTV gây ra Điển hình, ở Flanders (Bi), chinh phủ quy định hoạt chất của thuốc BVTV trong mặt nước ngầm và nước mặt không thể vượt qua 0,5 ug/l Mac dù vậy, vẫn còn khoảng 5% các mẫu thực phẩm chứa hoạt chất của thuốc BVTV quá quy định cho phép

Thêm vào đó, nguồn nước mặt dùng làm nước uống hằng năm vẫn phải tốn một

chỉ phí khá lớn cho việc sử lý thuốc BVTV vượt quá ngưỡng quy định

(Breugelans, 2008)

Ở khu vực Châu Á và Đông Nam Á, thuốc BVTV cũng được sử dụng rộng rãi

Chi phí sử dụng thuốc BVTV một vụ ở một số quốc gia tương ứng như sau:

Trung Quốc 25,6 USD/ha; An Độ 24,9 USD/ha; Philippines 26,1 USD/ha;

Indonesia 7,7 USD/ha; trong đó Việt Nam sử dụng nhiều nhất với chỉ phí là 61,6 USD/ha (Dung và Dung, 1999)

2.1.4 Tình hình sử dụng thuốc bảo vệ thực vật ở Việt Nam và ĐBSCL

Lúa gạo từ lâu đã được xem là cây lương thực chính ở Việt Nam, bao gồm

khoảng 65% tổng diện tích canh tác của khu vực ĐBSCL được xem là vựa lúa

của cả nước, cung cấp hơn 50% sản lượng lúa sản xuất trong một năm Bên cạnh

đó, những thay đổi trong định hướng chính sách kinh tế cuối những năm 1980,

sản xuất lúa tăng nhanh chóng với tốc độ ấn tượng: năm 1995 cao hơn 5,1% so với năm 1986 Sự tăng sản xuất lúa đáng kể đã giúp đất nước vượt qua khủng hoảng lương thực trong hơn hai thập kỷ và tạo ra thặng dư trong xuất khẩu gạo Tuy nhiên, từ cuối năm 1960 nông dân đã sử dụng rộng rãi các giống năng suất cao và tăng sản lượng bằng phương pháp thâm canh Vì vậy, năng suất và sản lượng tăng nhưng bên cạnh đó chỉ phí cho việc sử dụng thuốc BVTV cũng tăng theo và nông dân càng lệ thuộc nhiều vào thuốc BVTV (Dung và Dung, 1999),

Ở ĐBSCL, xu hướng lạm dụng thuốc BVTV trong phòng trừ sâu bệnh làm cho chi phí sử dụng thuốc BVTV của nông dân ĐBSCL tăng cao hơn so với Đồng bằng Sông Hồng, cao hơn cả các nước khác trong khu vực (Bảng ])

Bang 1: Chỉ phí và số lần sử dụng thuốc BVTV trong một mùa vụ ở một số quốc gia Đông nam A (Dung va Dung, 1999)

LUẬN VĂN TÓT NGHIỆP KHOA KHOA HOC TU NHIEN

CHUYEN NGANH SINH HOC

Ở ĐBSCL, trung bình nông dân sử dụng lượng thuốc BVTV khoảng 1017 gram

hoạt chất/ha/mùa, trong đó, thuốc diệt cỏ trung bình mỗi vụ sử dung 323 gram

hoạt chất/ha (Dung và Dung, 1999)

2.2 KHÁI QUÁT VẺ 2,4-D

2.2.1 Giới thiệu 2,4-D

2,4-D có tên khoa học là 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid, là một trong những

loại thuốc diệt cỏ được sử dụng rộng rãi nhất trên thế giới Nó kiểm soát sự phát

triển của cỏ dại xâm hại trên các lĩnh vực nông nghiệp, bãi cỏ, công viên công cộng, hồ (www.24d.org)

s* Danh pháp:

Tên thông dụng: 2,4-D

Tén thuong mai: OK; Vi 2,4-D; Anco; Zico

Tên khoa học: 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid

s* Công thức hóa học: C;ạH,Cl;O;

Hình 1: Công thức cấu tạo hóa học của 2,4-D

~ Tính chất vật lý và hóa học:

Phân tử lượng 2,4-D: 221,04 (g/mol)

Hình thái 2,4-D: dạng bột, có màu trăng đến màu vàng nâu Ở 25°C, 2,4-D có thé hoa tan 900 mg/l

Dựa trên thông tin sử dụng thuốc trừ sâu từ năm 1992 đến 2000 cho nông nghiệp

và từ năm 1993 đến 1999 cho phi nông nghiệp, tổng lượng sử dụng 2,4-D ở Mỹ

là 46 triệu pound, với 30 triệu pound (66%) được sử dụng cho nông nghiệp và 16 triệu pound (34%) được sử dụng cho phi nông nghiệp Tổng số 2,4-D được sử dụng chủ yếu để phân bố đồng cỏ (24%), thuốc diệt cỏ và phân bón dân dụng (12%), lúa mì mùa xuân (8%), lúa mì mùa đông (7%), hoa viên cây cảnh (7%),

cỏ trông ở nhà (không có phân bón) (6%), bắp (6%), đậu nành (4%) 2,4-D

được sử dụng chủ yếu ở miền Midwest, miền Great Plains, và Tây Bắc Hoa Kỳ

(EPA, 2005)

2.2.3 Tình hình sử dụng 2,4-D ở Việt Nam và ĐBSCL

Hiện nay, 2,4-D vẫn được nông dân Việt Nam nói chung và ĐBSCL nói riêng sử

dụng rộng rãi để trừ cỏ lá rộng trên ruộng lúa sau khi trồng 10-15 ngày, liều

lượng sử dụng khoảng 1.2-2 lít/ha (www.khoahoc.com.vn)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

CHUYÊN NGÀNH SINH HỌC

2.3 SU PHAN HỦY SINH HỌC 2,4-D

2.3.1 Lộ trình phân hủy sinh học 2,4-D

Theo Top và ctv,1995, 2,4-D được vi khuẩn phân hủy trong môi trường nuôi cấy

nhờ các enzyme đặc hiệu, cát đứt các liên kết hóa học để cuối cùng tạo ra

succunic acid Succunic acid di vào chu trình acid citric (Krebs) của quá trình hô

hấp tế bào như là một hợp chất cho ion H”

2.3.2 Vi khuẩn phân hủy 2,4-D

Một số nghiên cứu ở Brazil cho thấy các giống và lồi vi sinh vật cĩ khả năng phân hủy 244D bao gdm: Acinetobacter sp, Serratia marcescens, Stenothrophomonas maltophilia sp, Flavobacterium va Penicillium sp Cac vi khuẩn này đều tạo bào tử và là vi khuẩn Gram âm (Silva và ctv., 2007) Pseudomonas pseudodicahgens NRRL B-18087 và Pseudomonas pseudoalcaligenes NRRL B-18086 do Roy va Rouge (1989) phân lập được cĩ khả năng phát triển trên cả hai cơ chất 2,4,5-T, 2,4-D Hai dịng này đều cĩ kha năng sử dụng 2,4-D và 2,4,5-T là nguồn năng lượng và carbon duy nhất

Maltseva va ctv (1996) đã chứng minh Halomonadaceae 1-18 cĩ khả năng phần

hủy 3000 mg 2,4-D/I trong 3 ngày trên mơi trường cĩ bơ sung 50 mg cao men

Lộ trình phân hủy 2,4-D ở Halomonadaceae strainn 1-18 tương tự lộ trình phân hủy 2,4-D của dịng Ạcaligenes eutrophus JMP134

Ở Việt Nam, 3 dịng vi khuẩn Arthobacter sp DNB19, Arthobacter sp DNB20,

Arthobacter sp DNB21 được phân lập từ đất nhiễm thuốc diệt cỏ cĩ chứa dioxin

ở sân bay Đà Nẵng cũng cĩ khả năng phân hủy 2,4-D (Nguyễn Bá Hữu và Đặng

XKDN12 (Dang Thi Cam Ha va ctv., 2008: Dang Thi Cam Ha va ctv., 2005;

Hồng Thị Mỹ Hạnh và ctv., 2004; Nguyễn Bá Hữu và ctv., 2007; Nguyên

Đương Nhã và ctv., 2005; Nguyễn Thanh Thủy va ctv., 2006).

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

CHUYÊN NGÀNH SINH HỌC

2.3.3 Các gen liên quan đến khả năng phân hủy 2,4-D ở vi khuẩn

Hai gen czđÁ và /A tham gia chuyển hóa 2,4-D được tìm thay ở dòng Arthobacter sp DNB19 Gen cadA ở dòng DNB 19 tương đồng 93% với gen

cadA cua dong Sphingomonas sp B6-10 Gen cadA & dong HSO1 duoc phan lap

từ môi trường tương đồng 89% voi gen cadA ở dòng Sphingomonas sp TFD26; 88% voi cadA ở dòng Sphingomonas sp TFD44 Gen tfdA & dòng DNBI19 có mirc tuong déng 94% voi tfdA cia céc ching Burkholderia sp RASC, Burkholderia sp.Ff54, Ralstonia sp Y103; 91% voi tfdA & dong Delftia

acidovorans P4a va 77% v6i tfdAa & dong Bradyrhizobium sp Hw13 (Dang Thi

Cam Ha va ctv., 2008)

Có nhiều vi khuẩn phân hủy 2,4-D đã được phân lập từ nhiều vi tri 6 nhiễm khác

nhau như đất nông nghiệp, trầm tích, khu vực xử lý rác thải và đất nguyên thủy

Các vi khuẩn phân hủy 2,4-D được xếp thành 3 nhóm dựa vào enzyme phân hủy

và các đặc tính lý hóa của chúng Nhóm thứ nhất thuộc và y- Proteobacteria

như Achromobacter, Burkholderia, Delffia, Halomonas, Pseudomonas Những vì

khuẩn này có chứa gen ƒ thường năm ở các plasmid và có thê chuyên được từ

vi khuẩn này sang vi khuẩn khác Nhóm thứ hai gồm những vi khuẩn thuộc nhóm a- Proteobacteria nhu Sphingomonas Ching được phân lập từ môi trường có chứa clo Nhóm thứ ba thuộc giống Bradyrhizobium trong lớp a- Proteobacteria Các vi khuẩn này được phân lập từ đất nguyên thủy ở Canada, Hawaii, Chile và một số khu vực khác (Itoh và ctv., 2004; Top va ctv., 1995)

Trong số các vi khuẩn tham gia phân hủy 2,4-D, chủng A/caligenes euftrophus JMP134 là chủng được nghiên cứu khá kỹ về con đường chuyên hóa cũng như các gen mã hóa cho những enzyme tham gia phân hủy 2,4-D Họ gen /# gồm có

6 gen f/ädA, ffdB, tƒdC, tƒđdD, tfdE, tfdF mã hóa cho các enzyme tham gia vào quá

trình phân hủy 2,4-D tạo thành axit succinic (Top va ctv., 1995)

10

2.4 SU TIEP HOP O VI KHUAN

Tiếp hợp là hiện tượng tiếp xúc trực tiếp giữa hai tế bào vi khuẩn và chuyền vật chất di truyền từ tế bào cho sang tế bào nhận Đề tiếp hợp có thể diễn ra, tế bào cho cần có plasmid F (Fertility) hoặc plasmid giới tính Plasmid F có tác dụng

thúc đây việc chuyển gen từ tế bào cho sang tế bào tế bào nhận Các tế bào cho

có mang plasmid F nên gọi là tế bào F”, các tế bào không mang plasmid F goi là

F Khi tiếp hợp, tế bào vi khuẩn F” chuyển plasmid F cho tế bào vi khuẩn E, do

vậy các tế bào vi khuẩn F trở thành tế bào vi khuẩn F” Việc chuyển plasmid F

giữa tế bào vi khuẩn cho và tế bào vi khuẩn nhận diễn ra đồng thời với việc sao chép plasmid này, nhưng không chuyên đi các gen trên nhiễm sắc thể của tế bào cho Plasmid F là một ADN sợi đôi, vòng kín gồm khoảng 100.000 cặp nucleotide (khoảng 1/40 chiều dài của nhiễm sắc thể vi khuẩn) Mỗi tế bào vi khuẩn F chỉ có một bản sao plasmid E, nó sao chép đồng thời với nhiễm sắc thể

của vi khuẩn Đề có thể sao chép được, plasmid F phải gắn vào một điểm đặc biệt

trên tê bào v1 khuân

Plasmid F mang các gen quy định sự hình thành các cấu trúc trên mặt tế bào có

dạng sợi mảnh gọi là lông F Lông này mảnh, mềm và có thê rất dài Các gen

khác trên plasmid F quy định sự hình thành ống tiếp hợp nối tế bào cho và tế bào

nhận để plasmid F có thể chuyền qua ống tiếp hợp Khi ống tiếp hợp hình thành, việc sao chép plasmid F diễn ra độc lập, không phụ thuộc vào nhiễm sắc thể vi khuẩn và một bản sao F chưi qua ống tiếp hợp sang tế bào nhận F và biến nó

thành tế bào vi khuẩn F”,

Ở một số loài vi khuẩn; tế bào vi khuẩn FT có thể sinh ra những tế bào cho có khả

năng chuyến gen trên nhiễm sắc thể với tần số cao Những tế bào này gọi là tế

bào Hfr (High frequency recombination), tức những tế bào có khả năng tái tổ hợp

cao, chúng cũng có những lông F như các tế bào F” Nhưng giữa Hữ và F7 có

một khác biệt rất quan trọng là trong các tế bào Hữ, plasmid F dính vào nhiễm sắc thể vi khuẩn Vì vậy ngoài những biểu hiện của plasmid F giống như các tế

bào F”, các tế bào Hfr có khả năng chuyên đi nhiễm sắc thể của vi khuẩn qua ống tiếp hợp

11

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

CHUYÊN NGÀNH SINH HỌC

Plasmid F dính vào nhiễm sắc thể bằng cơ chế trao đổi chéo đơn Tế bào Hfữ có

thể biến trở lại thành tế bào FÌ mang plasmid F trong té bao chat bang qué trinh

nguoc lai

Plasmid F c6 kha năng dính vào những điểm khác nhau trên nhiễm sắc thể vi

khuẩn và vì vậy trình tự gen chuyển sang tế bào F bởi các tế bào Hữ khác nhau

rất khác nhau Bởi vì khi bắt đầu chuyền từ Hữ sang F thì plasmid F bị tách ra, nên một phần được chuyên đi trước, phần còn lại chính là đuôi của nhiễm sắc thể

của tế bào được chuyển đi sau cùng, nếu quá trình tiếp hợp diễn ra trong những

điều kiện tối ưu và kéo dài đủ 90 phút Nếu không thì cầu tiếp hợp có thể bị đứt

nửa chừng, khi đó chỉ một phần nhiễm sắc thể được chuyển sang F, phần còn lại

cùng với plasmid F vẫn nằm lại trong tế bào Hữr

s* Giao phối giữa tế bào F” và tế bào E7

Hai tế bào vi khuẩn tạo thành ống tiếp hợp và một bản sao của plasmid F được chuyền từ E” sang E Trong quá trình này, một sợi đơn của plasmid F chui qua cầu tiếp hợp và sợi bổ sung với nó được tổng hợp trong tế bào nhận, cuỗi cùng

tạo thành plasmid F có sợi đôi mạch vòng và biến tế bào F thành tế bào F” Vì

plasmid F nhỏ hơn so với nhiễm sắc thể vi khuẩn nên bản sao của nó thường

được chuyển hoàn toàn sang F trước khi hai tế bào rời nhau

s* Giao phối giữa Hfr và E

Tương tự như giao phối giữa E” và F, ống tiếp hợp được hình thành giữa tế bào

vi khuẩn Hữ và F, plasmid E đã dính vào nhiễm sắc thể phân làm đôi, một đầu

chui vào ống tiếp hợp và kéo theo các gen trên nhiễm sắc thể Chỉ có một sợi được chuyển qua, sợi bổ sung được tổng hợp bên tế bào F Nếu tế bào nhận mang những alen khác với những alen được chuyền sang thì các tế bào tái tổ hợp

do trao đổi chéo có thể được phát hiện và nghiên cứu Vì phần còn lại của plasmid F không được chuyển sang tế bào E do toàn bộ nhiễm sắc thể chưa được

chuyên đi hết, nên rất ít F trở thành Hfr Tế bào vi khuẩn chứa nhiễm sắc thể

riêng của nó và một đoạn nhiễm sắc thê của tế bào cho gọi là hợp tử từng phần (merodiploid hoặc merozygote) (Lê Đình Lương, 2009)

12

Ngoài E.coli, các plasmid tiếp hợp cũng hiện diện ở nhiều vi khuẩn Gram âm

khác, cũng như ở nhiều vi khuẩn Gram duong nhu Bacillus, Clostridium,

Nocardia, Staphylococcus, Streptococcus va Streptomyces M6t nhom plasmid từ S.faecalis mang gen tong hop một pheromon giới tính đảm nhiệm chức năng của một tính hiệu giao phối đặc biệt Pheromon giới tính kích thích một chất ngưng kết trong vi khuẩn cho Chất này được coi như chất kết dính giữa tế bào vi khuẩn cho và tê bao vi khuan nhận, dân đên sự kêt vón lại giữa hai tê bào vi khuan

Nhiều plasmid có phô chủ khá hẹp, chỉ có thể sao chép trong các loài rất gần gũi Tuy nhiên, cũng có những plasmid có phổ chủ khá rộng như: RP4, RSF 1010,

pC194 từ §.aureus (Nguyễn Lân Dũng và ctv., 2009)

2.5 MOT SO KY THUAT SINH HOC PHAN TU DA SU DUNG

2.5.1 Box — PCR (rep-PCR)

Trong bộ gen của các vi sinh vật sơ hạch có các đoạn ADN ngăn với trình tự

nucleotide giỗng nhau và hiện diện rãi rác trong bộ gen Chúng có thể có cấu trúc hình vòng, do các nucleotide trong các đoạn này có thê tự liên kết bố sung với nhau nhu: palindromes units (PU), repetitive extragenic palindromes (REP) hoac không có cấu trúc vòng như: intergenic repeat units (IRU), enterobacterial repetitive intergenic consensus (ERIC) Các nghiên cứu gần đây đã phát hiện một đoạn ADN cũng hiện diện rãi rác trong bộ gen vi khuẩn Gram dương được gọi là BOX Các nhân tố BOX cũng có cấu trúc vòng, là các đoạn ADN có trình tự lặp

lại bao gồm 3 thành phần boxA, boxB, boxC với số lượng nucleotide lần lượt là

59, 45 và 50 Mặc dù kích thước, số lượng và cầu trúc của nhân tố BOX tương tự

như REP và ERIC, nhưng trình tự ADN của chúng rất khác nhau Kết quả nghiên

cứu về lai ADN (ADN hydridizaton) và PCR cho thấy các trình tự

oligonucleotide của boxA được bảo tồn ở nhiều loài vi khuẩn khác nhau Vì vậy,

trình tự oligonucleotide của boxA có thể sử dụng để thiết kế các đoạn môi giúp xác định sự khác biệt của các vi sinh vật ở mức độ phân tử (Koeuth và ctv.,

2008)

13