Bộ y tế Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ Tên đề tài: Phát hiện khuyết đoạn gen ở những bệnh nhân loạn dỡng cơ Duchenne bằng phơng pháp Multiplex PCR Chủ nhiệm đề tài : TS.BS Nguyễn Thị Trang Cơ quan chủ trì đề tài : Trờng Đại học y Hà nộ i 6426 17/7/2007 Hà nội - 2006 Bộ y tế Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ Tên đề tài: Phát hiện khuyết đoạn gen ở những bệnh nhân loạn dỡng cơ Duchenne bằng phơng pháp Multiplex PCR Chủ nhiệm đề tài: TS.BS Nguyễn Thị Trang Cơ quan chủ trì đề tài : Trờng Đại học y Hà nội Cấp quản lý đề tài : Bộ y tế Thời gian thực hiện: từ tháng 1/2004 đến tháng 12/2006 Tổng kinh phí thực hiện đề tài: 200 triệu đồng Trong đó: Kinh phí SNKH 200 triệu đồng Nguồn khác không có 1.Tên đề tài: Phát hiện khuyết đoạn gen ở những bệnh nhân loạn dỡng cơ Duchenne bằng phơng pháp Multiplex PCR 2.Chủ nhiệm đề tài: TS.BS Nguyễn Thị Trang 3. Cơ quan chủ trì đề tài: Trờng Đại học y Hà nội 4.Cơ quan quản lý đề tài: Bộ y tế 5. Th ký đề tài: Thạc sĩ. Bác sĩ Lơng Thị Lan Anh 6. Những ngời thực hiện chính: TS.BS Nguyễn Thị Trang Bộ môn Y sinh học-Di truyền ĐHY Hà nội Thạc sĩ. BS Vũ Chí Dũng Khoa Nội tiết-Chuyển hoá-Di truyền BV Nhi TW Cử nhân Nguyễn Thị Phơng Mai La bô Di truyền BV Nhi TW TS.BS Hoàng Hạnh Phúc Khoa Sinh hoá Bệnh viện Nhi trung ơng Thạc sĩ. BS Lơng Thị Lan Anh Bộ môn Y sinh học - Di truyền ĐHY Hà nội PGS. TS Lê Văn Phủng La bô Trung tâm Y sinh họcĐH Y Hà nội 7. Thời gian thực hiện: từ tháng 1/2004-12/2006 Danh mục chữ viết tắt ADN Acid deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic BMD Becker muscular dystrophy (loạn dỡng cơ Becker) bp Base pair (cặp base trong phân tử ADN kép) CK Creatine kinase Carrier Ngời lành mang gen bệnh CMC Chemical mismatch cleavage (Phơng pháp cắt liên kết không tơng xứng hóa học) DMD Duchenne muscular dystrophy (Bệnh loạn dỡng cơ Duchenne) DGGE Denaturing gradient gel electrophoresis (Điện di gel dựa trên gradient) FISH Fluorescent in situ hybridisation (Lai tại chỗ phát hiện bằng chất mầu huỳnh quang) FIGE Field inversion gel electrophoresis (Điện di đảo ngợc) HDA Heteroduplex analysis (Phân tích dị hợp tử kép ) NST Nhiễm sắc thể KN-KT Kháng nguyên- Kháng thể kb kilo base PCR Polymerase chain reaction (kỹ thuật khuyếch đại một đoạn ADN đích xác định nhờ enzym Taq ADN polymerase ) PTT Protein truncation test (Xét nghiệm kiểm tra Protein bị cắt) RFLP Restriction fragment length polymorphism (Phơng pháp phân đoạn giới hạn đa độ dài) RT-PCR Reverse transcription PCR (Phơng pháp phiên mã ngợc) SSCP Single strand conformation polymorphism (Phơng pháp cấu trúc đa hình sợi đơn) TSDT Tiền sử di truyền Mục lục Đặt vấn đề 1 Chơng 1 : Tổng quan 1.1. Đặc điểm di truyền của bệnh DMD 3 1.2. Tần số của bệnh loạn dỡng cơ Duchenne 5 1.3. Cơ sở di truyền phân tử của bệnh DMD 5 1.3.1. Vị trí, cấu trúc và chức năng của gen DMD 5 1.3.2. Cấu trúc và chức năng của Dystrophy 8 1.4. Cơ chế bệnh sinh của DMD 9 1.5. Cơ chế di truyền của bệnh DMD 10 1.5.1. Gen đột biến có sẵn trên NSTX của mẹ 10 1.5.2. Đột biến mới 10 1.5.3. Dạng khảm Soma tại vùng gen Dystrophy 11 1.5.4. Dạng khảm dòng tế bào mầm trong bệnh DMD 12 1.6. Các dạng đột biến cấu trúc của gen dystrophy 13 1.6.1. Đột biến khuyết đoạn gen dystrophy (DMD) 13 1.6.2. Đột biến nhân đoạn trong gen dystrophy (DMD) 15 1.6.3. Đột biến điểm xẩy ra trong gen dystrophy (DMD) 15 1.6.4. Đột biến kiểu chuyển đoạn gây bệnh DMD ở trẻ gái 16 1.7. Các phơng pháp xét nghiệm trong chẩn đoán bệnh DMD 16 1.7.1. Phơng pháp đo hoạt độ creatine kinase trong huyết thanh 16 1.7.2. Phơng pháp thăm dò điện sinh lý cơ(ghi điện cơ) 18 1.7.3. Phơng pháp sinh thiết cơ, chẩn đoán giải phẫu bệnh vi thể trong xác định tổn thơng cơ ở bệnh nhân 18 1.7.4. Phơng pháp miễn dịch huỳnh quang 19 1.7.5. Xét nghiệm ADN 20 1.8. Các phơng pháp phát hiện đột biến gen dystrophy 21 1.8.1. Phát hiện những tổn thơng lớn của gen dystrophy 21 1.8.2. Phát hiện những tổn thơng nhỏ của gen dystrophy ở những bệnh nhân 23 1.8.3. Phát hiện những tổn thơng nhỏ ở những ngời nữ mang gen 26 1.9. Phòng bệnh DMD 26 1.9.1. Phát hiện những trờng hợp DMD 27 1.9.2. Phát hiện đột biến gen ở những bệnh nhân DMD/BMD 27 1.9.3. Phát hiện những ngời lành mang gen bệnh DMD (carriers) 28 1.9.4. Cho lời khuyên di truyền 30 1.9.5. Phơng pháp chẩn đoán trớc sinh và chẩn đoán ADN của phôi trớc khi cấy phôi vào cơ thể 33 1.10. Khả năng điều trị bệnh DMD 35 1.11. Tình hình nghiên cứu bệnh DMD ở trong nớc 37 Chơng 2: Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu 2.1. Đối tợng nghiên cứu 39 2.1.1. Nhóm chứng 39 2.1.2. Nhóm bệnh 39 2.2. Nơi thực hiện 41 2.3. Phơng pháp nghiên cứu 41 2.3.1.Phơng pháp thu thập thông tin từ bệnh nhân và gia đình bệnh nhân 41 2.3.2. Phơng pháp xét nghiệm CK toàn phần trong huyết thanh 42 2.3.3. Phơng pháp lập và phân tích phả hệ 42 2.3.4. Phơng pháp chiết tách ADN từ máu ngoại vi bằng phơng pháp perchlorat sodium 43 2.3.5. Kỹ thuật chiết tách ADN từ máu ngoại vi theo Qiagen kit 46 2.3.6. Phơng pháp multiplex PCR 46 2.3.7. Xử lý số liệu theo phơng pháp thống kê y sinh học 53 Chơng 3. Kết quả 3.1. Kiểm tra kết quả chiết tách ADN ở 10 ngời nam bình thờng theo phơng pháp perchlorat sodium 54 3.1.1. Kiểm tra kết quả tinh khiết của ADN 54 3.1.2. Đo hàm lợng ADN 54 3.2. Nhóm bệnh nhân DMD 56 3.2.1. Giới của bệnh nhân 56 3.2.2. Tiền sử di truyền trong gia đình 56 3.2.3. Tỉ lệ bệnh nhân DMD có đột biến mất đoạn 57 3.2.4. 35 bệnh nhân đợc khảo sát thêm exon 46 63 3.2.5. 30 bệnh nhân đợc khảo sát thêm exon 16, 32, 34, 41, 42, và vùng promotor não(Pb) 63 3.3. Nhóm mẹ, và chị em gái của mẹ bệnh nhân DMD đợc xét nghiệm CK cho t vấn di truyền 64 3.4. Minh hoạ một số hình ảnh kết quả PCR khảo sát những exon trong vùng hay xẩy ra mất đoạn của gen dystrophin ở bệnh nhân DMD 66 3.5. Minh hoạ một số phả hệ phối hợp với xét nghiệm CK và phân tích ADN của một số bệnh nhân 76 3.6. ả nh minh hoạ bệnh nhân DMD 80 Chơng 4 : Bàn luận 4.1. DMD là bệnh phát sinh do cơ chế di truyền và đột biến mới 81 4.2. So sánh các phơng pháp di truyền phân tử phát hiện đột biến mất đoạn gen và tình hình phát hiện đột biến mất đoạn gen ở các nớc 87 4.2.1. So sánh các phơng pháp di truyền phân tử phát hiện đột biến mất đoạn gen 87 4.2.2. So sánh về nghiên cứu mất đoạn gen ở một số nớc trên thế giới 90 4.3. Những bệnh nhân đợc chẩn đoán là DMD nhng cha phát hiện đợc đột biến gen 94 Kết Luận 95 Kiến nghị 96 Tài liệu tham khảo 95 Phụ lục Bản tự đánh giá Về tình hình thực hiện và những đóng góp mới của đề tài khoa học và công nghệ cấp Bộ 1.Tên đề tài: Phát hiện khuyết đoạn gen dystrophin ở những bệnh nhân loạn dỡng cơ Duchenne bằng phơng pháp Multiplex PCR 2.Chủ nhiệm đề tài: TS. BS. Nguyễn Thị Trang 3.Cơ quan chủ trì đề tài: Trờng Đại Học Y Hà Nội 4.Thời gian thực hiện đề tài: Tháng 1 năm 2004 đến tháng 12 năm 2006 5. Tổng kinh phí thực hiện đề tài: 200 triệu đồng Trong đó kinh phí từ NSNN: 200 triệu đồng 6.Tình hình thực hiện đề tài so với đề cơng: Đề tài đ hoàn thành 2 mục tiêu của đề cơng: - Sử dụng phơng pháp Multiplex PCR với 19 cặp mồi để phát hiện khuyết đoạn gen dystrophin ở bệnh nhân loạn dỡng cơ Duchenne. - Bớc đầu tìm hiểu exon nào của gen DMD thờng xẩy ra khuyết đoạn 6.1. Về mức độ hoàn thành khối lợng công việc: -Về số lợng mẫu: theo đề cơng đề ra là chiết tách ADN tổng số của ngời nam bình thờng làm chứng(+) và chiết tách ADN của 60 bệnh nhân DMD và thực hiện phản ứng Multiplex PCR với 18 cặp mồi để phát hiện đột biến mất đoạn gen ở những bệnh nhân DMD. - Đề tài đã thực hiện chiết tách ADN của ngời nam bình thờng làm chứng(+) và 62 bệnh nhân DMD, đã thực hiện phản ứng Multiplex PCR với 19 cặp mồi để khảo sát 18 exon của gen dystrophin và vùng promotor cơ, đã điện di sản phẩm PCR trên gel agarose, chụp gel và đọc kết quả PCR cho từng bệnh nhân. - Xử lý số liệu và phân tích kết quả. -Viết báo cáo nghiệm thu đề tài. [...]... lựa chọn giải pháp công nghệ đúng để giải quyết phát hiện đột biến mất đoạn gen là loại đột biến phổ cập nhất gây bệnh DMD 7.2 Về phơng pháp nghiên cứu Kỹ thuật Multiplex PCR đã hoàn toàn thực hiện đợc trong điều kiện Việt Nam để phục vụ phát hiện đột biến mất đoạn gen dystrophin cho bệnh nhân DMD 7.3 Những đóng góp mới khác Đã phát hiện tỉ lệ đột biến mất đoạn gen dystrophin ở những bệnh nhân DMD là... cho những bệnh nhân khác ở Argentina [33][38][61][63][64][83] Theo Albena Todorova năm 1996 đã thực hiện phân tích đột biến lần đầu tiên ở Bulgaria trong 84 bệnh nhân DMD và BMD không có quan hệ họ hàng Tác giả nhận thấy những khuyết đoạn trong gen đợc phát hiện trong 67,8% những bệnh nhân Những điểm đứt khuyết đoạn rơi vào vùng hay xẩy ra khuyết đoạn, quanh intron 44 và đa số (>54%) những khuyết đoạn. .. thực hiện kỹ thuật multiplex PCR trong điều kiện Việt nam để phục vụ phát hiện đột biến mất đoạn gen dystrophin cho bệnh nhân DMD Đã phát hiện tỉ lệ đột biến mất đoạn gen dystrophy ở những bệnh nhân DMD Việt nam là 51,6% để thông tin t vấn cho gia đình bệnh nhân Đã nêu ra đợc tỉ lệ đột biến mất đoạn ở nhóm bệnh nhân DMD TSDT rõ là 52,9% và nhóm TSDT không rõ là 51% Đã nêu ra đợc phân bố đột biến mất đoạn. .. điểm cũng nh nhân đoạn, thêm đoạn hiếm xẩy ra hơn so với kiểu đột biến mất đoạn trong gen Dystrophy Roest PA năm 1996 đã sử dụng phơng pháp phát hiện đột biến dựa trên ARN để sàng lọc toàn bộ vùng mã hoá của gen dystrophy ở 1 bệnh nhân DMD và 1 bệnh nhân BMD mà ở những ngời này, những phơng pháp phát hiện đột biến dựa trên ADN đã không phát hiện đợc trong cả 2 trờng hợp Bằng phơng pháp RT -PCR và PTT... thấy có 60-65% những bệnh nhân DMD là do khuyết đoạn, còn lại 35-40% là do đột biến điểm, thêm đoạn, nhân đoạn [153] Theo Behrman có khoảng 65% những bệnh nhân DMD là do khuyết đoạn, 2-7% là do nhân đoạn [35] Trong cả hai DMD và BMD những khuyết đoạn ADN và nhân đoạn ADN tập trung thành từng đám trong 2 điểm nóng, một ở sát gần đầu tận cùng 5 của gen và bao gồm những exons 2-20 (30%) và một ở cách xa hơn,... biến nhân đoạn trong gen Dystrophy chiếm một tỉ lệ rất nhỏ khoảng 2-7% [27] [35] Theo Albena khi nghiên cứu đột biến ở gen Dystrophy của 84 bệnh nhân DMD và BMD không có liên quan họ hàng đã gặp 57 bệnh nhân DMD là do khuyết đoạn (67,8%) và 2 bệnh nhân DMD là do nhân đoạn (2,4 %) Một bệnh nhân nhân đoạn xẩy ra từ (exon 2-32), một bệnh nhân nhân đoạn thuộc vùng exon 50 1.63 Đột biến điểm xẩy ra trong gen. .. những khuyết đoạn ở những bệnh nhân DMD/BMD ở Argentina so với những số liệu đợc báo cáo ở những quần thể khác [33] Có một tỉ lệ cao những khuyết đoạn đợc quan sát ở những trờng hợp bệnh DMD mang tính gia đình chiếm 40% nhiều hơn là những trờng hợp DMD trong gia đình chỉ có một con duy nhất bị bệnh( 30%) Hiệu quả của khuyết đoạn trên khung đọc thống nhất với kiểu hình ở hầu hết tất cả những bệnh nhân đợc... bố) - Đã công bố 3 bài báo: + Phát hiện đột biến mất đoạn gen dystrophin ở một số bệnh nhân loạn dỡng cơ Duchenne bằng phơng pháp multiplex PCR- Báo cáo khoa học hội nghị toàn quốc, đăng trong tuyển tập những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống 3/11/2005, tr 1435-1437 + Phát hiện đột biến mất đoạn exon 46 và 51 gen dystrophin ở một số bệnh nhân DMD bằng kỹ thuật PCR Tạp chí nghiên cứu y học,... mất đoạn của gen dystrophy Trong điều kiện Việt Nam, thật cần thiết u tiên phát triển kỹ thuật Multiplex PCR phát hiện đột biến mất đoạn gen, để biết đột biến mất đoạn hay xẩy ra ở những exon nào, từ đó lựa chọn những cặp mồi nào phù hợp để tăng khả năng phát hiện đột biến mất đoạn gen, giúp cho t vấn di truyền và đặt cơ sở cho chẩn đoán trớc sinh ở những gia đình với những đột biến đã biết Xuất phát. .. thờng, đã chỉ rõ mất đoạn exon trên hình ảnh điện di sản phẩm PCR của bệnh nhân DMD -Qua đọc kết quả PCR của những bệnh nhân DMD chúng tôi đã phân tích xử lý số liệu và thu đợc những kết quả sau: + Thực hiện phản ứng PCR với 19 cặp mồi để khảo sát 18 exon và vùng promotor cơ của gen dystrophin ở 62 bệnh nhân DMD và đã phát hiện tỉ lệ đột biến mất đoạn gen là 51,6% + Trong 62 bệnh nhân DMD của 60 gia . thực hiện và những đóng góp mới của đề tài khoa học và công nghệ cấp Bộ 1.Tên đề tài: Phát hiện khuyết đoạn gen dystrophin ở những bệnh nhân loạn dỡng cơ Duchenne bằng phơng pháp Multiplex. bộ Tên đề tài: Phát hiện khuyết đoạn gen ở những bệnh nhân loạn dỡng cơ Duchenne bằng phơng pháp Multiplex PCR Chủ nhiệm đề tài: TS.BS Nguyễn Thị Trang Cơ quan chủ trì đề tài :. 1.Tên đề tài: Phát hiện khuyết đoạn gen ở những bệnh nhân loạn dỡng cơ Duchenne bằng phơng pháp Multiplex PCR 2.Chủ nhiệm đề tài: TS.BS Nguyễn Thị Trang 3. Cơ quan chủ trì đề tài: