Nghiên cứu đặc điểm một số gen điều hoà sinh tổng hợp anthocyanin liên quan đến tính chịu hạn của cây ngô nếp địa phương
1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN –––––––––––––––––– PHẠM THỊ THANH NHÀN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM MỘT SỐ GEN ĐIỀU HÒA SINH TỔNG HỢP ANTHOCYANIN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY NGÔ NẾP ĐỊA PHƢƠNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2014 2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN –––––––––––––––––– PHẠM THỊ THANH NHÀN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM MỘT SỐ GEN ĐIỀU HÒA SINH TỔNG HỢP ANTHOCYANIN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY NGÔ NẾP ĐỊA PHƢƠNG Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 01 21 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: GS.TS. LÊ TRẦN BÌNH THÁI NGUYÊN - 2014 3 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cộng tác với các tác giả khác. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận án là trung thực, một phần đã đƣợc đăng trên các Tạp chí khoa học chuyên ngành, trong Kỷ yếu hội nghị Công nghệ sinh học và trên GenBank, với sự đồng ý cho phép của các đồng tác giả. Phần kết quả còn lại chƣa đƣợc ai công bố. Tác giả NCS. Phạm Thị Thanh Nhàn 4 LỜI CẢM ƠN Tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Lê Trần Bình đã tận tình hƣớng dẫn, tạo điều kiện giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thiện luận án. Tôi xin đƣợc trân trọng cảm ơn tập thể cán bộ, đặc biệt là PGS.TS Chu Hoàng Hà, TS. Lê Văn Sơn, ThS. Hoàng Hà và ThS. Lê Hoàng Đức thuộc Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen thuộc Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện tốt nhất, hƣớng dẫn kỹ thuật thí nghiệm và góp ý chuyên môn để tôi hoàn thành đƣợc đề tài này. Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ của các đồng tác giả. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa Sinh- Kỹ thuật nông nghiệp, Trƣờng Đại học Sƣ phạm- Đại học Thái Nguyên, cùng các cán bộ trong khoa đã tạo điều kiện, động viên tôi trong học tập và hoàn thiện luận án, đặc biệt là sự giúp đỡ của các Thầy, Cô trong Bộ môn Di truyền- SHHĐ nhƣ GS.TS Chu Hoàng Mậu, PGS.TS Nguyễn Thị Tâm, CN Nguyễn Thị Hồng Chuyên (Phòng thí nghiệm Hóa Sinh), CN Nguyễn Ích Chiến (Phòng thí nghiệm Di truyền & Công nghệ gen). Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Trƣờng, Phòng Quản lý đào tạo Sau Đại học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành đề tài này. Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban lãnh đạo cùng các cán bộ của Viện Nghiên cứu Ngô Đan Phƣợng- Hà Nội đã tạo điều kiện cung cấp các giống ngô nếp địa phƣơng và những thông tin cơ bản về giống. Cuối cùng, tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã đồng hành, chia sẻ cùng tôi, khuyến khích tôi hoàn thành luận án Tiến sĩ này. Thái Nguyên, tháng 10 năm 2014 Nghiên cứu sinh Phạm Thị Thanh Nhàn i MỤC LỤC Trang Mục lục i Danh mục các kí hiệu và chữ viết tắt iv Danh mục các bảng vii Danh mục các hình ix MỞ ĐẦU 1 1. Đặt vấn đề 1 2. Mục tiêu của đề tài 2 3. Nội dung nghiên cứu 3 4. Những đóng góp mới của luận án 3 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 1.1. Cây ngô 5 1.1.1. Sơ lƣợc về cây ngô 5 1.1.2. Giá trị dinh dƣỡng và kinh tế của ngô 7 1.1.3. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và Việt Nam …… 8 1.2. Phản ứng của cây ngô trƣớc tác động của hạn 10 1.2.1. Mối liên quan giữa tác động của hạn và tính chống chịu stress ôxy hóa 10 1.2.1.1. Mối liên quan giữa hạn và stress oxy hóa 10 1.2.1.2. Các dạng oxy hoạt hóa 12 1.2.1.3. Hệ thống bảo vệ cây trồng khỏi tác động của oxy hóa 13 1.2.2. Cơ sở sinh lý, sinh hoá và sinh học phân tử của tính chịu hạn ở cây ngô. 14 1.2.2.1. Cơ sở hình thái, sinh lý, hóa sinh của tính chịu hạn 14 1.2.2.2. Cơ sở sinh học phân tử của tính chịu hạn ở cây ngô 17 1.3. Anthocyanin và vai trò chuyển hóa các dạng oxy hoạt hóa 20 1.3.1. Vai trò của anthocyanin khi thực vật bị hạn 20 1.3.2. Gen điều hoà tổng hợp anthocyanin ở cây ngô … 27 1.3.2.1. Nhân tố phiên mã và điều hòa biểu hiện gen 27 1.3.2.2. Nhân tố phiên mã tham gia quá trình tổng hợp anthocyanin 30 ii 1.4. Ứng dụng real- time PCR nghiên cứu mức độ biểu hiện gen tham gia sinh tổng hợp anthocyanin 34 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 2.1. Vật liệu nghiên cứu 40 2.2. Địa điểm nghiên cứu, hoá chất và thiết bị 40 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 41 2.3.1. Nhóm phƣơng pháp hoá sinh 41 2.3.2. Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn của một số giống ngô địa phƣơng 45 2.3.3. Nhóm phƣơng pháp sinh học phân tử ……………………………… 47 2.3.3.1. Phƣơng pháp tách RNA tổng số theo kit Trizol (Invitrogen) 47 2.3.3.2. Phƣơng pháp RT- PCR ……………………………………… 47 2.3.3.3. Tạo vector tái tổ hơp ………………………………………… 49 2.3.3.4. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến chủng E.coli DH5 49 2.3.3.5. Kiểm tra sản phẩm chọn dòng ………………………………… 49 2.3.3.6. Tách plasmid …………………………………… 49 2.3.3.7. Xác định trình tự gen …………………………………… 51 2.3.3.8. Phƣơng pháp real- time PCR 51 2.3.4. Phƣơng pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu 53 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN………………………………… 54 3.1. Đánh giá khả năng chịu hạn của 10 giống ngô nếp địa phƣơng 54 3.1.1. Khả năng chịu hạn của 10 giống ngô nếp địa phƣơng giai đoạn hạt nảy mầm 54 3.1.1.1. Ảnh hƣởng của hạn đến hàm lƣợng đƣờng và hoạt độ - amylase 54 3.1.1.2. Ảnh hƣởng của hạn đến sự biến đổi hoạt độ protease 57 3.1.2. Đánh giá khả năng chịu hạn của 10 giống ngô giai đoạn cây non 3 lá 58 3.1.2.1. Tỷ lệ thiệt hại của 10 giống ngô khi bị hạn ……………………… 58 3.1.2.2. Chỉ số chịu hạn tƣơng đối của kiểu gen 10 giống ngô trong điều kiện hạn nhân tạo 61 3.1.3. Phân nhóm 10 giống ngô nếp nghiên cứu theo mức độ chịu hạn 63 3.2. Ảnh hƣởng của hạn nhân tạo đến lƣợng anthocyanin ở cây ngô nếp iii địa phƣơng 65 3.2.1. Sự biến đổi hàm lƣợng anthocyanin trong rễ của 10 giống ngô qua các ngƣỡng xử lý bởi hạn nhân tạo 65 3.2.2. Sự biến đổi hàm lƣợng anthocyanin trong lá của 10 giống ngô qua các ngƣỡng xử lý bởi hạn nhân tạo 67 3.2.3. Sự biến đổi hàm lƣợng anthocyanin trong thân mầm và bẹ lá của 10 giống ngô qua các ngƣỡng xử lý bởi hạn nhân tạo 70 3.2.4. Sự biến đổi hàm lƣợng anthocyanin trong thân và bẹ lá cây ngô qua các ngƣỡng xử lý bởi hạn nhân tạo so với đối chứng 73 3.3. Phân tích trình tự đoạn gen B, Lc ở giống NH và BS1 78 3.3.1. Đặc điểm trình tự đoạn gen B của giống NH và BS1 78 3.3.2. Đặc điểm trình tự đoạn gen Lc của giống NH và BS1 85 3.3.3. Đặc điểm cấu trúc protein thuộc họ bHLH ở cây ngô 91 3.4. Định lƣợng mức độ biểu hiện của gen B và Lc bằng phản ứng real- time PCR 93 3.4.1. Định lƣợng mức độ biểu hiện của gen B giai đoạn cây con 93 3.4.2. Định lƣợng mức độ biểu hiện của gen Lc giai đoạn cây con 97 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 103 Kết luận ………………………………………………………… 103 Đề nghị………………………………………………… 103 CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN LUẬN ÁN 104 TÀI LIỆU THAM KHẢO ……………………………………………… 105 PHỤ LỤC 1 127 PHỤ LỤC 2 128 PHỤ LỤC 3 131 PHỤ LỤC 4 132 iv NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt ABA Abscisic acid Axit abscisic ANR Anthocyanidin reductase Enzyme chuyển hóa flavan-3-ol ANS Anthocyanidin synthase Enzyme chuyển hóa tạo anthocyanidin APX Ascorbate peroxidase Enzyme chuyển hoá H 2 O 2 thành H 2 O bHLH Binding helix- loop- helix Protein họ bHLH Bp Base pair Cặp bazơ nitơ C1 Colored aleurone 1 Gen C1 cDNA Complementary DNA DNA sợi đôi đƣợc tổng hợp từ mRNA nhờ enzyme phiên mã ngƣợc CHI Chalcon isomerase Enzyme chuyển hóa chalcon CHP Cây hồi phục CHS Chalcone synthase Enzyme xúc tác tổng hợp chalcon CSCHTĐ Chỉ số chịu hạn tƣơng đối CKH Cây không héo DEPC Diethyl pyrocarbonate Chất ức chế enzyme phân hu ̉ y RNA DFR Dihydroflavonol 4 reductase Enzyme chuyển hóa tạo leucoanthocyanidin DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic (ADN) DNase Deoxyribonuclease Enzyme thủy phân liên kết photphodieste của phân tử DNA DRE Dehydration responsive element Yếu tố đáp ứng với hydrat hóa ĐC Đối chứng v %ĐC % so với đối chứng F3‟H Flavonoid 3‟ hydroxylase Enzyme chuyển hóa naringenin F3‟5‟H Flavonoid 3‟,5‟ hydroxylase Enzyme chuyển hóa naringenin HBV Hepatitis B virus Virus viêm gan B HCV Hepatitis C virus Virus viêm gan C HP Hồi phục KLK Khối lƣợng khô KLT Khối lƣợng tƣơi KNGN Khả năng giữ nƣớc LAR Leucoanthocyanidin reductase Enzyme xúc tác tổng hợp flavan-3- ols LEA Late embryo abundant protein trong giai đoạn muộn của quá trình hình thành phôi Lc (LC) Leaf colour Gen Lc mRNA Messenger RNA ARN thông tin MGPT chaperon Môi giới phân tử MW Molecular weight Khối lƣợng phân tử NADP Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate Coenzym đƣợc sử dụng trong phản ứng đồng hóa NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase Chất đƣợc tạo nên khi khƣ ̉ NADP PAL Phenylalanine ammonialyase Enzyme chuyển hóa L-phenylalanine Pl Purple Gen Pl Pr1 Red aleurone 1 Protein chuyên trách tổng hợp pelargonidin tạo Aleurone màu đỏ PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic (ARN) vi RT- PCR Reverse transcription- polymerase chain reaction Phản ứng khuếch đại cDNA từ mRNA nhờ enzyme phiên mã ngƣợc ROS Reactive oxygen species Các dạng oxy hoạt hóa SOD Superoxide dismutase Enzyme xúc tác phản ứng loại bỏ superoxide SNP Single nucleotide polymorphism Đa hình nucleotit đơn TFs Transcription factors Các nhân tố phiên mã, hay yếu tố phiên mã 3GT Flavonoid 3‟ glucosyltransferase Enzyme xúc tác phản ứng tạo flavonol 3-O-beta-D-glucoside UFGT flavonoid 3-O- glucosyltransferase Enzyme xúc tác phản ứng O- glycosyl hóa [...]... Nghiên cứu đặc điểm một số gen điều hoà sinh tổng hợp anthocyanin liên quan đến tính chịu hạn của cây ngô nếp địa phƣơng” 2 Mục tiêu của đề tài Xác định đƣợc mối tƣơng quan giữa anthocyanin và khả năng chịu hạn của cây ngô nếp địa phƣơng Xác định và phân lập đƣợc một số gen điều hòa (gen TF) quan trọng liên quan đến sinh tổng hợp anthocyanin ở cây ngô nếp địa phƣơng Đánh giá đƣợc mức độ phiên mã của. .. hai gen điều hòa (nhân tố phiên mã) B và Lc thuộc họ bHLH tham gia sinh tổng hợp anthocyanin ở cây ngô nếp địa phƣơng bị hạn - Tìm hiểu đƣợc cơ sở sinh học phân tử của khả năng chịu hạn ở cây ngô nếp địa phƣơng thông qua so sánh mức độ biểu hiện của gen điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin Ý nghĩa thực tiễn - Kết đánh giá khả năng chịu hạn của cây ngô nếp địa phƣơng giai đoạn hạt nảy mầm và cây non đƣợc... mức độ phiên mã của gen điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin của ngô nếp địa phƣơng trong điều kiện hạn 3 Những mục tiêu trên nhằm định hƣớng ứng dụng trong tuyển chọn và bảo tồn giống ngô nếp có chất lƣợng và khả năng chịu hạn cao 3 - Nội dung nghiên cứu Đánh giá khả năng chịu hạn của các giống ngô nghiên cứu giai đoạn hạt nảy mầm và cây con thông qua một số chỉ tiêu sinh lý, hoá sinh (hàm lƣợng đƣờng,... carbocyl tự do, hạn chế sự chuyển hóa thành các gốc tự do khác Carotenoid và flavonoid còn nhận năng lƣợng ánh sáng, hạn chế tác động của ánh sáng và các gốc tự do sinh ra trong quá trình quang hợp 1.2.2 Cơ sở sinh lý, sinh hóa và sinh học phân tử của tính chịu hạn ở ngô 1.2.2.1 Cơ sở hình thái, sinh lý, hóa sinh của tính chịu hạn Cơ chế chống chịu hạn ở thực vật rất phức tạp liên quan đến các đặc điểm hình... amylase, chỉ số chịu hạn tƣơng đối ) Phân nhóm các giống ngô theo mức độ chịu hạn - Xác định mối tƣơng quan giữa sự biến đổi hàm lƣợng anthocyanin và khả năng chịu hạn của ngô nếp địa phƣơng ở giai đoạn cây con - Phân lập đoạn gen B và Lc điều hòa hoạt động của nhóm gen cấu trúc mã hoá enzyme chuyển hóa tổng hợp sắc tố anthocyanin ở đại diện thuộc nhóm chịu hạn tốt và kém trong điều kiện hạn - Sử dụng... chịu hạn của cây ngô trên đồng ruộng [18]; đánh giá khả năng chịu hạn của cây ngô non trong điều kiện hạn nhân tạo [13], [24]; phân lập gen dehydrin dhn1/rab17 từ DNA hệ gen [9]; nghiên cứu chọn tạo dòng thuần ngô bằng phƣơng pháp nuôi cấy hạt phấn [5], [21]; nghiên cứu hệ thống tái sinh phục vụ chuyển gen ở ngô [19] Hiện nay trên thế giới cũng đã và đang tiến hành một hƣớng nghiên cứu về sắc tố anthocyanin. .. cho tế bào, ngăn chặn sự xâm nhập của ion Na+, tƣơng tác với protein màng và lipit màng, ngăn chặn sự phá huỷ của màng và các phức protein khác [106] Các kết quả nghiên cứu đều cho thấy khi cây trồng gặp hạn, cây giảm tổng hợp protein và tăng tổng hợp proline Sự thay đổi về một số axit amin, đặc biệt là proline có liên quan đến tính chịu hạn của ngô Kết quả nghiên cứu của Yamada và cộng sự (2005) cho... độ biểu hiện của gen B và Lc ở giai đoạn phiên mã của đại diện thuộc nhóm chịu hạn tốt và kém trong điều kiện hạn 4 - Những đóng góp mới của luận án Xác định đƣợc mức độ tƣơng quan giữa hàm lƣợng anthocyanin với khả năng chịu hạn của cây ngô nếp địa phƣơng, và hàm lƣợng anthocyanin đƣợc coi là một trong những chỉ thị sinh hóa hóa phục vụ chọn lọc giống ngô chịu hạn - Phân lập đƣợc 02 đoạn gen B và Lc... tổng hợp protein, nhƣng nếu hạn kéo dài sẽ xảy ra hiện tƣợng thuỷ phân protein [147], [161] Quá trình thuỷ phân các hydratcacbon dự trữ cũng là nguồn cung cấp chất tan cho quá trình điều chỉnh áp suất thẩm thấu [184] Hạn là yếu tố phổ biến làm giảm năng suất cây trồng nói chung Hiện nay trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu về tính chịu hạn của cây ngô Tính chịu hạn của cây ngô có liên quan. .. mã điều hòa quá trình sinh tổng hợp anthocyanin - Bƣớc đầu xác định đƣợc mức độ phiên mã của 02 gen B và Lc là một trong các chỉ thị ở mức độ phân tử cho khả năng chịu hạn giai đoạn cây ngô non 5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn Ý nghĩa khoa học - Kết quả nghiên cứu của luận án cung cấp những dẫn liệu khoa học về vai 4 trò của anthocyanin khi cây ngô nếp địa phƣơng bị hạn - Cung cấp thông tin về hai gen . tài Nghiên cứu đặc điểm một số gen điều hoà sinh tổng hợp anthocyanin liên quan đến tính chịu hạn của cây ngô nếp địa phƣơng”. 2. Mục tiêu của đề tài Xác định đƣợc mối tƣơng quan giữa anthocyanin. THỊ THANH NHÀN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM MỘT SỐ GEN ĐIỀU HÒA SINH TỔNG HỢP ANTHOCYANIN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY NGÔ NẾP ĐỊA PHƢƠNG Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 01 21 . THỊ THANH NHÀN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM MỘT SỐ GEN ĐIỀU HÒA SINH TỔNG HỢP ANTHOCYANIN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY NGÔ NẾP ĐỊA PHƢƠNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC