Phân tích đặc điểm cấu trúc của sulfate polysaccharide (carrageenan) từ loài rong đỏ Betaphycus gelatinus.

Phân tích đặc điểm cấu trúc của sulfate polysaccharide (carrageenan) từ loài rong đỏ Betaphycus gelatinus.Phân tích đặc điểm cấu trúc của sulfate polysaccharide (carrageenan) từ loài rong đỏ Betaphycus gelatinus.Phân tích đặc điểm cấu trúc của sulfate polysaccharide (carrageenan) từ loài rong đỏ Betaphycus gelatinus.Phân tích đặc điểm cấu trúc của sulfate polysaccharide (carrageenan) từ loài rong đỏ Betaphycus gelatinus.Phân tích đặc điểm cấu trúc của sulfate polysaccharide (carrageenan) từ loài rong đỏ Betaphycus gelatinus.Phân tích đặc điểm cấu trúc của sulfate polysaccharide (carrageenan) từ loài rong đỏ Betaphycus gelatinus.Phân tích đặc điểm cấu trúc của sulfate polysaccharide (carrageenan) từ loài rong đỏ Betaphycus gelatinus.Phân tích đặc điểm cấu trúc của sulfate polysaccharide (carrageenan) từ loài rong đỏ Betaphycus gelatinus.Phân tích đặc điểm cấu trúc của sulfate polysaccharide (carrageenan) từ loài rong đỏ Betaphycus gelatinus.Phân tích đặc điểm cấu trúc của sulfate polysaccharide (carrageenan) từ loài rong đỏ Betaphycus gelatinus.Phân tích đặc điểm cấu trúc của sulfate polysaccharide (carrageenan) từ loài rong đỏ Betaphycus gelatinus.Phân tích đặc điểm cấu trúc của sulfate polysaccharide (carrageenan) từ loài rong đỏ Betaphycus gelatinus.Phân tích đặc điểm cấu trúc của sulfate polysaccharide (carrageenan) từ loài rong đỏ Betaphycus gelatinus.Phân tích đặc điểm cấu trúc của sulfate polysaccharide (carrageenan) từ loài rong đỏ Betaphycus gelatinus.Phân tích đặc điểm cấu trúc của sulfate polysaccharide (carrageenan) từ loài rong đỏ Betaphycus gelatinus.

TỔNG QUAN

TỔNG QUAN VỀ RONG BIỂN

1.1.1 Giới thiệu và phân loại rong biển

Rong biển là thực vật thủy sinh bậc thấp đa dạng về kích thước và hình dạng, sống ở biển, có thể đơn bào hoặc đa bào, thường mọc trên rạn san hô, vách đá hoặc dưới tầng nước sâu với ánh sáng mặt trời Chúng đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái biển, cung cấp nơi sống và nguồn thức ăn cho nhiều loài sinh vật, đặc biệt là trong giai đoạn cây non Rong biển cũng có giá trị lớn đối với con người, được sử dụng làm nguyên liệu trong ngành công nghiệp chế biến, thực phẩm và thuốc chữa bệnh.

Rong biển là nguồn thực phẩm giàu dinh dưỡng, cung cấp nhiều chất chống oxy hóa, chất bột đường, protein, chất xơ, khoáng chất và các nguyên tố vi lượng Ngoài ra, rong biển còn chứa một lượng nhỏ các chất dinh dưỡng quan trọng như omega-3, omega-6, cùng với các vitamin A, B, C và E, tạo nên món quà quý giá từ thiên nhiên cho sức khỏe con người.

Trên toàn cầu, các nhà khoa học đã phát hiện khoảng 10.000 loài rong biển, được phân chia thành 3 nhóm chính dựa trên màu sắc và giá trị kinh tế, bao gồm rong đỏ với khoảng 6.500 loài, rong nâu với khoảng 1.800 loài và rong lục với khoảng 1.500 loài.

Tại Việt Nam đã xác định được khoảng 827 loài rong biển thuộc 4 ngành Trong đó, ngành rong đỏ chiếm hơn 412 loại, ngành rong lục chiếm

Trong tổng số 180 loại rong nâu, có hơn 147 loại và gần 88 loại rong lam được ghi nhận (bảng 1.1) Trong số này, 310 loài phân bố chủ yếu ở vùng ven biển các tỉnh phía Bắc, trong khi 484 loài hiện diện tại các tỉnh phía Nam, và 156 loài phân bố ở cả hai vùng.

Bảng 1.1 Tổng số taxon rong biển Việt Nam [22]

Số lượng và tỉ lệ(%)

Nguồn: Nguyen Van Tu, et al [22]

Rong biển được phân loại thành nhiều ngành khác nhau dựa trên thành phần cấu tạo, sắc tố, hình thái và đặc điểm sinh sản Tại vùng biển Việt Nam, có gần 800 loài rong biển được phát hiện, và các nhà khoa học Việt Nam đã đồng thuận phân loại chúng thành 3 ngành chính có giá trị kinh tế cao trong hệ thống phân loại 10 ngành của Gollerbakh năm 1977.

Rong nâu là một loài rong biển lớn, bao gồm bốn chi chính: Sargassum, Turbinaria, Dictyota và Padina Chúng phân bố rộng rãi và thường chiếm ưu thế ở các bãi triều ven biển thuộc vùng biển nhiệt đới và cận nhiệt đới.

Rong nâu phân bố nhiều nhất ở Nhật Bản, tiếp đến là Canada, Việt Nam, Hàn Quốc, Alaska, Ireland, Mỹ, Pháp, Ấn Độ… Trong đó, hai chi

Sargassum và Turbinaria, hai loài rong biển thuộc họ Sargassaceae trong bộ Fucales, là những đối tượng phổ biến và có giá trị kinh tế cao Trung Quốc dẫn đầu về sản lượng rong nâu toàn cầu, tiếp theo là Hàn Quốc, Nhật Bản, Na Uy và Chile.

Hình 1.1 Hình ảnh về một số loài rong nâu [26].

Rong lục là một loại rong biển nhỏ, tương tự như rong đỏ, bao gồm cả loài đơn bào và đa bào Trên thế giới, rong lục chủ yếu phân bố tại Philippines, tiếp theo là Hàn Quốc, Indonesia, Nhật Bản và ít hơn ở Việt Nam, với các loài tiêu biểu như Ulva reticulata và Ulva lactuca.

Caulerpa racemosa, … Ngoài ra, rong lục còn phân bố rải rác ở các nước:

Canada, Chile, Pháp, Israel, Italy, Malaysia, Achentina, Bangladesh…[21, 27].

Hình 1.2 Hình ảnh về một số loài rong lục [28].

Rong đỏ (hay tảo đỏ): Là những sinh vật quang tự dưỡng thuộc ngành Rhodophyta [29], có kích thước nhỏ hơn rong nâu, thường dài không quá

50cm nhưng một số loài có thể đạt 2m [30].

Rong đỏ phân bố nhiều ở Việt Nam, Nhật Bản, Hàn Quốc, Chile, Indonesia, Philippines tiếp đến là Thái Lan, Brazil, Pháp, Trung Quốc, Hawaii, Ấn Độ, Anh, Mỹ …

Hiện nay trên thế giới đã phân loại được gần 6500 loài rong đỏ, khoảng

800 chi, thuộc nhiều họ khác nhau Tại vùng biển Việt Nam ngành rong đỏ

Rhodophyta có khoảng 412 loài [22, 31] Từ rong biển có thể tách các polysaccharide như: carrageenan, acid alginic, agar,… Các loài rong đỏ được chia làm ba nhóm chính [22, 32, 33]:

- Nhóm rong cho Agar (Agarophyte): bao gồm các chi, các loài như: Gelidium, Graccilaria, Acanthopeltis, Gelidiella,

- Nhóm Gelans: nhóm rong này dùng để sản xuất Furcellaran, điển hình của nhóm rong này là Furcellaria.

- Nhóm rong cho Carrageenan (Carrageenophyte): bao gồm các chi, các loài như: Gigartina, Eucheuma, Chondrus, Iridaea, Chondruscripus,

(Endl.) Boerg Gymnogongrus flabellifotmis Harv

Liagora sp1 Liagora sp2 Grateloupia lithophila

Hình 1.3 Hình ảnh về một số loài rong đỏ [34]

1.1.2 Thành phần hóa học có trong rong biển

Vào năm 2005, Huỳnh Quang Năng, Bùi Minh Lí và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học và cấu trúc của carrageenan từ các loài rong biển Kappaphycus alvarezii, Kappaphycus striatum và Eucheuma denticulatum, được di nhập từ Philippines.

Bảng 1.2 Thành phần hóa học của một số loài rong trong 3 ngành rong chính (Tỉ lệ tính trên 100g rong tươi) [25]

Ngành rong Nâu Nâu Nâu Đỏ Đỏ Đỏ Lục

Tannin 2 - 10 0,1 0,5 - 6,0 nd nd nd Nd

Iod 0,01 - 0,1 0,3 - 1,1 0,05 0,01 - 0,1 0,0005 nd Nd nd: Không phát hiện thấy

Rong biển chứa nhiều thành phần hoá học quý giá về dinh dưỡng và dược liệu, bao gồm polysaccharide, carotenoid, protein, lipid, hợp chất phenolic, acid amin, acid béo không bão hòa, vitamin, peptide, khoáng chất, hợp chất chứa iod, laminaran và alginate Trong đó, polysaccharide là thành phần chính, được xem là nguồn carbohydrate phong phú của rong biển, có giá trị kinh tế cao và thu hút sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học trong lĩnh vực y học.

1.1.3 Sulfate polysaccharide từ rong biển

Polysaccharide là các hợp chất cao phân tử được hình thành từ nhiều đơn vị monosaccharide liên kết với nhau qua liên kết glycoside Chúng được chiết xuất từ thực vật và ứng dụng rộng rãi trong công nghệ thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm, với các ví dụ như agar, pectin, lectin và carrageenan Gần đây, rong biển đã thu hút sự chú ý của các nhà nghiên cứu, đóng góp vào việc khai thác tiềm năng phong phú của rong biển tại Việt Nam.

GIỚI THIỆU VỀ CÂY RONG BETAPHYCUS GELATINUS

Hình 1.4 Rong Betaphycus gelatinus ở Ninh Thuận [35].

Tên tiếng Việt: Rong hồng vân

Tên La Tinh: Fucus gelatinus Esper1800

Betaphycus gelatinus (Esper) Doty ex P.C.Silva 1996

Rong B.gelatinus được định danh theo khóa phân loại như sau:

Giới Plantae Ngành Rhodophyta Lớp Florideophyceae

Họ Rong kỳ lân Solieriaceae Chi Betaphycus

TỔNG QUAN VỀ CARRAGEENAN

Carrageenan là một thành phần được chiết xuất từ các loài rong biển thuộc họ Rhodophyceae, chủ yếu phát triển ở khu vực Đại Tây Dương, đặc biệt gần Anh, Châu Âu và Bắc Mỹ.

Carrageenan đã được phát hiện từ lâu ở phương Tây, với những nghiên cứu đầu tiên của các nhà khoa học như Schimdt và Stantord vào những năm 1842-1862, khi họ tìm thấy carrageenan trong rong đỏ Chondrus crispus và Irish moss thuộc họ Rhodophyceae Tuy nhiên, những khám phá ban đầu còn thô sơ và chưa xác định được tính chất cụ thể của carrageenan Đến thời kỳ Chiến tranh thế giới thứ nhất, nhu cầu cao về gelatin cho quân đội đã thúc đẩy nhiều nghiên cứu, dẫn đến việc phát hiện carrageenan như một chất thay thế có tính chất tương tự gelatin.

Tên Carrageenan hay Carrageenan – irish moss là tên của một thị trấn ven biển Irish thuộc Carrageenan.

Từ những loài rong đỏ (Rhodophyceae) người ta đã phát hiện ra nhiều loại carrageenan khác nhau, bao gồm: kappa-carrageenan, lambda- carrageenan, iota-carrageenan, beta-carrageenan…[38].

1.3.2 Phân bố và sản lượng carrageenan trên thế giới và trong nước 1.3.2.1 Phân bố và sản lượng carrageenan trên thế giới

Hằng năm, thế giới sản xuất khoảng 100.000 tấn khô Carrageenophyte và chế biến 15.000 tấn carrageenan, chủ yếu từ các quốc gia như Trung Quốc, Indonesia, Hàn Quốc, Malaysia, Philippines, Singapore, Thái Lan, Nam Mỹ (Chile), Châu Âu (Đan Mạch, Liên minh Châu Âu), Châu Phi (Morocco, Nam Phi, Zanzibar - Tanzania) và Nam Nhật Bản.

Theo thống kê năm 2000, hơn 80% sản lượng carrageenan được sản xuất bởi các công ty lớn như FMC và CP Kelco của Mỹ, Danisco của Đan Mạch, Degussa của Đức, và Ceamsa của Tây Ban Nha.

Ngành công nghiệp sản xuất carrageenan hiện đang phát triển mạnh mẽ không chỉ ở Mỹ và Tây Âu mà còn ở nhiều quốc gia Châu Á như Trung Quốc, Nhật Bản và Philippines Tại Nhật Bản, carrageenan cùng với agar và alginate được ứng dụng trong chế biến thực phẩm và các lĩnh vực khác Ngành công nghiệp này chủ yếu sử dụng hai loài rong Eucheuma và Kappaphycus nhập khẩu từ Đông Nam Á, bên cạnh các nguyên liệu tự nhiên như Chondrus và Gigartina từ châu Mỹ và châu Âu Đặc biệt, tảo bẹ Nhật Bản (Saccharina japonica) chiếm gần 51% tổng lượng rong biển nuôi trồng, trong khi Gracilaria đứng ở vị trí thứ hai.

Undaria spp (wakame) và Porphyra spp (Tiếng Nhật) Bốn loài chính này đóng góp 92% tổng sản lượng năm 2015.

Trung Quốc đóng góp khoảng 60% sản lượng rong biển toàn cầu, với sản lượng nuôi trồng rong biển tăng nhanh từ 9,7 triệu tấn vào năm 2006 lên 13,9 triệu tấn vào năm 2015.

Bảng 1.3 Sản lượng rong biển nuôi trồng ở Trung Quốc từ 2009–2015 [39]

Trọng lượng tính bằng tấn

Thực vật thủy sinh khác

Indonesia báo cáo sản lượng từ 1,2 triệu tấn năm 2006 lên 11,3 triệu tấn năm 2015 Sản lượng rong biển, 2010–2015 ở bảng 1.4.

Bảng 1.4 Sản lượng rong biển ở Indonesia từ 2010–2015 [39]

Trọng lượng tính bằng tấn

Tổng sản lượng nuôi trồng

Sản xuất tự nhiên(hoang dã)

Theo thống kê từ cơ quan Philippines, trong năm 2016, xuất khẩu rong biển và carrageenan đạt gần 43.000 tấn, với giá trị hải quan lên tới 200 triệu USD.

Bảng 1.5 Xuất khẩu rong biển (carrageenan) ở Philippines từ 2013–2016

Trọng lượng tính bằng tấn; trị giá hàng nghìn USD

1.3.2.2 Phân bố và sản lượng carrageenan trong nước [40]

Hình 1.5 Bản đồ vị trí khu vực phân bố các carrageenophytes ở Việt Nam.

Cho đến nay các loài rong thuộc nhóm Carrageenophyte ở ven biển phía Nam Việt Nam được xác định là Eucheuma spp, Kappaphycus spp,

Hypnea spp, Acanthophora-spp, Gymnogongrus spp, Betaphycus Trong đó Eucheuma, Kappaphycus, Betaphycus, chủ yếu phân bố ở vùng biển miền

Trung Việt Nam, nằm trong nhóm nguyên liệu chính và phổ biến cho công nghiệp chế biến carrageenan của các nước trên thế giới.

Carrageenan là một polysaccharide sulfate có cấu trúc mạch thẳng, hòa tan trong nước, được hình thành từ sự luân phiên giữa các đơn vị D-galactose và 3,6-anhydro-D-galactose thông qua các liên kết α-1,4 và β-1,3-galactopyranosyl.

42] Phụ thuộc vào số lượng, vị trí của nhóm sulfate và sự có mặt của vòng 3,6-anhydro của gốc galactose mà carrageenan được phân làm 03 họ chính sau:

 Họ Kappa carrageenan bao gồm kappa (κ) và iota () carrageenan.

 Họ Beta carrageenan bao gồm beta (β) và omega (ω) carrageenan.

 Họ Lambda carrageenan bao gồm theta () và pi () carrageenan.

Các phân tích bằng phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân cho thấy mỗi loại carrageenan như mu (à), kappa, nu (ν), iota, xi (ξ), gamma (γ) và theta đều có cấu trúc dạng chỉ thị riêng biệt Một số cấu trúc này được minh họa trong hình 1.7, bao gồm γ-carrageenan với R=H(G-D6S), β-carrageenan với R=H(G-DA), Ψ-carrageenan (G6S-D6S) và ω-carrageenan (G6S-DA).

Carrageenan họ Beta μ-carrageenan R=H(G4S-D6S) κ-carrageenan R=H(G4S-DA) ν-carrageenan R=SO 3 - (G4S-D2S,6S) ᶥ -carrageenan R=SO 3 - (G4S-DA2S)

Carrageenan họ Kappa λ-carrageenan R=SO 3 - (G2S-D2S,6S) θ-carrageenan R=SO 3 - (G2S-DA2S) δ-carrageenan R=SO 3 - (G,6S) α-carrageenan R=SO 3 - (G-DA2S) ξ-carrageenan R=H(G2S-D2S)

Hình 1.6 Cấu trúc hóa học của các dạng carrageenan [43].

Mạch polysaccharide của carrageenan có cấu trúc xoắn kép, với mỗi vòng xoắn được hình thành từ các gốc disaccharide Cấu trúc bậc 3 của nó được ổn định nhờ các liên kết hydro giữa oxy ở C6 của gốc galactose trong mạch này và gốc tương tự ở một mạch khác Trong dung dịch, các xoắn kép có khả năng liên hợp để tạo thành cấu trúc bậc 4 Carrageenan có công thức cấu tạo đơn giản khi kết hợp với các ion Ca2+, K+, Na+ như R=(OSO3)2Ca, R-OSO3Na, và R-OSO3K, trong đó R đại diện cho gốc polysaccharide.

Sự có mặt của các cation như K+, Ca2+ và Na+ kích thích sự hình thành các dimer xoắn ốc, tạo ra mạng lưới ba chiều ổn định Quá trình này diễn ra nhờ vào tương tác giữa các phân tử trong chuỗi xoắn carrageenan thông qua việc liên kết với các nhóm sulfate.

Hình 1.7 Cơ chế tạo gel của κ-carrageenan khi có mặt các ion kali [46].

1.3.4 Tính chất hóa lý của carrageenan

Hydrocolloid chứa α-D-1,3 và β-D-1,4 galactose với hàm lượng sulfate lên đến 40% tổng khối lượng, tích điện âm, kết hợp với ammonium, potassium, calcium, magnesium và sodium.

Khả năng hòa tan λ-carrageenan hòa tan trong nước lạnh và nước nóng, κ- carrageenan hòa tan trong nước nóng, κ-carrageenan bị kết tủa trong dung dịch potassium.

Hình thành gel λ-carrageenan không hình thành gel, chỉ hình thành cấu trúc xoắn Ion calcium hình thành gel với ι-carrageenan Ion potassium hình thành gel với κ-carrageenan.

Liên kết glycoside được chuyển hóa thông qua quá trình thủy phân ở pH thấp (pH + 3 ppm) cung cấp thông tin quan trọng tương tự như khi thực hiện phân tích metyl hóa Trật tự các đơn phân trong mạch polysaccharide phản ánh cấu trúc chuỗi của các liên kết glycoside, đây là thông tin cấu trúc chính cần xác định từ hai loại phổ 1H-13C HMBC và NOESY.

1.4.3 Một số nghiên cứu cấu trúc của carrageenan

Năm 2003, Thành Thị Thu Thủy và cộng sự đã xác định κ-carrageenan từ rong sụn nuôi trồng tại tỉnh Ninh Thuận thông qua các phương pháp phân tích như phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), phổ hồng ngoại (IR), và sắc ký lọc gel (GPC) kết hợp với sắc ký lỏng khối phổ có bộ kết nối phun điện (ESI-MS).

Theo nghiên cứu của Guangli (2004), quá trình thủy phân κ-carrageenan bằng acid HCl chỉ diễn ra tại các liên kết α-(1→3) glycosidic Bằng phương pháp ESI-MS, nghiên cứu đã chứng minh rằng các phân tử κ-carrageenan là một acid sulfuric galactan tuyến tính mà không có phân nhánh.

Theo nghiên cứu của Guibet và cộng sự (2006), các sản phẩm thủy phân đã được phân tích bằng phương pháp phổ 1H và 13C-NMR Kết quả cho thấy tất cả các oligo carrageenan quan sát thuộc loại neo - carrabiose oligosaccharide, điều này chỉ ra rằng enzyme -carrageenase có khả năng thủy phân các liên kết trong cấu trúc này.

Trần Đình Toại và cộng sự (2008) đã sử dụng acid HCl để thủy phân carrageenan chiết xuất từ rong Hồng Vân Eucheuma gelatinae thuộc ngành rong đỏ Rhodophyta tại Việt Nam, nhằm tạo ra oligo carrageenan Qua việc áp dụng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR) và phổ khối kết hợp sắc ký lỏng ESI-MS, nhóm nghiên cứu đã xác định cấu trúc của sản phẩm và kết luận rằng quá trình thủy phân carrageenan bằng acid HCl chỉ làm thay đổi không đáng kể cấu trúc của polymer, chủ yếu phá vỡ các liên kết glycoside và cắt ngắn mạch polymer.

Năm 2009, theo Loan Hui các oligosaccharide tách bằng cách sử dụng phân đoạn ethanol, các phân đoạn được sắc ký lọc gel qua cột lọc Bio-Gel P-

4, xác định phổ IR và phân tích hóa học, chứng minh rằng: quá trình thủy phân enzyme làm thay đổi không đáng kể cấu trúc của κ-carrageenan [85].

ƯU ĐIỂM, NHƯỢC ĐIỂM CỦA CÁC NGHIÊN CỨU VỀ

Nguồn nguyên liệu rong carrageenophite rất phong phú, tạo điều kiện cho nhiều đối tượng nghiên cứu khác nhau Các thiết bị nghiên cứu cấu trúc hiện đại như máy đo hồng ngoại và máy cộng hưởng từ hạt nhân đều có sẵn, hỗ trợ tối đa cho các nghiên cứu liên quan.

Các thiết bị hiện đại cho nghiên cứu hoạt tính sinh học theo cơ chế phân tử còn rất hạn chế.

ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM …

ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

* Rong đỏ Betaphycus gelatinus thu thập ở vùng biển Ninh Thuận.

Rong được thu thập tại Ninh Thuận vào tháng 6/2019 và tháng 3/2021 bởi ThS Trần Mai Đức Việc định danh khoa học mẫu rong được thực hiện bằng phương pháp hình thái bởi TS Võ Thành Trung từ Viện nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha Trang Sau khi thu thập, mẫu rong được rửa sạch để loại bỏ rác, cát và mùn bằng nước ngọt, sau đó phơi khô trong bóng râm và sấy khô ở nhiệt độ thích hợp.

40 0 C và nghiền mịn thành bột rồi đem nghiên cứu (hình 2.2).

Hình 2.1 Rong Betaphycus gelatinus Hình 2.2 Bột rong Betaphycus gelatinus

Nghiên cứu Nghiền mịn Nước biển

Hình 2.3 Sơ đồ thu, xử lý nguyên liệu, lưu trữ mẫu, nghiên cứu.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Tìm điều kiện tối ưu để chiết tách sulfate polysaccharide bằng phương pháp đáp ứng bề mặt.

Bố trí thí nghiệm: Tối ưu hóa thông số chiết bằng phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) với mô hình Box-Behnken [86, 87] Ở đây, nhiệt độ chiết

Ba biến độc lập trong nghiên cứu là ND (X1), thời gian chiết TG (X2) và tỷ lệ dung môi : nguyên liệu TL (DM : NL) (X3) Vùng biến nghiên cứu của các biến này được mã hóa và thể hiện trong bảng 2.1 dựa trên kết quả thực nghiệm nhân tố đơn Phương án thí nghiệm bao gồm 12 thí nghiệm nhân tố và 3 thí nghiệm lặp lại, với hiệu suất chiết sulfate polysaccharide được lựa chọn dựa trên các kết quả kết hợp của các biến độc lập Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần và được thực hiện ngẫu nhiên nhằm giảm thiểu tác động của biến đổi bất thường trong quan sát Các biến được mã hóa theo phương trình x = (Xi - X0).

Trong mô hình thí nghiệm Box-Behnken, ký hiệu ΔX đại diện cho hiệu số giữa giá trị tuyệt đối cực đại của biến thực (Xi) và giá trị biến tại thí nghiệm trung tâm (X0) Biến mã được ký hiệu là x, trong khi X0 là biến tham chiếu trong thí nghiệm Phương trình toán học tương ứng với mô hình này thể hiện mối quan hệ giữa các biến trong nghiên cứu.

Hàm mục tiêu (HMT) trong nghiên cứu này được xác định là hiệu suất chiết đạt giá trị cực đại, với Y là hàm mục tiêu, β0 là hệ số tự do, và các hệ số βi, βii, βij thể hiện ảnh hưởng tuyến tính và phi tuyến tính lên các biến Sai số được biểu diễn bởi ε, cho thấy sự biến động trong mô hình.

Bảng 2.1 Bảng quy đổi biến mã và biến thực

Tỷ lệ dung môi : nguyên liệu

Bảng 2.2 Thiết kế thí nghiệm theo biến mã sử dụng mô hình Box-Behnken

Thí nghiệm chiết xuất polysaccharide được thực hiện bằng cách chiết 15g bột rong trong 450 ml nước với tỷ lệ dung môi: nguyên liệu là 30:1, ở các nhiệt độ 60°C, 80°C và 100°C, với thời gian chiết là 30’, 105’ và 180’ Sau khi chiết, dung dịch được lọc và tủa bằng cồn tuyệt đối theo tỷ lệ 4:1, sau đó gạn lọc và ly tâm để thu tủa, rửa tủa nhiều lần bằng cồn 85° và 96° Cuối cùng, sản phẩm thu được là sulfate polysaccharide Trong các thí nghiệm tiếp theo, ảnh hưởng của từng yếu tố chiết được khảo sát bằng cách thay đổi giá trị của yếu tố đó trong khi giữ 3 yếu tố còn lại cố định Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần để tính toán hiệu suất chiết và hàm lượng polysaccharide trung bình.

Chiết xuất sulfate polysaccharide tự nhiên (SP) được thực hiện theo quy trình của Craigie và Leigh (1978) bằng cách loại bỏ chất màu và chất béo từ rong biển bằng ethanol Sau đó, rong biển được chiết với dung dịch NaCl 0,05 M ở nhiệt độ thích hợp.

Trong quá trình chiết xuất, bã rong được xử lý bằng phương pháp chiết lạnh ở 22 oC trong 24 giờ, sau đó chiết nóng với dung dịch NaHCO3 0,5M tại 90 oC trong 2 giờ Sau khi lọc dung dịch chiết, tủa được thực hiện bằng cetylpyridinium chloride (CPC) và phản ứng trao đổi với ion Na+ trong môi trường NaCl/ethanol 80%, tạo ra tủa SP Tủa sau đó được hòa tan bằng nước cất và đông khô để thu được SP dạng bột, từ đó tiến hành cân và tính toán hiệu suất Các mẫu sulfate polysaccharide thu được từ chiết lạnh và chiết nóng được ký hiệu lần lượt là TN1 và TN2.

Chiết sulfate polysaccharide được thực hiện bằng cách xử lý rong với NaOH 0,5 Mol/l trong 12 giờ ở nhiệt độ phòng và sau đó chiết nóng ở 80°C trong 3 giờ, tiếp theo là rửa bằng nước trong 30 phút Hỗn hợp chiết sau đó được lọc và ly tâm để loại bỏ cặn Dung dịch lọc được điều chỉnh pH về 3 bằng HCl, tiếp tục ly tâm để tách tủa, và tủa này được xử lý bằng ancol 80% qua đêm Cuối cùng, tủa được rửa ba lần bằng ancol và sấy khô để thu được sản phẩm Mẫu sulfate polysaccharide chiết kiềm được ký hiệu là TN3 và TN4.

Quy trình chiết tách bằng các sơ đồ sau: a) Sơ đồ thí nghiệm cơ sở (chiết nước nóng)

Xử lý chất màu và chất béo bằng ethanol

Chiết nóng (NaHCO3 0,5 M, 90oC, 2 giờ)

B gelatinus không màu b) Chiết sulfate polysaccharide tự nhiên(nóng, lạnh)

Trao đổi Na + / NaCl/ethanol 80% Trao đổi Na + / NaCl/ethanol 80%

Thu tủa SP Thu tủa SP

Hòa tan tủa bằng nước cất, đông khô Hòa tan tủa bằng nước cất, đông khô

Xử lý NaOH 0,5 M, 12 giờ, nhiệt độ phòng

Dung dịch Dịch lọc chỉnh về pH=3 bằng dung dịch HCl

Sulfate polysaccharide chiết kiềm lạnh (TN3)

Sấy tủa Rửa tủa 3 lần bằng ancol

B gelatinus c) Chiết sulfate polysaccharide bằng xử lý kiềm

Hình 2.4 Quy trình chiết tách (a, b, c).

2.2.1.2.Các phương pháp phân tích a) Xác định độ ẩm của rong [88]: Độ ẩm được phân tích bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi và cân khối lượng.

Phương pháp xác định độ ẩm dựa trên nguyên tắc sử dụng nhiệt để bay hơi nước trong mẫu Đầu tiên, cần cân khối lượng mẫu trước khi sấy khô, sau đó tiếp tục cân lại sau khi sấy Từ sự chênh lệch khối lượng giữa hai lần cân, ta có thể tính toán được độ ẩm của mẫu một cách chính xác.

Lọc, ly tâm, bỏ cặn

Tủa bằng ancol 80 % để qua đêm

Ly tâm, loại tủa Độ ẩm của mẫu được tính theo công thức: Độ ẩm (%) = *100% b) Xác định hàm lượng protein: Protein được xác định theo phương pháp Lowry [89].

Protein có khả năng phản ứng với thuốc thử Folin để tạo ra phức chất màu xanh da trời, với cường độ màu tỷ lệ thuận với nồng độ protein trong một khoảng nhất định Để đo cường độ màu, sử dụng thiết bị đo màu quang điện tại bước sóng 750nm.

Dựa vào đồ thị protein chuẩn BSA, có thể xác định hàm lượng protein ở nồng độ vài chục µg Để xác định hàm lượng lipid, có thể áp dụng phương pháp Soxhlet và phương pháp Folch.

Lipid thô được chiết xuất bằng máy chiết Soxhlet (Soxtec System HT6, Tecator, Hoganas, Thụy Điển) với dung môi chloroform - methanol theo tỷ lệ 2:1 (v/v) và sau đó tinh chế theo phương pháp của Folch et al (1957) Dịch chiết lipid tinh khiết được làm bay hơi đến khô bằng thiết bị bay hơi nitơ Rapidrap (Labconco, MO) Hàm lượng khoáng được xác định bằng phương pháp nung hóa tro ở nhiệt độ 650 o C.

Chén nung cần được rửa sạch và nung ở nhiệt độ 650°C cho đến khi đạt khối lượng ổn định Tiếp theo, cân 1,0 g mẫu rong cho vào cốc nung và đun trên bếp điện cho đến khi hóa than đen Sau khi hoàn thành quá trình hóa than, chuyển mẫu vào lò nung ở nhiệt độ thích hợp.

650 o C để hóa tro hoàn toàn (chuyển màu trắng), lặp lại ít nhất 2 lần và cân đến khối lượng không đổi.

Tính ra tỷ lệ % của tro chứa trong rong biển theo công thức sau: X (%) = (A - B).100 / m

A: Khối lượng chén nung + tro (g)

B: Khối lượng chén nung (g) m: Số gam rong biển dùng để thí nghiệm.

2.2.1.3 Xác định sulfate theo phương pháp BaCl 2 của Dodgson KS [92]

Hàm lượng sulfate trong mẫu carrageenan được xác định bằng phương pháp đo độ đục sử dụng BaCl2/gelatin Đầu tiên, cân khoảng 5 mg mẫu vào lọ thủy tinh có nắp vặn, sau đó thêm 2 ml HCl 1N và tiến hành thủy phân ở nhiệt độ 100°C trong 6 giờ Sau khi thủy phân, lấy 10 µl dung dịch mẫu, thêm vào 100 µl TCA (Triclorua acetic acid) và 100 µl hỗn hợp 0,5% gelatin và 0,5% BaCl2, lắc đều và đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 360 nm.

DS(%) DS: hàm lượng sulfate (%); mBaSO4: khối lượng của BaSO4 (g); m: khối lượng mẫu thử nghiệm (g).

2.2.1.4 Xác định carbohydrate theo phương pháp phương pháp Phenol-Sulfuric acid của Dubois [93]

Hàm lượng tổng carbohydrate được xác định bằng phương pháp phenol-Sulfuric acid Để thực hiện, chuẩn bị dung dịch mẫu với nồng độ carbohydrate thích hợp, sau đó trộn 200µl dung dịch mẫu với 200µl thuốc thử phenol 5%, lắc đều cho đến khi dung dịch trong suốt Tiếp theo, thêm 1ml sulfuric acid đậm đặc, lắc đều và đun cách thủy trong 5 phút, sau đó để nguội Cuối cùng, đo độ hấp thụ quang ở bước sóng λ = 490 nm, sử dụng glucose hoặc galactose làm dung dịch chuẩn.

2.2.1.5 Xác định 3,6-anhydrogalactose theo phương pháp Yaphe và CS [94]

The determination of 3,6-anhydro-L-galactopyranose content is achieved using the Resorcinol method, with fructose serving as the standard To perform this analysis, take 1 mL of the solution to be tested, ensuring the concentration ranges from 0 to 0.25 μmol/mL, and then add 10 mL of the reagent solution.

Resorcinol – acetal ở nhiệt độ 20 o C, lắc trong 4 phút Sau đó đun nóng đến

80 o C trong 10 phút, làm lạnh bằng nước đá trong 1,5 phút, đo trên máy UV- VIS ở bước sóng 555 nm Mẫu đo tránh tiếp xúc với ánh sáng mạnh.

2.2.2 Các phương pháp vật lý

2.2.2.1 Phương pháp phổ hồng ngoại (IR)

Phổ hồng ngoại được đo trên máy FT-IR Affinity-1S SHIMADZU tại

Bộ môn Hóa vô cơ – Khoa Hóa học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội.

2.2.2.2 Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Phổ NMR của mẫu nghiên cứu được đo ở nhiệt độ 70ºC, với dung môi