Sử dụng 8 dòng vi khuẩn khử đạm; trong đó 7 dòng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri bao gồm 6Rc, 7Ra, D3b, D7a, TN7, TN5, VT_B1b và dòng vi khuẩn đối chứng dương AU11 (nguồn gốc từ Đại học Murdoch, Australia) để xử lý nitơ trong nước thải trại chăn nuôi heo. Tất cả 8 dòng đều có khả năng oxy hóa ammonium, khử nitrat với hiệu suất và sự tích tụ các hợp chất trung gian khác nhau. Ba dòng 6Rc, TN7 và VT_B1b được tuyển chọn sau 72 giờ nuôi cấy trong môi trường tổng hợp BMNO3. Cả ba dòng này có khả năng oxy hóa ammonium với hiệu suất từ 57 – 97%, khử nitrat đạt hiệu quả và sự tích tụ lượng nitrit thấp. Kiểm tra khả năng khử đạm của 3 dòng 6Rc, TN7 và VT_B1b trong thùng chứa 50 lít nước thải chăn nuôi heo, khi chủng độc lập từng dòng hay có sự phối hợp giữa các dòng vi khuẩn với nhau; kết quả cho thấy sau 144 giờ thí nghiệm, sự kết hợp hai dòng 6Rc và TN7 là tổ hợp mang lại hiệu quả làm giảm COD, khử nitơ tốt hơn các nghiệm thức khác. Khi ứng dụng 2 dòng vi khuẩn này (6Rc và TN7) xử lý nước thải chăn nuôi heo trong thùng chứa 1000 lít; kết quả là sau 6 ngày thí nghiệm, các chỉ tiêu COD, N_NH4+, tổng N giảm với hiệu suất lần lượt là 38,4%, 87,24%, 86,95%; hiệu suất xử lý đạm tăng so với đối chứng lần lượt là 19,31%, 10,16%, 15,47%.
Mục tiêu nghiên cứu
Tuyển chọn một sốdòng vi khuẩnP stutzeri bản địa có khả năng khử đạm cao để ứng dụng xửlý nước thải từtrại chăn nuôi heo ở tỉnh Tiền Giang.
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
Tình hình chăn nuôi ở tỉnh Tiền Giang
Theo thống kê tỉnh Tiền Giang trong năm 2007, tổng đàn gia súc gia cầm chủ yếu trong tỉnh là:
Bảng 1: Đàn gia súc gia cầm chủ yếu Đơn vị tính: con
Nguồn: Cục Thống kê tỉnh Tiền Giang, 2007
Tính đến tháng 7/2006, tổng đàn heo tại Tiền Giang đạt 510.491 con, chủ yếu tập trung tại hai huyện Chợ Gạo với 114.947 con và Gò Công Tây với 100.243 con, trong khi 7 huyện và thành phố khác có số lượng heo còn lại.
Tình trạng ô nhiễm nitơ môi trường nước khu vực chăn nuôi heo
Năm 2006, tỉnh Tiền Giang có 2.513 trang trại chăn nuôi heo, chủ yếu tập trung tại huyện Chợ Gạo với 654 trang trại và Gò Công Tây với 576 trang trại, mỗi trang trại nuôi trung bình trên 20 con heo (Cục Thống kê Tiền Giang, 2007) Đối với các hộ chăn nuôi gia đình với quy mô nhỏ (dưới 10 con/trại), việc lắp đặt túi ủ biogas bằng nhựa để xử lý chất thải và nước thải được thực hiện, với sản phẩm biogas được đưa vào ao sinh học nuôi cá Tuy nhiên, hình thức xử lý này chưa thực sự đảm bảo bảo vệ môi trường xung quanh.
Trại chăn nuôi với hơn 20 con heo đã xây dựng hầm biogas, nhưng vẫn gặp vấn đề ô nhiễm môi trường xung quanh Nguyên nhân có thể là do thể tích hầm biogas không đủ lớn để xử lý lượng chất thải từ số lượng heo nuôi Người chăn nuôi thường tiết kiệm chi phí, dẫn đến tình trạng này.
Việc xây dựng các hệ thống xử lý chất thải với thể tích chứa hầm biogas nhỏ trong khi số lượng heo nuôi lại lớn dẫn đến thời gian chất thải rắn tồn tại trong bể không đủ để phân hủy Quá trình phân hủy kị khí trong hầm biogas tạo ra một lượng lớn khí CO2, H2S, NH3, CH4 và các chất khác.
Sương và Nguyễn Lân Dũng (1997) chỉ ra rằng khí NH3 và H2S thoát ra từ môi trường gây mùi hôi thối, trong khi NH3 hòa tan trong nước dưới dạng NH4+ tham gia vào quá trình nitrat hóa - khử nitrat Quá trình xử lý này diễn ra trong điều kiện kị khí (hầm biogas) và hiếu khí (ao sinh học) Tuy nhiên, sự tích lũy chất thải chưa được phân hủy hoàn toàn từ hầm biogas, cùng với hiệu suất thấp của quá trình nitrat hóa - khử nitrat tự nhiên, là nguyên nhân chính dẫn đến ô nhiễm nghiêm trọng tại các trại chăn nuôi tập trung.
Kết quả phân tích các chỉ tiêu pH, COD, N_NH4 +, N_NO3 -, N_NO2 - trong nước thảiởao sinh học số 1:
Bảng 2: Các chỉtiêu hóa lý nước thải
STT Thông số Đơn vị Kết quả (a)
3 Amoni (Tính theoN) mg/lít 17.5
4 Nitrat (tính theo N) mg/lít 0.57
5 Nitrít (tính theo N) mg/lít 0.04
Nguồn: Kết quả phân tích phân tích năm 2009 a Trung bình 3 lần lặp lại.
Quá trình phân hủy các hợp chất chứa nitơ trong môi trường tự nhiên
Trong các ao hồ, sự sống còn của thực vật thủy sinh chịu ảnh hưởng trực tiếp từ các yếu tố như amonia (NH3), nitrit (NO2-) và nitrat (NO3-) Ba yếu tố này là thành phần của các hợp chất chứa nitrogen, được hình thành từ quá trình phân hủy protein.
Quá trình khử đạm là một bước quan trọng trong chu trình nitơ (Lee et al, 2002) Hiện tượng khử nitrat và nitrit thành nitơ phân tử lần đầu tiên được phát hiện bởi Schloesing vào năm 1868 (Nguyễn Đức Lượng và Nguyễn Thị Thùy Dương, 2003).
Quá trình nàyđược xem như là sự tập hợp của sự hô hấp nitrat, nitrit kết hợp với sự khử nitric oxide và sự hô hấp nitrous oxide (Zumft, 1997):
Nitrat Nitrit Nitric oxide Nitrous oxide Dinitrogen gas (NO 3 - ) (NO 2 - ) (NO) ( N 2 O) (N 2 )
Dạng phảnứng oxy hóa - khử:
Quá trình ANAMMOX (Oxy hóa ammonium trong điều kiện kị khí) là quá trình chuyển đổi nitrit và ammonium trực tiếp thành nitơ phân tử trong môi trường thiếu oxy (Reginatto et al, 2005).
Ammonium rất độc hại và nguy hiểm, với nồng độ N-NH4+ từ 0,6-2 mg/l có thể ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của cá Hàm lượng ammonia lý tưởng cho ao nuôi thủy sản là dưới 0,1 mg/l, trong khi ammonium nên duy trì ở mức 0,2-2 mg/l (Boyd, 1998) Chất này có khả năng tiêu diệt tất cả thực vật thủy sinh, đặc biệt trong môi trường khép kín như ao hồ.
Quá trình amôn hóa protein là quá trình phân hủy các hợp chất hữu cơ chứa nitơ, tạo ra ammonia (NH3) nhờ sự hoạt động của nhiều vi sinh vật hiếu khí và kị khí như vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn Các vi sinh vật này sản xuất enzyme thủy phân protein, giúp phân cắt protein thành peptone, polypeptide, dipeptid và acid amin Sản phẩm chính của quá trình oxy hóa hiếu khí bao gồm ammonia, carbonic, và các muối của acid sulfuric và acid photphoric Amôn hóa protein đóng vai trò quan trọng trong chu trình nitơ, chuyển đổi nitơ từ dạng khó hấp thu sang dạng muối amôn dễ dàng cho thực vật sử dụng, nhờ đó NH3 được phục hồi và cung cấp dinh dưỡng cho thực vật thủy sinh Các loài vi khuẩn như Bacillus là những tác nhân chính trong quá trình này.
• •• • • ••• • •• • • •••• • •• • •• • • •• • • •• •• • ••••• • •• • • ••• • • • •• • • •• • •• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • mesentericus, B mycoide, B subtilis … Nhiệt độ tối ưu cho sự amôn hóa là từ 25-
30 0 C và NH 3 được hình thành trong quá trình amon hóa sẽ hòa tan vào nước hình thành ion NH4 +.
Hình 1: Chu trình nitơ (Bothe et al, 2007)
Ammonium, dù có độc hại, dễ dàng bị oxy hóa bởi vi khuẩn hiếu khí và oxy trong nước Quá trình phân hủy này tạo ra nitrit, là chất thải của vi khuẩn hiếu khí, sau đó nitrit tiếp tục bị phân hủy thành NO3- Quá trình này được gọi là nitrat hóa (Nitrification) và được thực hiện bởi các vi sinh vật hóa tự dưỡng.
Quá trình nitrat hóa: Oxy hóa NH 4 + thành nitrit
Trong quá trình oxy hóa, vi sinh vật thu nhận năng lượng cần thiết cho sự sống Chúng đồng thời đồng hóa CO2 để xây dựng các hợp chất hữu cơ, thể hiện tính chất vi khuẩn hóa tự dưỡng và là những sinh vật hiếu khí bắt buộc.
Hàm lượng N-NO2- trong ao nuôi cá nên dưới 0,3 mg/l, trong khi nitrat (N-NO3-) là một dạng đạm dễ hấp thu bởi thực vật với mức an toàn từ 0,2-10 mg/l (Boyd, 1998) Mặc dù hàm lượng nitrat cao không gây độc hại cho cá, nhưng có thể dẫn đến sự phát triển quá mức của thực vật phù du, gây biến đổi chất lượng nước không có lợi cho tôm cá nuôi.
Nitrat không ảnh hưởng trực tiếp đến thực vật thủy sinh, nhưng sự tích tụ lâu dài của nó trong nước có thể dẫn đến sự hình thành acid nitric, làm giảm chất lượng nước và gây ra độ pH không ổn định Tuy nhiên, vấn đề này có thể được giải quyết nhờ vào quá trình quang hợp của cây thủy sinh và rêu tảo, trong đó một phần nitrat sẽ bị phân hủy Phần nitrat còn lại sẽ được vi khuẩn phân hủy, tạo ra nitrous oxide (N2O) và nitrogen (N2).
Quá trình khử nitrat (Denitrification) là một quá trình không cần oxy, tương tự như phân hủy ammonium, và yêu cầu có diện tích cho vi khuẩn bám và sinh sống Để đạt hiệu quả cao trong việc khử nitơ và phân hủy nitrat, cần tạo ra môi trường thích hợp với ít oxy.
Tóm lại, quá trình phân hủy các hợp chất chứa nitơ
Chất thải của sự sống sẽ bịphân hủy và tạo ra ammonium.
Ammonium một phần sẽ bị phân hủy bởi vi khuẩn hiếu khí và tạo ra nitrit.
Ammonium phần còn lại sẽ bị cây thủy sinh hấp thu và quang hợp tạo ra carbohydrate cho cây.
Nitrit tạo ra sẽ bịphân hủy bởi vi khuẩn hiếu khí Sauđó sẽ cho ra nitrat và cũng bị hấp thu bởi cây thủy sinh.
Nitrat phần còn lại mà cây thủy sinh hấp thu không hết sẽ bịphân hủy bởi vi khuẩn yếm khí, tạo ra nitrous oxide (N 2 O) và nitrogen (N 2 ).
Trong các hệ sinh thái tự nhiên, quá trình nitrat hóa và khử nitrat hóa diễn ra nhờ vào hàm lượng ammonium từ chất thải cá và các nguồn khác, dẫn đến sự hình thành nitrit và sau đó là nitrat Quá trình này phụ thuộc vào sự hoạt động của vi khuẩn sống trong hồ và lớp cát.
Số lượng vi khuẩn trong đất nền và đá phụ thuộc vào lượng chất thải có mặt Khi không có chất thải tích tụ nhiều, vi khuẩn sẽ phân hủy ammonium thành nitrit, sau đó chuyển hóa thành nitrat, giúp ngăn ngừa ô nhiễm nước.
Nitrat được cây thủy sinh và rêu tảo hấp thu, sau đó quang hợp để sản xuất oxy Một số loại cây thủy sinh có thể bị cá ăn và thải ra dưới dạng ammonium Chu kỳ này tạo thành một hệ thống cấu trúc từ cộng đồng sinh vật trong môi trường, với các mối tương quan vật lý và sinh học, góp phần tạo ra sự ổn định và sinh tồn cho hệ sinh thái trong hồ cá và cây.
Sơ lược về vi khuẩn khử đạm Pseudomonas stutzeri
P stutzeri đầu tiên được phân lập bởi Burri và Stutzer (1895) van Niel và Allen
Vi khuẩn P stutzeri, được mô tả lần đầu vào năm 1952, có hình dạng que và có khả năng khử nitơ, với khuẩn lạc nhăn nheo, khô và bám chặt Đây là vi khuẩn gram âm, có roi và di chuyển, không tạo bào tử và thuộc nhóm vi khuẩn hiếu khí P stutzeri có khả năng loại trừ nitơ từ NO3-, giải phóng N2, và có thể phát triển trong môi trường chứa maltose và tinh bột (Bennasar, 1998) Loài vi khuẩn này được tìm thấy trong nước và đất, có tính đa dạng sinh học cao, sống không kiên định và phân bố rộng rãi khắp các vùng địa lý (Zumft, 1997) Gần đây, P stutzeri đã được phân lập từ phân heo (Su et al.).
2001) P stutzeri có khả năng khử nitơ theo nhiều con đường khác nhau khử nitrat thành N2 mà không có sự tích lũy nitrit, khử nitrat theo 2 bước ( khử NO3 - thành
NO 2 - và khửNO 2 - thành N 2 ), khử nitrat với sựtích tụ nitrit ở nồng độ thấp (Su et al,
2001) Sự biến đổi nitrit là một bước quan trọng trong chu trình nitrogen, trong đó
Nitric oxide (NO2) is reduced to nitric oxide (NO) and subsequently to nitrogen gas (N2) Most of the nitrogen-reducing enzymes in Pseudomonas stutzeri have been studied extensively (Coyle et al., 1985; Heiss et al., 1989; Körner and Zumft et al.).
1989) Enzyme khử nitrat và nitrit thể hiện khi nồng độ oxy hòa tan không vượt quá
Enzyme khử nitrous oxide hoạt động hiệu quả ở nồng độ oxy không vượt quá 5%, theo nghiên cứu của Kửrner và Zumft (1989) Trong điều kiện nồng độ oxy bảo hòa, các chất nhận điện tử từ nitơ không ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme khử nitơ của vi khuẩn P stutzeri Đặc biệt, khi nồng độ oxy đạt 27%, nitrat kích thích sự thể hiện của enzyme này một cách đáng kể.
• •• • • ••• • •• • • •••• • •• • •• • • •• • • •• •• • ••••• • •• • • ••• • • • •• • • •• • •• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • cỏc enzyme khửnitrat và thể hiệnđỏng kểenzyme khửnitrit, nitrous oxid (Kửrner và
Lịch sử nghiên cứu các loài vi khuẩn liên quan đến quá trình nitrat hóa và khử
Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng quá trình khử nitrat diễn ra chủ yếu trong điều kiện kị khí, với sự ức chế của hệ enzyme khử nitơ khi nồng độ oxy tăng cao (Zumft et al, 1988).
Pseudomonas nautica (dòng 612), hoạt tính enzyme khử nitrat, nitrit và nitrous oxid hoàn toàn bị ức chế với nồng độoxy vượt quá 5.05, 2.15 và 0.25 mg/lít (Bonin et al,
Một số vi khuẩn có khả năng thực hiện quá trình khử nitơ hiếu khí trong điều kiện oxy không khí khác nhau, chẳng hạn như Pseudomonas denitrificans, có thể khử nitơ dưới điều kiện oxy bảo hòa 90% Quá trình khử nitơ không hoàn toàn phụ thuộc vào môi trường kị khí, điều này được chứng minh bởi các loài khử nitrat dị dưỡng như P stutzeri và Alcaligenes facealis.
Carlson và Ingraham (1982) đã nghiên cứu khả năng khử nitơ của ba loài vi khuẩn: P stutzeri, P aeruginosa và P paracoccus Tất cả ba loài này đều có khả năng chuyển đổi nitrat thành khí N2, nhưng nồng độ các chất trung gian trong quá trình khử nitrat lại khác nhau Sản phẩm khí sinh ra cũng khác biệt: P stutzeri chủ yếu tạo ra khí N2, trong khi P aeruginosa và P paracoccus thường sản xuất nhiều khí N2O hơn Ngoài ra, P stutzeri và P paracoccus có khả năng giảm nhanh chóng nồng độ NO3-, NO2- và NO trong môi trường kỵ khí có sự hiện diện của NO2.
Kửner và Zumft (1989) đã nghiên cứu sự thể hiện của các enzyme khử nitrat trong môi trường nuôi cấy liên tục với sự bổ sung hoạt chất hô hấp và thay đổi nồng độ oxy hòa tan Kết quả cho thấy, sự thể hiện của enzyme Nitrate reductase, Nitrite reductase và Nitrous reductase bị ảnh hưởng bởi nồng độ oxy khác nhau Cụ thể, Nitrous reductase chủ yếu được tổng hợp trong điều kiện oxy thấp dưới 5 mg O2/lít, trong khi ngưỡng oxy cho sự tổng hợp nitrate reductase và nitrite reductase (cytochrom cd 1) lần lượt là 5 và 2.5 mg/lít Đặc biệt, nitrous oxide (N2O) như một hoạt chất hô hấp thúc đẩy sự tạo ra nitrite reductase nhiều nhất dưới nồng độ oxy hòa tan Sự hiện diện của nitrat cũng kích thích quá trình tổng hợp các enzyme trong quá trình khử nitrat.
Sự thiếu hụt oxyt nitơ có thể ngăn chặn quá trình tổng hợp enzyme, dẫn đến sự tích tụ nitrit trong các giai đoạn xử lý hiếu khí - kị khí và kị khí - hiếu khí Điều này gây ra sự kích thích - ức chế và ức chế - kích thích trong việc tổng hợp nitrate reductase và nitrite reductase, đồng thời ảnh hưởng đến quá trình khử nitrit do tác động ức chế của nitrat.
Frette et al (1997) đã phân lập 169 dòng vi khuẩn nitrat hóa hiếu khí từ hệ thống bùn hoạt tính luân phiên, bao gồm 16 dòng vi khuẩn hô hấp nitrat có khả năng phát triển trong cả điều kiện hiếu khí và kỵ khí Phân tích DNA qua PCR cho thấy sự khác biệt giữa các dòng, trong đó một dòng sản sinh ra lượng lớn N2O, một sản phẩm cuối cùng của quá trình khử nitrat.
NO 2 - cao hơn NO 3 - Khử nitrat trong điều kiện kị khí, NO 2 - là chất nhận điện tử và
NO2 - bịkhử đồng thời với quá trình oxy hóa NH4 +và dòng phân lậpđược xácđịnh là
Nghiên cứu của Kester et al (1997) đã chỉ ra rằng nitric oxide (NO) và nitrous oxide (N2O) được sinh ra trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn nitrat hóa và khử nitrat, đặc biệt trong môi trường nghèo dinh dưỡng với sự biến đổi nồng độ oxy hòa tan Nghiên cứu tập trung vào vi khuẩn nitrat hóa Nitrosomonas europaea và vi khuẩn khử nitrat, góp phần làm sáng tỏ cơ chế sinh học liên quan đến quá trình này.
Nghiên cứu về Alcaligens eutrophus và P stutzeri cho thấy hiệu suất oxy hóa ammonium thành NO và N2O thay đổi theo nồng độ oxy Cụ thể, ở 80% oxy bảo hòa, Nitrosomonas europaea ghi nhận sự gia tăng 0.87% đối với NO và 0.17% đối với N2O Khi nồng độ oxy giảm xuống còn 1%, hiệu suất nitrat hóa thành NO tăng lên 2.32% và N2O đạt 0.78% Đặc biệt, ở 0% oxy bảo hòa, sản xuất N2O ngừng lại trong khi NO lại gia tăng.
P stutzeri khử nitrat dưới 1% oxy bảo hòa, ban đầu có sựtích tụ nitrit và N 2 O nhưng sau đó khử hoàn toàn nitrat tới N2 Chuyển Alcaligens eutrophus và P stutzeri sang nuôi trong môi trường từ0đến 80% oxy bảo hòa dẫnđến có sựtích lũy lượng lớn các hợp chất trung gian trong quá trình khử nitrat
Kual và Verstraete (1998) đã nghiên cứu khả năng khử nitơ trong hệ thống nitrat hóa - khử nitrat tự dưỡng giới hạn oxy (OLAND) với sự bổ sung bùn hoạt tính như chất xúc tác sinh học Trong bể phản ứng vận hành theo chuỗi, nước thải tổng hợp với nồng độ 1g NH4+/lít được bổ sung vào môi trường tối thiểu, trong khi oxy được cung cấp cho bể phản ứng Tốc độ tải nạp mẫu đạt 0.13 g NH4+-N/lít/ngày, dẫn đến khoảng 22% NH4+-N được biến đổi.
NO 2 - hoặc NO 3 - , 40% NH 4 + -N chuyển thành N 2 , 38% còn lại là NH 4 + -N Vi sinh vật
Các vi khuẩn oxy hóa ammonium là những tác nhân chính thúc đẩy tiến trình OLAND trong môi trường Mất nitơ trong hệ thống được cho là xảy ra thông qua quá trình oxy hóa.
NH4 +-N thành N2 với NO2 - như là chất nhận điện tử Hydroxylamine kích thích khử
NH 4 + -N thành NO 2 Enzyme Hydroxylamine oxidoreductase (HAO) giữa vai trò quan trọng trong quá trình loại bỏ nitơ.
Firth và Edwards (2000) đã nghiên cứu vi khuẩn khử nitơ trong điều kiện nuôi cấy nghèo dinh dưỡng, phân tích ảnh hưởng của chiều cao cột nước, nồng độ carbon, nồng độ nitrat và nitrit, cùng mật độ tế bào đến quá trình khử nitrat Kết quả cho thấy chiều cao cột nước không tác động đáng kể đến quá trình khử nitrat của P stutzeri ở các mức 1, 2, 4 và 7 cm Ngoài ra, sự gia tăng nồng độ succinate từ 12.5 đến 50 mmol/lít làm tăng nồng độ khí N2 sản sinh Nồng độ NO2- và NO3- tối ưu cho quá trình khử nitơ thành N2O và N2 lần lượt là 15 và 17 mmol/lít Cuối cùng, mật độ tế bào cũng ảnh hưởng đến quá trình khử nitrat, với sự gia tăng mật độ từ 6.9 x 10^7 tế bào/ml lên 2.75 x 10^8 tế bào/ml dẫn đến nồng độ N2 tăng từ 40 mmol/lít lên 500 mmol/lít.
Lee et al (2002) đã nghiên cứu đặc điểm quần xã vi khuẩn trong mẫu bùn hoạt tính khử nitrat, đồng thời mô tả các đặc tính của hai dòng vi khuẩn CR-I và CR-II Dòng CR-I được phân lập từ bùn hoạt tính có khả năng khử nitrat cao, trong khi dòng CR-II từ bùn hoạt tính có khả năng khử nitrat thấp Phần lớn các vi khuẩn này thuộc nhóm Gammaproteobacterium, bao gồm các loài gram âm như P putida, P stutzeri và P azotoformans.
Takaya et al (2003) đã quan sát sự tích lũy N2O trong quá trình khử nitrat hiếu khí, cho thấy hầu hết vi khuẩn khử nitrat sản sinh N2O thay vì N2 Trong nghiên cứu, hai dòng vi khuẩn TR2 và K50 được nuôi cấy liên tục, cho thấy khả năng khử nitrat thành N2 với tốc độ lần lượt là 0.9 và 0.03 mol/phút/tế bào ở nồng độ oxy hòa tan (DO) là 39 và 38 mol/lít Đặc biệt, P stutzeri và Paraccocus denitrificans không tạo ra N2 mà sản sinh N2O gấp 10 lần so với hai dòng TR2 và K50 Cả hai dòng vi khuẩn này đều thuộc lớp phụ Betaproteobacteria và thực hiện quá trình khử nitrat đồng thời với sự hấp thu O2.
TR2 và Pseudomonas sp dòng K50, cả dòng này có khả năngứng dụngđể nghiên cứu cơ chế khửnitrat của chúng với sựtích tụ lượng thấp N2O.
Su et al (2001) phân lập vi khuẩn khử đạm dòng NS-2 từ nước thải chăn nuôi.
Dòng NS-2, được xác định là P stutzeri, có khả năng khử nitrat thành N2 trong cả điều kiện hiếu khí và kị khí mà không tạo ra nitrit trung gian, với hiệu suất khử đạt 97% dưới nồng độ 92% oxy không khí Năm 2001, Su et al đã so sánh khả năng khử nitrat hiếu khí của Thiosphaera pantotropha ATCC 35512 với dòng NS-2.
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phương tiện nghiên cứu
3.1.1 Các dòng vi khuẩn khử đạm P stutzeri
Chọn 8 dòng vi khuẩn khử đạm đã phân lập và đang được lưu trữ ở Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Cần Thơ, bao gồm: 7 dòng
P stutzeri (dòng 6Rc, 7Ra, TN5, TN7, D3b, D7a, VT_B1b) và dòng vi khuẩn đối chứng dương AU11.
Bảng 4: Đặcđiểm hình thái của các dòng vi khuẩn Đặcđiểm vi khuẩn Đặcđiểm khuẩn lạc
Dòng vi khuẩn Hình dạng
Que ngắn +++ Tròn Trắng đục Nguyên Mô 1.5
2 D3b Que ngắn ++ Tròn Trắng đục Nguyên Mô 1-1.5
3 D7a Que ngắn ++ Tròn Trắng đục Nguyên Mô 1-1.5
4 TN5 Que ngắn ++ Tròn Trắng đục Nguyên Mô 0,3
5 TN7 Que ngắn ++ Tròn Trắng đục Nguyên Mô 0,5
6 6Rc Que ngắn + Không đều
7 7Ra Que ngắn + Tròn Vàng Bìa nguyên Lài 0,8
(-): không chuyển động; (+): chuyển động chậm; (++): chuyển động nhanh; (+++): chuyển động rất nhanh
Nguồn: Nguyễn Thành Nhân ( 2008), Phạm Mỹ Cẩm ( 2008), Huỳnh Thị Cẩm Tú ( 2009),
Bảng 5: Khả năng phát triển của các dòng vi khuẩn trên môi trường tối thiểu bổ sung NH 4 + , NO 3 - , NO 2 - ở 10mM.
Ngày 1 Ngày 2 Ngày 1 Ngày 2 Ngày 1 Ngày 2
(-): không phát triển; (+): ít phát triển; (++): phát triển tốt; (+++): phát triển rất tốt
Nguồn: Nguyễn Thành Nhân ( 2008), Phạm Mỹ Cẩm ( 2008), Huỳnh Thị Cẩm Tú ( 2009),
3.1.2 Nước thải chăn nuôi heo
Nước thải chăn nuôi heo được lấy từ trại chăn nuôi heo Nguyễn Trần Tường Bá, xã
Song Bình, huyện Chợ Gạo, tỉnh Tiền Giang.
3.1.3 Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm
Bình tam giác: 125 ml, 500 ml, 2000 ml. Đĩa petri.
Tủ cấy vi sinh vật (Pháp).
Tủ ủ vi sinh vật (Đức).
Máy lắc mẫu GFL 3005 (Đức).
Nồi khử trùng nhiệtướt Pbinternational (Đức).
Máy quang phổ kế(Spectrophotometer).
Máy vi tính phân tích và lưu trữ sốliệu.
* Môi trường BM và BM/NO 3 - được bổ sung với PS-1 (5ml/l), vitamine V8 (1%) và VS-salt (5ml/l) (Su et al, 2001).
Môi trường BM/NO3 -(pH = 7.5): BM bổsung KNO3 2g/l
Pyridoxine hydrochloride 0,1 g/100ml, Thiamine hydrochloride 0,05 g/100ml,
* Môi trường Minimal (pH = 6,8) (Sikorski et al, 2002)
1 ml dung dịch khoáng vi lượng,
100 ml nước biển nhân tạo,Điều chỉnh bằng KOH.
