Bài 2: Định lượng vi sinh vật kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng chẩn đoán điều trị Trung tâm Xét nghiệm, Đại học Y tế cơng cơng TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Chuẩn đầu học Sau học xong, sinh viên có khả năng: Giải thích nguyên lý, ý nghĩa vai trò kỹ thuật sinh học phân tử định lượng vi sinh vật Diễn giải kỹ thuật Realtime PCR ứng dụng định lượng vi sinh vật Phiên giải số ứng dụng định lượng chẩn đốn điều trị TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Phương pháp định lượng ? ● Là phương pháp để xác định số lượng vi sinh vật mẫu ● Trả lời cho câu hỏi: “Hàm lượng vi sinh vật mẫu bao nhiêu?” TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Các phương pháp định lượng thơng thường Phương pháp đếm trực tiếp Phương pháp đếm khuẩn lạc Phương pháp đếm khuẩn lạc màng lọc Phương pháp đo độ đục Phương pháp MPN (most probable number) ● Đơn vi tính: tế bào/ml CFU/ml MPN/ml tế bào/g CFU/g MPN/g TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Phương pháp đếm trực tiếp ● Mật độ vsv đơn bào có kích thước lớn nấm men, men, tảo … xác định trực tiếp buồng đếm kính hiển vi TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Đếm trực tiếp buồng đếm hồng cầu Pha lỗng mẫu cần đếm cho nhỏ buồng đếm có khoảng - 10 tế bào TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Cách đếm tế bào buồng đếm Ưu điểm nhược điểm Ưu điểm: cho biết số lượng VSV Nhược điểm: dễ nhầm lẫn, độ xác khơng cao, khơng thích hợp cho huyền phù vsv có mật độ thấp Khắc phục nhược điểm pp đếm trực tiếp ???? TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP 10 102 103 104 105 106 Cycle 11 Cycle 13 Cycle 15 Cycle 19 Cycle 23 Cycle 26 Cycle 29 Cycle 31 Cycle 33 Cycle 34 Cycle 36 Cycle 39 C.41 Mẫu chưa biết [C] C.39 C.36 Standard curve C.34 C.33 C.31 Cycle 41 C.29 21 10 102 103 104 105 106 Định lượng tuyệt đối (2) • Ngồi ra, phải xây dựng gen nội kiểm tra (internal control): • Là đoạn DNA đích gây đột biến (cùng primer với DNA đích khác biệt trình tự khuếch đại dễ phát hiện) • Nhằm phát yếu tố gây ức chế PCR diện dung dịch chạy PCR • Được pha vào mẫu thử lượng 22 TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP E%=PCR efficiency (90%-105%) R=Corelation coefficiency (>0.990) E = 10-1/slope E% = (E-1) x 100% E=10-1/slope = 10 -1/-3.425 = 1.959 E% =(1.959 - 1) x 100% =2395,9 53 Định lượng tương đối (1) • Có xuất gen tham chiếu (reference gene) • Có cách: • Sử dụng đường chuẩn • Sử dụng mẫu chuẩn (calibrator) TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Định lượng tương đối (2) • Có sử dụng đường chuẩn: KQ tỷ lệ target gene reference gene mẫu thử Copies of target gen Copies of reference gen Dilution curve target gene ‘copy number’ target gene experimental ‘ p e Dilution curve reference gene TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Định lượng tương đối (3) • Sử dụng mẫu chuẩn: • Calibrator mẫu (dịng tế bào) có tỷ lệ target gene reference gene ổn định • Áp dụng thuật tốn • KQ tỷ lệ target gene mẫu thử so với calibrator sau đồng với reference gene TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Quy trình xét nghiệm hỗ trợ điều trị HBV TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Quy trình xét nghiệm hỗ trợ điều trị HBV TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Quy trình xét nghiệm hỗ trợ điều trị HBV TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Quy trình xét nghiệm hỗ trợ điều trị HBV TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Định type xác định đột biến kháng thuốc điều trị HBV TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Câu hỏi lượng giá Real-time PCR kỹ thuật: A Phân tách DNA B Khuếch đại DNA C Xác định trình tự DNA D Sao chép DNA TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Câu hỏi lượng giá Kỹ thuật Realtime PCR sử dụng để: A Xác định tác nhân gây bệnh có gen chất DNA B Xác định tác nhân gây bệnh có gen chất RNA C Xác định đồng thời nhiều tác nhân gây bệnh D Định lượng tác nhân gây bệnh mẫu phân tích TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Tài liệu tham khảo Nguyễn Vũ Trung, Vi sinh – ký sinh trùng lâm sàng, tập 1, Nhà xuất Y học, 2014 (Trang 35-45) James Versalovic, Karen C Carroll, Guido Funke, James H Jorgensen, Marie Louise Landry, David W Warnock, Manual of Clinical Microbiology, Fifth Edition, ASM, 2011 (Trang 1171-1235) TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Tài liệu tham khảo 3.George Manuselis Connie R.Mahon, Text Book of Diagnostic Microbiology, Second Edition, Elsevier Health Sciences, 2000 (Chương 13) Jawetz, Melnick, Adelberg, Medical microbiology, 2013 (Chương 11) McGraw-Hill, Molecular Microbiology, 2012 (Trang 1085-1099) TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP ... 1400000000 120 0000000 1000000000 AMOUNT OF DNA 16 32 64 128 25 6 5 12 1, 024 2, 048 4,096 8,1 92 16,384 32, 768 65,536 131,0 72 2 62, 144 524 ,28 8 1,048,576 2, 097,1 52 4,194,304 8,388,608 16,777 ,21 6 33,554,4 32 67,108,864... Sau học xong, sinh vi? ?n có khả năng: Giải thích ngun lý, ý nghĩa vai trò kỹ thuật sinh học phân tử định lượng vi sinh vật Diễn giải kỹ thuật Realtime PCR ứng dụng định lượng vi sinh vật Phiên giải... 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 10000000000 1000000000 100000000 10000000 1000000 100000 10000 1000 100 10 10 15 20 25 30 35 PCR CYCLE NUMBER Cách xác định