ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng, thời gian, địa điểm nghiên cứu
2.1.1.1 Đối tượng nghiên cứu xây dựng quy trình chế tạo bộ sinh phẩm
- 01 chủng nấm C neoformanschuẩn ATCC (American Type Culture
Collection - Hệ thống Chủng chuẩn của Mỹ) mã số ATCC® 90113
Hình 2.1 Chủng chuẩn nấm C neoformans ATCC @ 90113
(Chủng chuẩn phục vụ cho nghiên cứu này)
- 07 chủng C neoformans nuôi cấy từ dịch não tủy bệnh nhân người Việt Nam có ký hiệu là Vn_N17, Vn_N41, Vn_N57, VN_N58, Vn_N61, Vn_N117, Vn_N132
- Các chủng vi nấm thuộc giống Candida gây bệnh thường gặp như: C albicans, C tropicalis, C krusei, C parapsilosis, C glabrata
- Các chủng vi khuẩn gây bệnh ở người: Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Streptococcus suis, Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa
2.1.1.2 Đối tượng nghiên cứu đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định của bộ sinh phẩm
Bộ sinh phẩm nested PCR #A011- 02 sản phẩm của mục tiêu 1;
- 01 chủng nấm C neoformanschuẩn mã số ATCC @ 90113;
Tại Bệnh viện Quân y 103, 30 mẫu dịch não tủy của bệnh nhân có triệu chứng viêm màng não nhưng không nhiễm nấm C neoformans đã được thu thập và kiểm tra bằng phương pháp nuôi cấy cùng bộ sinh phẩm C neoformans PCR Kit EP-42720 của Norgen.
+ 20 mẫu dịch não tủy được gây nhiễm nấm C neoformans giả định
(mẫu dịch não tủy không nhiễm nấm được thêm tế bào nấm C neoformans vào) – được sử dụng như mẫu dương
+10 mẫu dịch não tủy không nhiễm nấm – sử dụng như chứng âm
Tại Bệnh viện Quân y 103, Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương, Bệnh viện Chợ Rẫy và Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch, 51 chủng nấm C neoformans đã được phân lập từ dịch não tủy của bệnh nhân Các chủng nấm này đã được xác nhận thông qua phương pháp nuôi cấy, soi xác định hình thái bằng nhuộm mực tàu và định loài bằng sinh học phân tử.
- 120 mẫu dịch não tủy của bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng viêm màng não thu thập ở Bệnh viện Quân y 103 và Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch
- Địa điểm thu thập mẫu bệnh phẩm dịch não tủy, nuôi cấy phân lập nấm
+ Khoa Vi sinh - Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch;
+ Khoa Vi sinh - Bệnh viện Chợ Rẫy;
+Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương
- Địa điểm xây dựng quy trình, chế tạo bộ sinh phẩm
+ Labo Trung tâm nghiên cứu Y Dược học Quân sự - Học viện Quân y;
+ Labo nấm Bộ môn Ký sinh trùng côn trùng – Học viện Quân y
- Địa điểm đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định của bộ sinh phẩm
+ Khoa Vi sinh - Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch;
+ Viện kiểm định Quốc gia về vắc xin và sinh phẩm y tế.
Dụng cụ, vật liệu, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
Nguyên vật liệu và trang thiết bị đóng vai trò quan trọng trong công việc nuôi cấy tế bào, phân lập nấm và thực hiện các thử nghiệm sinh học phân tử Các thiết bị này bao gồm khoa học, sinh phẩm, hóa chất, vật liệu tiêu hao và môi trường cơ bản, tất cả đều cần thiết để đảm bảo quy trình nghiên cứu diễn ra hiệu quả.
2.2.1 Cơ sở vật chất và trang thiết bị, máy móc
Phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp độ 2 được trang bị đầy đủ các khu vực nuôi cấy tế bào, xử lý bệnh phẩm, và các thiết bị cần thiết cho quy trình PCR Trong đó, bao gồm máy ly tâm lạnh Mikro 22R (Hettech, Đức), tủ an toàn sinh học (Nuaire, Hàn Quốc), tủ lạnh âm sâu (Esco, Singapore; Sanyo, Nhật), và máy PCR (Eppendorf, Đức; ABI).
The article lists essential laboratory equipment, including the Biorad gel imaging system from the USA, the Applo CLP 300 electrophoresis unit, Eppendorf micropipettes and incubators, the Gyromax 737R vortex mixer, and a Sharp microwave from China.
+ Các hóa chất cơ bản: Cồn Ethanol 70 0 , ETDA, đường Glucose, dung dịch NaCl 0,9%, dung dịch mực tàu;
+ Môi trường tăng sinh nấm: Sabouraud + Chloramphenicol;
+ Enzyme phá màng lyticase (Sigma);
+ Bộ kít tách chiết ADN QiAamp® DNA mini kit của hãng Qiagen (Code
+ Bộ kít tách chiết ADN của nấm/nấm men Fungi/Yeast Genomic DNA Isolation Kit (Cat # 27300, Norgen Biotek Corp)
+ Hóa chất điện di: gel agarose (Serva, Đức), dung dịch TBE 10X (Corning, Mỹ), thang DNA chuẩn 100bp hoặc 50bp (Invitrogen), Loading dye (Promega), redsafe…
+ Các cặp mồi cho các phản ứng PCR do công ty Integrated DNA Technologies (IDT) - Mỹ cung cấp theo yêu cầu của luận án cụ thể như sau:
Bảng 2.1 Các mồi chung khuếch đại gen đích vi nấm
Tên mồi Trình tự (5’-3’) Kich thước sản phẩm khuếch đại
ITS1 TCC GTA GGT GAA CCT GCG G 555bp ở
Mirhendi SH và CS (2001) ITS4 TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC
CN4 ATC ACC TTC CCA CTA ACA CATT 135bp của C neoformans
Guizhen L và CS (2002) CN5 GAAGGGCATGCCTGTTTGAGAG
2.2.3 Các hóa chất, sinh phẩm khác
+ Master mix cho realtime PCR (Thermofisher, #K0351);
+ Dung dịch Mg 2+ nồng độ 25mM (Lot: 00097122);
+ Nước khử ion dùng cho sinh học phân tử (Corning, Mỹ);
+ Môi trường Sabouraud agar (Code: VM241138, Merk, Đức);
+ Dung dịch Redsafe (Intron, Hàn Quốc)
2.2.4 Dụng cụ, phụ tùng, vật tư tiêu hao
+ Ống falcon 15 (Corning, Mỹ); Đầu côn có filter 10 QSP (TF140-20-
Q, Mỹ); Đầu côn có filter 200 QSP (TF140-200-Q, Mỹ); Đầu côn có filter
Các thiết bị và vật tư y tế cần thiết cho phòng thí nghiệm bao gồm 1000 QSP (TF140-1000-Q, Mỹ), ống tube chạy PCR và ống tube realtime PCR (QSP, Mỹ), ống Eppendorf 1.5ml (QSP, Mỹ), khay giữ lạnh bằng nhựa, đĩa petri nhựa, khẩu trang y tế (Việt Nam), găng tay y tế không bột HD-MED (Malaysia) và các vật dụng văn phòng như giấy, bút, sổ ghi chép.
Phương pháp nghiên cứu
Chủngchuẩn và các chủng C neoformans phân lập ở Việt Nam
Xác định các điều kiện cho PCR1 Đánh giá độ tương đồng với nuôi cấy, soi tươi và bộ sinh phẩm của Norgen
Thiết lập quy trình kỹ thuật nested –PCR chẩn đoán C neoformans
Xác định ngưỡng phát hiện trên panel chuẩn dương
Xây dựng quy trình chế tạo bộ sinh phẩm nested - PCR
Chế tạo bộ sinh phẩm nested – PCR chẩn đoán C neoformans ở quy mô phòng thí nghiệm
Xác định các điều kiện kỹ thuật nested -
Xác định các điều kiện cho PCR2
Xác định tính đặc hiệu trên các mẫu chuẩn âm Đánh độ ổn định trên mẫu C neoformans chuẩn ACTT
90113 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu trên mẫu chuẩn và mẫu nhiễm C neoformans giả định
Kiểm định bộ sinh phẩm tại viẹn kiểm đinh QG về vắc xin và sinh phẩm y tế
- Mẫu xây dựng quy trình kỹ thuật nested – PCR chẩn đoán nhiễm nấm
Chủng chuẩn C neoformans mã số ATCC ® 90113 và bảy chủng được phân lập từ dịch não tủy tại Bệnh viện Quân y 103 và Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch Ngoài ra, còn có hai chủng C albicans, bao gồm một chủng chuẩn ATCC ® 90028 và một chủng từ Việt Nam.
+ Chủng C tropicalis: 01 chủng Việt Nam;
+ Chủng C krusei: 01 chủng Việt Nam;
+ Chủng C parapsilosis: 01 chủng Việt Nam;
+ Chủng C glabrata: 01 chủng Việt Nam;
Các chủng vi khuẩn gây bệnh ở người có nguồn gốc từ Việt Nam, bao gồm Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae và Streptococcus pneumoniae, đã được giải trình tự và đăng ký trên GenBank vào năm 2017.
Escherichia coli, Streptococcus suis, Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa: Mỗi loài 01 chủng
- Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm
+ 20 bộ sinh phẩm nested PCR #A011-02 do Học viện Quân Y sản xuất;
+ 20 mẫu dịch não tủy gây nhiễm giả định;
+ 10 mẫu dịch não tủy không nhiễm nấm;
Trong nghiên cứu, 51 chủng nấm C neoformans đã được phân lập từ dịch não tủy của bệnh nhân Việt Nam tại các cơ sở y tế như Bệnh viện Quân y 103, Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch, Bệnh viện Chợ Rẫy và Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương.
+ 120 mẫu dịch não tủy của bệnh nhân có triệu chứng viêm màng não thu thập ở Bệnh viện Quân y 103 và Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch
- Đánh giá tính ổn định của bộ sinh phẩm
06 bộ sinh phẩm nested PCR #A011-02 do Học viện Quân Y sản xuất
+ Chủng mẫu chuẩn mua từ ATCC (American Type Culture Collection - Hệ thống Chủng chuẩn của Mỹ) ký hiệu là: ATCC® 90113 (C neoformans) và ATCC ® 90028 (C albicans)
Tại bốn bệnh viện, bao gồm Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương, Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch, Bệnh viện Chợ Rẫy và Bệnh viện Quân y 103, sẽ tiến hành thu thập dịch não tủy từ tất cả bệnh nhân có triệu chứng viêm màng não trong khoảng thời gian từ tháng 4 đến tháng 12 năm 2013 Tất cả mẫu dịch não tủy sẽ được soi tươi và nuôi cấy để xác định sự hiện diện của C neoformans Các chủng C neoformans sau đó sẽ được kiểm tra loài bằng phương pháp sinh học phân tử trước khi áp dụng vào quy trình kỹ thuật nested – PCR Một số chủng vi nấm đã được giải trình tự và đăng ký vào ngân hàng gen vào năm 2017 và 2018.
Mẫu làm chứng âm được phân lập từ bệnh nhân ở Việt Nam, bao gồm các chủng vi khuẩn và vi nấm Việc định loại các chủng này dựa vào các dấu hiệu hình thái điển hình và được xác thực bằng phương pháp sinh học phân tử, theo các nghiên cứu đã được công bố trên các tạp chí quốc tế.
Mẫu phục vụ cho thử nghiệm giả định bao gồm dịch não tủy không nhiễm nấm, thu thập từ bệnh nhân có triệu chứng viêm màng não hoặc nghi ngờ viêm màng não không do nấm C neoformans Các mẫu này đã được loại trừ bằng phương pháp soi tươi, nuôi cấy và xét nghiệm PCR với bộ sinh phẩm của Norgen tại Bệnh viện Quân y 103.
Trong giai đoạn từ tháng 10 năm 2015 đến tháng 10 năm 2017, mẫu dịch não tủy đã được chọn để thử nghiệm bộ sinh phẩm ở thực địa, tập trung vào các bệnh nhân có triệu chứng viêm màng não đến khám tại Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch và Bệnh viện Quân y 103.
2.3.3.1 Xây dựng quy trình chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nấm C neoformans
Chuẩn bị mẫu nghiên cứu bằng cách thu thập 270 mẫu dịch não tủy từ bệnh nhân viêm màng não tại 04 bệnh viện ở Việt Nam, trong đó đã nuôi cấy và phân lập thành công 51 chủng nấm Cryptococcus neoformans Từ đó, 07 chủng nấm tiêu biểu được chọn để xây dựng quy trình nghiên cứu.
+ Tăng sinh tạo nguồn chủng từ chủng nấm C neoformans chuẩn ATCC
+ Tạo panel dịch treo nấm của chủng chuẩn và chủng phân lập ở Việt Nam;
+ Tách chiết ADN của chủng nấm C neoformans chuẩn và của các chủng phân lập ở Việt Nam;
+ Tách chiết ADN của vi khuẩn, các nấm men khác Cryptococcus neoformans, HBV, ADN người để làm ADN chuẩn âm;
+ Giám định phân tử các chủng C neoformans phân lập ở Việt Nam;
+ Giám định phân tử các vi khuẩn làm chuẩn âm;
+ Tạo panel ADN của chủng chuẩn và chủng phân lập ở Việt Nam
- Xây dựng quy trình kỹ thuật nested-PCR xác định nấm C neoformans
Lựa chọn cặp mồi phù hợp, tối ưu hóa thành phần phản ứng và chu trình nhiệt của kỹ thuật nested-PCR Các nội dung chủ yếu bao gồm:
+ Lựa chọn cặp mồi phù hợp cho phản ứng PCR1 và PCR2 + Chuẩn hóa thành phần của phản ứng PCR1 và PCR2 (như mục 2.3.5.17)
+ Chuẩn hóa chu trình nhiệt của phản ứng PCR1 và PCR2 + Xác định ngưỡng phát hiện của kỹ thuật nested-PCR
- Xây dựng bộ sinh phẩm nested-PCR xác định C neoformans Tạo chuẩn dương và chuẩn âm
+ Chuẩn dương của C.neoformans được tạo từ chủng nấm chuẩn ATTC
Để tạo ngân hàng nồng độ thích hợp, cần lấy 5 mẫu nấm chuẩn đã được cấy chuyển và tách chiết ADN, đảm bảo thu được ít nhất 1ml ADN với nồng độ trung bình khoảng 11 ng/µl Từ nồng độ ADN nấm chuẩn ban đầu, tiến hành pha loãng theo bậc thang 2 (5 lần), bậc thang 5 (3 lần) và bậc thang 10 (4 lần) để tạo ra dãy chuẩn dương với các nồng độ khác nhau Dãy chuẩn dương này sẽ được sử dụng trong phản ứng PCR nhằm xác định ngưỡng phát hiện của phản ứng Chuẩn dương cần được chọn cao hơn ngưỡng phát hiện 1 lần; ví dụ, nếu ngưỡng phát hiện là 10^-2 ng/µl (10pg/µl), thì chuẩn dương nên được sử dụng ở mức 100 pg/µl.
Chứng chuẩn âm là ADN tách chiết từ dịch não tủy của người không nhiễm nấm C.neoformans, nhưng có thể nhiễm các ký sinh trùng khác Các mẫu này đã được xác định không nhiễm nấm thông qua nuôi cấy và kỹ thuật PCR Đồng thời, nồng độ của các mẫu chuẩn âm tương tự với nồng độ của chứng chuẩn dương khi có sự hiện diện của các ký sinh trùng khác.
Chuẩn bị hỗn hợp PCR cho bộ kít
Dự kiến xây dựng bộ sinh phẩm cho việc thực hiện 100 phản ứng PCR với hai hình thức đóng gói
Dạng 1: Gồm 02 loại hỗn hợp phản ứng (master mix) với đầy đủ các thành phần của phản ứng PCR lần 1 và phản ứng PCR lần 2; chỉ cần thêm ADN khuôn vào là thực hiện phản ứng PCR
Dạng 2: Gồm nhiều loại hỗn hợp phản ứng được chia ra một cách hợp lý các thành phần trong các tube, khi thực hiện sẽ hướng dẫn trộn các hỗn hợp phản ứng với nhau theo các tỷ lệ nhất định và thêm ADN khuôn để thực hiện phản ứng PCR
Hỗn hợp phản ứng được bảo quản trong các ống nhựa sạch không chứa DNAase và RNAase thể tích 2,0 ml nắp xoắn
Số phản ứng là 100 nhưng thực tế chuẩn bị khoảng 120 phản ứng nhằm đảm bảo cho kiểm tra bộ kít và hao hụt trong quá trình thao tác
Lựa chọn dạng đóng gói của bộ sinh phẩm
Để đánh giá tính ổn định của mỗi dạng kit, cần lấy 01 bộ kít ngay sau khi sản xuất và kiểm tra sau 1 tuần, 1 tháng với 20 mẫu dương tính và 10 mẫu âm tính đã được xác định từ dịch não tủy.
Lựa chọn cách đóng gói có tính ổn định cao hơn
Xây dựng hướng dẫn sử dụng bộ sinh phẩm
Hướng dẫn sử dụng cho bộ sinh phẩm cần bao gồm các thông tin quan trọng như cấu thành sản phẩm với các thành phần cụ thể, hướng dẫn xử lý mẫu trước khi tiến hành xét nghiệm, quy trình xét nghiệm chi tiết và cách diễn giải kết quả đạt được.
Kiểm tra chất lượng bộ sinh phẩm và hoàn thiện sản phẩm
Với mỗi lô sản xuất lấy một lượng từ 5-10 hỗn hợp phản ứng PCR; các loại chứng để kiểm tra đánh giá chất lượng
Sau khi kiểm tra chất lượng đạt tiêu chuẩn, các thành phẩn của bộ kit sẽ được đóng gói cho 100 phản ứng, dán nhãn và bảo quản ở nhiệt độ ≤ - 20 o C
2.3.3.2 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định của bộ sinh phẩm
- Chuẩn bị mẫu để đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu
Lấy 03 mẫu đã cấy chuyển từ mẫu nấm chuẩn C neoformans ATCC®
Nghiên cứu về 90113 và 51 chủng nấm C neoformans phân lập từ dịch não tủy tại Việt Nam cho thấy sau khi nuôi cấy, 2-3 khuẩn lạc sẽ được cho vào dung dịch nước muối sinh lý và trộn đều để tạo thành dịch treo Độ đục của dịch treo được đo để xác định mật độ nấm trong 1 ml, sau đó thêm dung dịch NaCl 0,9% để điều chỉnh độ đục về 0,5 McFarland, tương đương với 1-5 x 10.
Chuẩn bị mẫu chuẩn dương
Chọn 02 mẫu nấm chuẩn C neoformans ATCC® 90113 và 13 chủng nấm C neoformans phân lập từ dịch não tủy tại Việt Nam đã được hiệu chuẩn về nồng độ 1-5 x 10 6 CFU/ml
Tiếp tục pha loãng các dịch treo trên bằng dung dịch NaCl 0,9% theo cấp số nhân để tạo các dung dịch có nồng độ từ 10 6 CFU/ml xuống
10 2 CFU/ml (ngưỡng phát hiện đã được xác định ở phần trước)
Sử dụng 02 nồng độ: Nồng độ cao 10 5 CFU/ml và nồng độ thấp
10 2 CFU/ml sử dụng bộ sinh phẩm nested PCR #A011-02 để đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm
Tổng cộng có 30 mẫu chuẩn dương (15 mẫu x 2 nồng độ) được sử dụng để đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu
Chuẩn bị mẫu dịch não tủy giả định
+ Chọn mẫu nấm chuẩn C neoformans ATCC® 90113 đã được hiệu chuẩn về nồng độ 1-5 x 10 6 CFU/ml và 20 mẫu DNT không nhiễm nấm
+ Pha loãng mẫu nấm chuẩn vào 20 mẫu dịch não tủy không nhiễm nấm C neoformans
Phương pháp kiểm soát nhiễu và sai số trong nghiên cứu
Xây dựng và tuân thủ các SOP hướng dẫn cụ thể là rất quan trọng Hồ sơ biểu mẫu cần được ghi chép đầy đủ, và số liệu phải được nhập hai lần bởi hai người độc lập để đảm bảo tính chính xác và minh bạch.
Phương pháp phân tích và xử lý số liệu
Phân tích số liệu dựa trên các phần mềm chuyên biệt cho sinh học phân tử như Blast và ClustalX để xác định tính đặc hiệu của bộ mồi
- Kỹ thuật phân tích các trình tự ADN các công cụ tin sinh học như BioEdit, Mega 7.0.9
- Kỹ thuật so sánh trình tự gen thu được với trình tự trên ngân hàng gen sử dụng công cụ https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi;
Các số liệu định tính được thu thập từ hình ảnh nuôi cấy và hình ảnh PCR, cùng với việc tính tỷ lệ dương tính, nhằm xác định nồng độ của các thành phần phản ứng như Mg2+, mồi và ADN khuôn Bên cạnh đó, việc xác định ngưỡng phát hiện và chu trình nhiệt của phản ứng, bao gồm nhiệt độ bám mồi và số chu kỳ nhiệt, cũng rất quan trọng.
- Các số liệu được ghi chép, mã hóa và xử lý bằng phần mềm y xã hội học SPSS 20.0
Dữ liệu được phân tích dựa trên các chỉ số quan trọng như độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương, giá trị tiên đoán âm và chỉ số Kappa để đánh giá mức độ chính xác và hiệu quả của các phương pháp chẩn đoán.
- Cách tính độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm trên các nền mẫu khác nhau như sau [78, 89, 90]:
Độ nhạy và độ đặc hiệu lâm sàng của phương pháp xét nghiệm chẩn đoán được xác định dựa trên các mẫu chuẩn dương và chuẩn âm, theo các tiêu chí được quy định trong mục 2.6.2.
Độ nhạy của một xét nghiệm chẩn đoán là tỷ lệ giữa số kết quả dương tính thật và tổng số trường hợp dương tính thực sự Công thức tính độ nhạy giúp xác định khả năng của xét nghiệm trong việc phát hiện đúng các trường hợp bệnh.
Trong đó: Pse là độ nhạy; TP: số lượng mẫu dương tính thật (true positive);
FN: số lượng mẫu âm tính giả (false negative)
Độ đặc hiệu của một xét nghiệm chẩn đoán được định nghĩa là tỷ lệ âm tính thật, tức là tỷ lệ người không mắc bệnh có kết quả xét nghiệm âm tính Công thức tính độ đặc hiệu là: [công thức].
P là độ đặc hiệu của xét nghiệm; TN là số lượng mẫu âm tính thật (true negative), và FP là số lượng mẫu dương tính giả (false positive) Giá trị tiên đoán dương được định nghĩa là tỷ lệ giữa số kết quả xét nghiệm dương tính thật sự và tổng số kết quả dương tính, được tính theo công thức cụ thể.
Trong đó: PPV: giá trị tiên đoán dương; TP: số lượng dương tính thật (true positive); FP: số lượng dương tính giả (false positive)
Giá trị tiên đoán âm (NPV) là tỷ lệ cho thấy khả năng một kết quả xét nghiệm âm tính thực sự phản ánh tình trạng không mắc bệnh, được tính toán theo công thức cụ thể.
- Cách tính chỉ số phù hợp chẩn đoán giữa 2 phương pháp:
Nested-PCR Phương pháp xét nghiệm khác Tổng
(+) a (dương tính thật) c (dương tính giả) a+c (-) b (âm tính giả) d (âm tính thật) b+d
Chỉ số Kappa (K): K= Po−Pe
K : là chỉ số tương đồng Kappa giữa 2 phương pháp xét nghiệm
Po: là tỉ lệ 2 phương pháp xét nghiệm cho kết quả giống nhau (cùng âm hoặc cùng dương)
Pe: là tỉ lệ phù hợp mong muốn N: là tổng số mẫu nghiên cứu Độ mạnh của K:
0 – 0,4: yếu ; 0,41 – 0,6: trung bình; 0,61 – 0,8: tốt ; 0,81 – 1: rất tốt (hoàn toàn thống nhất)
Đạo đức trong nghiên cứu
Nghiên cứu này tuân thủ các quy định về đạo đức trong y học, với đề cương đã được hội đồng y đức của Học viện Quân Y và Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương phê duyệt.
Nhiễm sai số và cách hạn chế
Nấm C neoformans là một loại nấm có khả năng tồn tại trong nhiều môi trường khác nhau, bao gồm không khí và bụi, dẫn đến nguy cơ tạp nhiễm trong quá trình nghiên cứu Để đảm bảo độ chính xác trong chẩn đoán, các phòng xét nghiệm vi ký sinh tại các Học viện quân Y và các bệnh viện như Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương, Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch và Bệnh viện Chợ Rẫy đã được trang bị tiêu chuẩn an toàn sinh học cấp II Các phòng xét nghiệm được thiết kế theo nguyên tắc một chiều, phân chia rõ ràng giữa khu vực sạch và khu vực bẩn nhằm giảm thiểu tạp nhiễm Nghiên cứu này bao gồm việc thu thập mẫu và xét nghiệm tại nhiều địa điểm với sự tham gia của một đội ngũ lớn, nhằm đảm bảo chất lượng và giảm thiểu sai số Trước khi tiến hành, đề tài đã xây dựng một đề cương nghiên cứu chi tiết, quy trình thu thập mẫu và xét nghiệm rõ ràng Các cán bộ tham gia đều được tập huấn theo quy trình chuẩn để đảm bảo sự đồng nhất trong mọi hoạt động nghiên cứu, từ đó hạn chế sai sót do sử dụng các phương pháp khác nhau.
Theo nghiên cứu về quản lý chất lượng xét nghiệm, 80% sai sót liên quan đến quá trình nhập và xử lý số liệu trước và sau xét nghiệm Để giảm thiểu sai số, dữ liệu trong nghiên cứu được hai người nhập độc lập trên cùng một biểu mẫu thống nhất, sau đó tiến hành so sánh và làm sạch số liệu để đảm bảo tính chính xác trong quá trình phân tích.
Mặc dù không thể hoàn toàn loại bỏ sai số, nghiên cứu đã áp dụng các biện pháp cơ bản nhằm giảm thiểu sai số đến mức tối thiểu, từ đó đảm bảo độ chính xác cao cho kết quả nghiên cứu.
Hạn chế của đề tài
Số lượng bệnh nhân mắc viêm màng não do nấm C neoformans tương đối ít, điều này ảnh hưởng đến khả năng đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của các bộ sinh phẩm được phát triển.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Kết quả xây dựng quy trình kỹ thuật chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C neoformans
3.1.1 Kết quả giám định loài vi nấm Cryptococcus neoformans để sử dụng cho nghiên cứu
Trong giai đoạn từ năm 2013 đến 2015, chúng tôi đã thu thập 270 mẫu dịch não tủy từ bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng viêm màng não tại bốn bệnh viện: Bệnh viện Quân y 103, Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch, Bệnh viện Bệnh nhiệt đới Trung ương và Bệnh viện Chợ Rẫy Mục đích của việc thu thập này là phục vụ cho nghiên cứu xây dựng quy trình chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR Tất cả 270 mẫu đã được nuôi cấy để phân lập nấm.
C.neoformans trên môi trường Sabouraud
Kết quả cho thấy, có 51 mẫu nuôi cấy dương tính với nấm men và có hình thái phù hợp với C neoformans (Bảng 3.1)
Bảng 3.1 Kết quả thu thập và phân lập nấm C neoformans
TT Địa điểm thu thập mẫu
Mẫu lựa chọn để xây dựng quy trình nested - PCR
3 BV Bệnh Nhiệt đới Trung ương
Trong tổng số 270 mẫu dịch não tủy được thu thập từ bệnh nhân viêm màng não, có 51 trường hợp viêm màng não do nấm C neoformans, chiếm tỷ lệ 18,89%.
Hình 3.1 Mẫu nấm C neoformans thu thập tại thực địa Việt Nam
Tất cả 51 mẫu nấm dương tính đã được xác định bằng kỹ thuật PCR-RFLP theo phương pháp của Mirhendi và cộng sự (2006) Kết quả cho thấy, 51/51 mẫu đều có kích thước sản phẩm PCR và kết quả cắt giới hạn tương thích với C neoformans như đã mô tả trong nghiên cứu của Mirhendi và cộng sự (Hình 3.2 và Hình 3.3).
Hình 3.2 Sản phẩm PCR với cặp mồi ITS1, ITS4 của một số mẫu nấm
Trong hình, giếng số 1 chứa chứng âm, giếng số 5 là thang ADN chuẩn 100bp Các giếng từ số 1 đến số 11 lần lượt là sản phẩm PCR của các mẫu nấm được ký hiệu là N57, N61, N420, N426, N427, N432, N453, N458, và N471.
Hình 3.3 Kích thước các mảnh cắt giới hạn sản phẩm PCR bằng enzyme
MspI của một số mẫu nấm C neoformans
Trong hình, giếng số 1 là đối chứng dương với nấm C tropicalis, trong khi giếng số 8 chứa thang ADN chuẩn kích thước 100 bp Các giếng từ số 2 đến 7 và giếng số 9 đến 11 lần lượt đại diện cho sản phẩm cắt giới hạn của các mẫu nấm được ký hiệu N57, N61, N420, N426, N427, N432, N453, và N458, N471.
Kết quả giải trình tự và so sánh ngẫu nhiên một số mẫu cho thấy chúng đều thuộc về C neoformans Trình tự của 06 mẫu đại diện đã được đăng ký trên ngân hàng gen NCBI với các mã số được liệt kê trong bảng 3.2 dưới đây.
Bảng 3.2 Tỷ lệ tương đồng nucleotide của 06 mẫu trong nghiên cứu với các trình tự tham chiếu trên ngân hàng gen
Tên mẫu Mã số trên genbank
Trình tự tham chiếu Loài nấm Tỷ lệ tương đồng
Bảng 3.2 cho thấy, các chủng C neoformans phân lập ở Việt Nam được đăng ký trên ngân hàng gen có tỷ lệ tương đồng cao với nucleotide trình tự tham chiếu (> 99%)
Dựa trên kết quả định loại, 07 mẫu được lựa chọn để xác định các điều kiện của kỹ thuật nested-PCR phát hiện C neoformans
3.1.2 Kết quả thiết kế/lựa chọn mồi cho kỹ thuật nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C neoformans
3.1.2.1 Kết quả lựa chọn trình tự cặp mồi cho phản ứng nested PCR
Từ năm 1990 đến 2014, chúng tôi đã thống kê các bài báo trong và ngoài nước sử dụng kỹ thuật PCR để nghiên cứu định loại nấm C neoformans, đánh dấu thời điểm bắt đầu cho các nghiên cứu trong lĩnh vực này.
Bảng 3.3 Các phương pháp sinh học phân tử được áp dụng để định loại nấm C neoformans 1990 - 2014
STT Tác giả Gen đích Năm Phương pháp
1 Mitchell và cs ITS rRNA 1994 PCR
2 Rappelli và cs ITS rRNA 1998 Nested - PCR
3 Mirhend ITS + 5,6S RNA 2001 PCR-RFLP
4 Bialek và cs 18S rDNA 2002 Nested PCR + qPCR
5 Guizenluo và cs LAC1, CAP64 2002 Multiplex PCR
7 Meyer và cs URA5 2003 PCR-RFLP
8 Takahashi và cs ITS rRNA 2003 Nested PCR
9 Paschoal và cs ITS + 5,6S RNA 2004 PCR
10 Hafner và cs Microsatellitle 2005 PCR finger printing
11 Shahindokht ITS rRNA 2006 Semi nested PCR
12 Enache-A và cs CAP59 2007 AFLP
13 Levy và cs 18S/28S rRNA 2008 real-time PCR
14 Leal và cs JEC21 2008 Multiplex PCR
15 Capoor và cs Microsatellitle 2008 RADP PCR
16 Vincent Veron ITS rRNA 2009 Real-time PCR
17 Saha và cs 18S rRNA 2009 PCR
18 Martins JEC21 2010 Real-time PCR
19 Qishui và cs VAD1 2012 Real-time PCR
20 Reinwald và cs 18S rRNA 2013 Nested PCR
Sau khi phân tích và so sánh các cặp mồi được nghiên cứu bởi các tác giả, chúng tôi đã quyết định lựa chọn hai cặp mồi cho phản ứng nested – PCR.
Cặp mồi cho phản ứng PCR1 theo Mitchell TG và CS, 1994; SH Mirhendi và CS, 2001:
- ITS1 F: 5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’
- ITS4 R:5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’
Khuếch đại đoạn gen có kích thước 555-556 bp đặc trưng cho nấmC neoformans
Cặp mồi cho phản ứng PCR 2 theo Guizhen Luo và CS, 2002:
- CN4 F: 3’-ATC ACC TTC CCA CTA ACA CAT T-5’
- CN5 R: 3’-GAA GGG CAT GCC TGT TTG AGA G-5’
Khuếch đại đoạn ADN có kích thước 135-136 bp nằm trong đoạn giao gen ITS1-ITS2
Hình 3.4 Minh họa đoạn gen khuếch đại với 02 cặp mồi được lựa chọn
Lựa chọn được cặp mồi ITS1 và ITS4 cho phản ứng PCR1, cặp mồi CN4, CN5 nằm trong đoạn ITS cho phản ứng PCR2
Kết quả đánh giá chất lượng của cặp mồi so với tiêu chuẩn:
Bảng 3.4 Đánh giá chất lượng của mồi so với tiêu chuẩn Các chỉ tiêu chất lượng
Cặp mồi không chênh nhau > 5 0 C
Kết quả từ bảng 3.4 cho thấy các chỉ tiêu kỹ thuật của mồi ITS1, ITS4 cho PCR1 và CN4, CN5 cho PCR2 đều đạt tiêu chuẩn chất lượng, đáp ứng yêu cầu lựa chọn cặp mồi cho phản ứng PCR lồng.
3.1.2.2 Kết quả đánh giá tính đặc hiệu của mồi
- Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của mồi bằng lý thuyết
Hình 3.5 Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của cặp mồi ITS1-ITS4 bằng phần mềm Primer Blast
So sánh trình tự mồi của từng cặp mồi với trình tự gen của nấm
C.neoformans bằng phần mềm Primer-Blast Kết quả ở hình 3.5 chỉ ra cặp mồi ITS1, ITS4 của phản ứng PCR1 hoản toàn tương thích với trình tự gen của loài nấm C neoformans với kích thước sản phẩm PCR ước tính là 555 bp
Hình 3.6 Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của cặp mồi CN4-CN5 bằng phần mềm Primer Blast
Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của cặp mồi CN4 và CN5 bằng phần mềm Primer Blast cho thấy tính tương thích đạt 100%, với độ dài sản phẩm PCR dự kiến là 135 bp.
- Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của bộ mồi bằng thực nghiệm
+ Kết quả thực nghiệm giải trình tự
Tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi lựa chọn và ADN mẫu chuẩn C neoformans ATCC® 90113, sau đó giải trình tự sản phẩm PCR Kết quả giải trình tự được so sánh với các trình tự chuẩn trên GeneBank qua phần mềm ClustalX Sử dụng chương trình Blast trên NCBI để tìm kiếm trình tự tương đồng, cho thấy kết quả đồng 99% đến 100% so với các trình tự C neoformans trong ngân hàng gen.
Hình 3.7 So sánh trình tự ADN nấm chuẩn được khuếch đại bởi cặp mồi
ITS1, ITS4 và các trình tự C neoformans trên ngân hàng gen
+ Kết quả thực nghiệm trên các nền mẫu khác nhau Bảng 3.5 Đánh giá tính đặc hiệu của cặp mồi trên các nền mẫu khác nhau
TT ADN thử nghiệm Băng có kích thước
Qua bảng 3.5 nhận thấy cặp mồi được lựa chọn có tính đặc hiệu cao với
C neoformans; Không bắt chéo với các loài vi nấm, vi khuẩn khác
Khi khảo sát tính đặc hiệu của cặp mồi ITS1, ITS4 và cặp mồi CN4, CN5, cả trên lý thuyết lẫn thực nghiệm, cho thấy hai cặp mồi này có độ đặc hiệu cao, chỉ khuếch đại ADN của nấm C neoformans mà không ảnh hưởng đến ADN của các vi nấm, vi khuẩn hay sinh vật khác.
3.1.3 Kết quả xác định các điều kiện cho kỹ thuật nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C neoformans
Trước khi chuẩn hóa các điều kiện của phản ứng PCR trên các mẫu chuẩn cần tạo các dãy (panel) chứng chuẩn dương và chứng chuẩn âm
Dịch treo nấm có nồng độ 0,5 Marfaland được tách chiết ADN và đo nồng độ
Bảng 3.6 Nồng độ AND thu được từ chủng chuẩn C neoformans Mẫu nấm Nồng độ ADN (ng/àl) OD (260/280)
Theo bảng 3.6, nồng độ trung bình ADN của mẫu chuẩn là 11,12 ng/µl với độ tinh sạch đạt 1,97, cho thấy quá trình tách chiết ADN đã đạt được độ tinh khiết cần thiết.
3.1.3.1 Kết quả tạo panel chuẩn dương
Từ nồng ADN nấm chuẩn ban đầu, lấy 1 thể tích nhất định pha loãng với nước khử ion theo bậc thang 2 (5 lần), bậc thang 5 (3 lần) và bậc thang 10
Bảng 3.7 Kết quả tạo panel chuẩn dương nấm C neoformans
TT Cdd đầu (ng/àl) Vdd (àl) VH20 (àl) Cdd sau (ng/àl) MS panel
Hình 3.8 Kết quả PCR theo panel nồng độ Giếng 1: Chứng âm; Giếng 2: chứng dương
Giếng 3 - giếng 7: Nồng độ ADN từ 11,12 đến 0,01112ng
Giếng 8: Thang chuẩn 50 bp Giếng 9- giếng 13: Nồng độ ADN từ 0,001112đến 0,0001112 ng
3.1.3.2 Kết quả tạo dãy chứng chuẩn âm
Chứng chuẩn âm là dung dịch chứa ADN của con người cùng với ADN của vi khuẩn, virus hoặc các loại vi nấm khác không phải là C.neoformans Nồng độ ADN trong các dung dịch này dao động từ 50 pg/µl đến 20 ng/µl.
Bảng 3.8 Danh mục chứng chuẩn âm
TT AND vi khuẩn, vi nấm, người
Ký hiệu Số tube Thể tích mỗi tube (àl)
Kết quả bảng 3.8 cho thấy đã tạo ra 13 mẫu chứng chuẩn âm với tổng số 130 tube, mỗi tube chứa 30 àl ADN
3.1.3.3 Kết quả xác định các điều kiện cho phản ứng PCR1
Kết quả tối ưu các điều kiện của phản ứng PCR1 phát hiện nấm
C.neoformans với mẫu thực nghiệm là chủng C neoformans chuẩn
Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của bộ sinh phẩm chẩn đoán nhiễm nấm C neoformans trong dịch não tủy
3.2.1 Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của bộ sinh phẩm trong phòng thí nghiệm
3.2.1.1 Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của bộ sinh phẩm trên các ADN mẫu chuẩn
- Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm
Bảng 3.26 Kết quả thử nghiệm bộ sinh phẩm trên mẫu
Stt Loại mẫu thực hiện Kết quả phản ứng PCR
Dương tính ((+)/tổng số) Âm tính ((-)/tổng số)
1 Chuẩn dương nuôi cấy nồng độ 10 5 CFU/ ml 30/30 0/30
2 Chuẩn dương nuôi cấy nồng độ 10 2 CFU/ ml 30/30 0/30
4 Mẫu DNT không nhiễm C neoformans 0/20 20/20
Qua kết quả ở bảng 3.26 nhận thấy với việc đánh giá 30 mẫu chuẩn dương, ở hai nồng độ khác nhau là nồng độ thấp 10 2 CFU/ml và nồng độ cao
10 5 CFU/ml; 20 mẫu chuẩn âm (10 chuẩn âm không có ADN là NaCl 0,9% và
Mỗi mẫu chuẩn âm và dương trong nghiên cứu về ADN dịch não tủy đều được kiểm tra lặp lại hai lần Kết quả cho thấy 100% mẫu chuẩn dương cho sản phẩm PCR với kích thước 135 bp, đặc hiệu cho C neoformans, trong khi 100% mẫu chuẩn âm không xuất hiện sản phẩm PCR nào.
Bảng 3.27 Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm trên các mẫu chuẩn
Kết quả kit nested – PCR
Mẫu chuẩn (kiểm tra bằng nuôi cấy và bộ sinh phẩm Norgen)
Có C neoformans Không có C neoformans
Tổng số 60 40 100 Độ nhạy Se = 100%, Độ đặc hiệu Sp = 100%
Bảng 3.27 cho thấy bộ sinh phẩm nested PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu 100% trong việc chẩn đoán nhiễm nấm C.neoformans từ dịch não tủy, khi thử nghiệm với các mẫu nấm C.neoformans chuẩn và mẫu chuẩn âm.
- Kết quả đánh giá độ ổn định của bộ sinh phẩm
Bảng 3.28 Kết quả đánh giá tính ổn định của bộ sinh phẩm Loại mẫu thử Thời gian sau sản xuất
Kết quả thử nghiệm bộ sinh phẩm nested-PCR
1 Mẫu dương tính Ngay sau khi SX
2 Mẫu dương tính 3 Tháng sau
3 Mẫu dương tính 6 Tháng sau
4 Mẫu dương tính 9 Tháng sau
5 Mẫu dương tính 12 Tháng sau SX
Qua bảng 3.28 thấy rằng ở cả ba điều kiện bảo quản bộ sinh phẩm nested-PCR phát hiện nấm C neoformans trong dịch não tủy ở nhiệt độ -
20 0 C, -35 0 C và -80 0 C vẫn đảm bảo tính ổn định sau 12 tháng sản xuất
3.2.2.2 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu trên mẫu DNT nhiễm C neoformans giả định
Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm nested-PCR trên các mẫu dịch não tủy giả định được thể hiện ở bảng 3.29
Bảng 3.29 Kết quả phản ứng nested PCR với các mẫu DNT giả định tt Loại mẫu thực hiện Kết quả phản ứng PCR
Dương tính ((+)/tổng số) Âm tính ((-)/tổng số)
1 DNT giả định nồng độ 10 5 CFU/ ml 40/40 0/40
2 DNT giả định nồng độ 10 2 CFU/ ml 34/40 6/40
Kết quả từ bảng 3.29 chỉ ra rằng việc pha loãng các mẫu dịch não tủy nhiễm nấm C neoformans ở các nồng độ khác nhau đã dẫn đến việc lựa chọn 40 mẫu, bao gồm 20 mẫu nồng độ thấp 10^2 CFU/ml và 20 mẫu nồng độ cao 10^5 CFU/ml Trong số đó, có 10 mẫu chuẩn âm không chứa ADN (nước muối NaCl 0,9%) và 10 mẫu chuẩn âm có ADN từ dịch não tủy không nhiễm C neoformans Thử nghiệm với bộ sinh phẩm nested-PCR #A011-02 cho thấy kết quả tích cực với mẫu nhiễm giả định ở nồng độ cao 10^5 CFU/ml.
40 mẫu dương tính chiếm 100%; với mẫu nhiễm nấm giả định nồng độ thấp
10 2 CFU/ ml có 34/40 mẫu dương tính chiếm 85%, 6/40 mẫu âm tính chiếm 15%; 100% mẫu không nhiễm nấm có kết quả âm tính
Bảng 3.30 Kết quả đánh giá của trên các mẫu nhiễm giả định nồng độ
Kết quả kit Nested – PCR
Tổng số 40 40 80 Độ nhạy Se = 100% Độ đặc hiệu Sp = 100%
Qua bảng 3.30 nhận thấy khi gây nhiễm giả định trên dịch não tủy với nồng độ cao thì độ nhạy và độ đặc hiệu vẫn đảm bảo 100%
Bảng 3.31 Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm trên các mẫu nhiễm giả định nồng độ 10 2 CFU/ ml
Kết quả kit Nested – PCR
Tổng số 40 40 80 Độ nhạy Se = 85% Độ đặc hiệu Sp = 100%
Bảng 3.31 là kết quả khi gây nhiễm với nồng độ thấp10 2 CFU/ ml xấp xỉ ngưỡng phát hiện thì độ nhạy giảm đi rõ chỉ là 85%
Bảng 3.32 Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm trên các mẫu nhiễm giả định nồng độ từ 10 2 CFU/ ml trở lên
Kết quả kit Nested – PCR
Có C neoformans Không có C neoformans
Tổng số 80 40 120 Độ nhạy Se = 92,5% Độ đặc hiệu Sp = 100%
Bộ sinh phẩm nested-PCR đạt độ nhạy 92.5% và độ đặc hiệu 100% khi xét nghiệm với các mẫu nhiễm giả định từ ngưỡng phát hiện trở lên Giá trị tiên đoán dương của phương pháp này là 100%, trong khi giá trị tiên đoán âm đạt 87%, với độ tin cậy 95%.
3.2.2 Kết quả đánh giá của bộ sinh phẩm trong các mẫu dịch não tủy lâm sàng
3.2.2.1 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu trên các mẫu C neoformans phân lập ở Việt Nam
Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm nested-PCR trên 51 mẫu nuôi cấy có mật độ nấm khác nhau
Sử dụng bộ sinh phẩm nested-PCR, chúng tôi đã tiến hành phân tích 51 mẫu ADN của các chủng nấm C neoformans khác nhau được phân lập tại Việt Nam, với mỗi chủng chạy 2 mẫu Kết quả cho thấy 100% sản phẩm PCR2 sau khi điện di đều xuất hiện các băng có kích thước 135 bp, điều này xác nhận sự phù hợp với đặc điểm của nấm C neoformans.
Bảng 3.33 Kết quả thử nghiệm bộ sinh phẩm trên các chủng C.neoformans phân lập ở Việt Nam
Stt Loại mẫu thực hiện Kết quả phản ứng PCR
Dương tính ((+)/tổng số) Âm tính ((-)/tổng số)
Hình 3.17 trình bày kết quả khuếch đại gen đích của nấm C neoformans thông qua kỹ thuật nested-PCR Trong đó, giếng 1 là chứng âm, giếng 2 là chứng dương, các giếng 3-10 chứa các mẫu ADN thử nghiệm, và giếng 11 là thang ADN chuẩn với kích thước 100bp.
Bảng 3.34 Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm trên các chủng C neoformans phân lập ở Việt Nam
Kết quả kit nested – PCR
C.neoformans phân lập ở VN Tổng số
Có C neoformans Không có C neoformans
Tổng số 102 40 142 Độ nhạy Se = 100% Độ đặc hiệu Sp = 100%
Kết quả từ bảng trên cho thấy rằng, qua việc đánh giá trực tiếp 51 mẫu nuôi cấy và 20 mẫu chuẩn âm (bao gồm 10 mẫu không có ADN và 10 mẫu có ADN từ dịch não tủy không chứa C neoformans), bộ sinh phẩm nested – PCR #011 – 02 đạt độ nhạy và độ đặc hiệu 100%.
3.2.2.2 Kết quả đánh giá độ tương đồng của bộ sinh phẩm trên mẫu DNT bệnh nhân viêm màng não
Kết quả xét nghiệm từ các phương pháp khác nhau trên mẫu dịch não tủy của bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng viêm màng não được trình bày trong bảng 3.35.
Bảng 3.35 Kết quả thử nghiệm bộ sinh phẩm trên các mẫu DNT của bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng VMN
Stt Loại mẫu thực hiện Phương pháp xét nghiệm
Soi tươi nhuộm mực tàu (+/TS)
1 DNT thu thập tại BV Phạm Ngọc Thạch
2 DNT thu thập tại BV Quân Y 103
Kết quả xét nghiệm dịch não tủy từ 120 bệnh nhân có biểu hiện lâm sàng viêm màng não cho thấy 8 mẫu (6,67%) dương tính với C neoformans qua phương pháp nuôi cấy Trong số này, 7 mẫu cũng cho kết quả dương tính khi áp dụng phương pháp soi tươi nhuộm mực tàu, bộ sinh phẩm nested –PCR #011 – 02 và bộ sinh phẩm của Norgen.
- Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu với phương pháp nuôi cấy trên các mẫu lâm sàng
Bảng 3.36 Độ nhạy, độ đặc hiệu so với phương pháp nuôi cấy Kết quả kit nested – PCR
Phương pháp nuôi cấy Tổng số Dương tính Âm tính
Tổng số 8 112 120 Độ nhạy Se = 87,5% Độ đặc hiệu Sp = 100%
Giá trị tiên đoán dương: 100%
Giá trị tiên đoán âm: 99,1%
Kết quả so sánh giữa bộ sinh phẩm nested-PCR và phương pháp nuôi cấy cho thấy độ nhạy đạt 87,5% và độ đặc hiệu 100% Giá trị tiên đoán dương là 100%, trong khi giá trị tiên đoán âm là 99,1% Trong thử nghiệm, có một mẫu dương tính với nuôi cấy nhưng âm tính với các phương pháp xét nghiệm khác, cho thấy khả năng mẫu này có thể bị ngoại nhiễm với C neoformans.
- Đánh giá độ tương đồng với phương pháp soi tươi nhuộm mực tàu
Bảng 3.37 Độ tương đồng so với phương pháp soi tươi nhuộm mực tàu
Kết quả kit nested – PCR
Phương pháp soi tươi nhuộm mực tàu
Tỉ lệ phù hợp quan sát Po: 96,7%
Tỷ lệ phù hợp mong muốn Pe: 89,0% K = 0,697
Kết quả xét nghiệm giữa bộ sinh phẩm nested-PCR và phương pháp soi tươi nhuộm mực tàu cho thấy tỉ lệ phù hợp quan sát Po đạt 96,7% và tỷ lệ phù hợp mong muốn Pe là 89,0% Hệ số tương đồng giữa hai phương pháp này là 0,697 (bảng 3.37).
- Đánh giá độ tương đồng với bộ sinh phẩm của Norgen
Bảng 3.38 Độ tương đồng so với bộ sinh phẩm của Norgen Kết quả kit nested – PCR
Bộ sinh phẩm Norgen Tổng số Dương tính Âm tính
Tỉ lệ phù hợp quan sát Po: 100%
Tỷ lệ phù hợp mong muốn Pe: 89,0% K = 1
Kết quả xét nghiệm giữa bộ sinh phẩm nested-PCR và bộ sinh phẩm Norgen cho thấy tỷ lệ phù hợp quan sát Po đạt 100% và tỷ lệ phù hợp mong muốn Pe là 89,0% Hệ số tương đồng giữa hai phương pháp xét nghiệm cho thấy sự tương đồng hoàn toàn.
3.2.3 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và kiểm định chất lượng bộ sinh phẩm chế tạo ra
3.2.3.1 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở
Dựa trên nghiên cứu về độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của phương pháp nested-PCR, chúng tôi đã xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho bộ sinh phẩm chẩn đoán nhiễm nấm C neoformans.
Bảng 3.39 Tóm tắt tiêu chuẩn cơ sở
TT Chỉ tiêu đánh giá Tiêu chuẩn cơ sở
1 Nhận dạng Phản ứng PCR2 cho bang kích thước 135 bp đặc trưng cho nấm C.neoformans
4 Ngưỡng phỏt hiện ≥ 10pg/àl
5 Thời gian phát hiện Không quá 48 giờ
3.2.3.2 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm nested-PCR tại Viện kiểm định quốc gia về vắc xin và sinh phẩm y tế
Viện kiểm định quốc gia về vắc xin và sinh phẩm y tế đã cấp giấy chứng nhận kết quả kiểm định số 00515/SPCD-NC cho bộ sinh phẩm chẩn đoán nested-PCR phát hiện nấm C neoformans, số lô #A011-02 do Học viện quân y sản xuất Bộ sinh phẩm này có độ nhạy đạt 98,11% và độ đặc hiệu 100%, với ngưỡng phát hiện là 0,4pg/µl khi thực hiện trên bộ mẫu chuẩn của nhà sản xuất.
