VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu nghiên cứu
Chủng vi sinh vật Tetragenoccocus halophilus CH6-2 đã được phân lập và bảo quản tại bộ sưu tập phòng thí nghiệm C10, Đại học Bách Khoa Hà Nội Để đảm bảo độ thuần chủng, chủng này được lưu giữ ở nhiệt độ -20°C trong môi trường lỏng MRS có 25% glycerol Quá trình hoạt hóa diễn ra trong môi trường MRS lỏng với 5% NaCl, và chủng được nhân giống trong môi trường MRS trong 3 ngày ở 35℃ Cuối cùng, sinh khối được thu được bằng phương pháp ly tâm lạnh ở 4℃ với tốc độ 6000rpm.
− Các chất mang: Maltodextrin, Monosodium Glutamate, Sucrose và Skim milk sử dụng trong ngành thực phẩm.
Bảng 2.1 Danh mục thiết bị
STT Thiết bị Xuất xứ
1 Tủ ấm, tủ sấy Binder (Đức) Đức
2 Nồi hấp tiệt trùng Liên Xô
3 Tủ an toàn sinh học cấp II (Hàn Quốc) Hàn Quốc
4 Bể ổn nhiệt (Đức) Đức
5 Máy li tâm Sorvall (Mỹ) Mỹ
7 Cân (Precisa XT 320M - Thuỵ Sĩ) Thuỵ Sĩ
8 Máy cất nước (Hamilton – Anh) Anh
9 Kính hiển vi quang học Nhật Bản
10 Mấy sấy phun Buchi mini 209B Thuỵ Sĩ
Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu, hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác, que trang,đèn cồn và nhiều dụng cụ hoá sinh thông dụng khác
Bảng 2.2 Danh mục hoá chất
STT HÓA CHẤT XUẤT XỨ
1 Đường Glucose, Sucrose Việt Nam
2 Cao thịt (meat extract) Trung Quốc
3 Cao nấm men (Yeast extract) Việt Nam
NaCl, acetat natri, triamon citrate, MgSO4, MnSO4, NaCl, CaCO3, ninhydrin, pyridine,
8 Enzym Flavouzyme, Alcalase Đan Mạch
Phương pháp nghiên cứu
Quy trình nghiên cứu tạo chế phẩm vi khuẩn T halophilus CH6-2:
Hình 2.1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu sản xuất chế phẩm T halophilus CH6-2
2.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng sống sót của T halophilus CH6-2 trong quá trình sấy phun và bảo quản
2.2.1.1 Chuẩn bị sinh khối trước quá trình sấy
Mẫu vi sinh vật từ mục 2.1 được chuyển sang môi trường MRS để nhân giống với OD600nm đạt 1 và ủ ở 35℃ Sau 3 ngày, tế bào nuôi được thu bằng phương pháp ly tâm lạnh ở 6000 v/ph, 4℃ trong 10 phút, và sinh khối ướt thu được sau đó sẽ được định lượng.
Sinh khối ướt được xác định độ ẩm thông qua phương pháp sấy đến khối lượng không đổi ở nhiệt độ 105℃, với độ ẩm đạt 88.75% Mật độ vi sinh vật trong sinh khối ướt dao động từ 10.7 đến 11 logCFU/g.
2.2.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy thu sinh khối tới khả năng sống sót của T halophilus CH6-2
Vi sinh vật được thu thập từ mục 2.1 sẽ được chuyển sang hai môi trường nhân giống MRS và M7, và được nuôi trong điều kiện 35℃ trong 72 giờ Sau ba ngày, tế bào nuôi sẽ được thu bằng phương pháp ly tâm lạnh ở tốc độ 6000 vòng/phút, tại 4℃ trong 10 phút Cuối cùng, sinh khối ướt thu được sẽ được định lượng.
Phối trộn với dung dịch chất mang SM+MSG (tỉ lệ 19/1), tỉ lệ sinh khối/chất mang là 1/3 (w/w)
2.2.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ sinh khối/chất mang tới khả năng sống sót của T halophilus CH6-2
Sinh khối ướt được thu tại mục 2.2.1.1 được trộn đều với dung dịch chất mang SM+MSG theo tỉ lệ 19/1, với nồng độ chất mang 20% w/w Tỉ lệ phối trộn giữa sinh khối và chất mang là 1/20 và 1/3.
2.2.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất mang tới khả năng sống sót của
Sinh khối ướt thu được tại mục 2.2.1.1 được trộn đều với các dung dịch chất mang khác nhau, với hai tỉ lệ sinh khối chất mang là 1/20 và 1/3 Hỗn hợp này sau đó được sấy phun để hoàn thiện quá trình.
Chuẩn bị các chất mang như sữa tách béo (SM), maltodextrin (MD), monosodium glutamate (MSG), sucrose (S) và trehalose (Tre) được sử dụng trong thực phẩm Hòa tan các chất bảo vệ trong nước cất và tiệt trùng ở nhiệt độ 121℃ trong 15 phút Sữa tách béo sẽ được tiệt trùng ở 110℃ trong 15 phút để hạn chế phản ứng Maillard Sau quá trình tiệt trùng, tiến hành phối trộn các chất trên theo tỷ lệ tương ứng với bảng 2.3 để tạo thành tổ hợp chất bảo vệ mới.
Bảng 2.3 Danh sách chất mang và nồng độ chất mang sấy phun
2.2.1.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện sốc tới khả năng sống sót của T halophilus CH6-2 Điều kiện sốc nhiệt: sinh khối ướt thu tại mục 2.2.1.1 được phối trộn đều trong dung dịch chất mang SM, tỉ lệ sinh khối/chất mang là 1/3 (w/w) và được ủ trong bể ổn nhiệt tại 45, 50, 55℃ trong 15 phút, mẫu kiểm chứng được giữ tại 30℃ Điều kiện sốc áp suất thẩm thấu: tế bào thu được tại mục 2.1 được chuyển sang 2 môi trường nhân giống MRS với các điều chỉnh (1) bổ sung 5% NaCl, (2) bổ sung 12% NaCl, (3) bổ sung 12% NaCl và 1% MSG Canh trường nuôi trong
3 ngày tại 35℃ Sinh khối được thu và phối trộn trong dung dịch chất mang SM, tỉ lệ sinh khối/chất mang là 1/3 (w/w)
2.2.1.6 Các thông số của quá trình sấy phun
Các thông số của quá trình sấy phun được thể hiện dưới bảng:
Bảng 2.4 Thông số của quá trình sấy phun ĐIỀU KIỆN THÔNG SỐ
2.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất mang đến khả năng sống sót của T halophilus CH6-2 trong quá trình sấy đông khô và bảo quản
Sinh khối ướt được chuyển sang môi trường nhân giống MRS với OD600nm đạt 1 và ủ ở 35℃ Sau 3 ngày, tế bào nuôi được thu bằng phương pháp ly tâm lạnh ở 6000 v/ph, 4℃ trong 10 phút Sinh khối thu được được hòa trộn với dịch chất mang theo tỉ lệ 1/2 (w/w) và sau đó được sấy đông khô.
Chuẩn bị chất mang bao gồm sữa tách béo (SM), Monosodium Glutamate (MSG) và Trehalose (Tre), tất cả đều được sử dụng trong thực phẩm Các chất bảo vệ được hòa tan trong nước cất và tiệt trùng ở 121℃ trong 15 phút Sữa tách béo được tiệt trùng ở 110℃ trong 15 phút để hạn chế phản ứng Maillard Sau quá trình tiệt trùng, các chất này được phối trộn đôi một để tạo thành tổ hợp chất bảo vệ mới theo bảng 2.4.
Bảng 2.5 Danh sách chất mang và nồng độ chất mang sấy đông khô
SM+MSG+Tre:3/1 7.2+0.6+0.2 SM+MSG+Tre:1/1 7.2+0.4+0.4
2.2.3.1 Xác định mật độ vi sinh vật
Để tiến hành thí nghiệm, chế phẩm cần được hòa trộn với 1ml nước muối sinh lý vô trùng Sau đó, mẫu được pha loãng bằng ống Eppendorf và chuyển vào đĩa thạch Đĩa thạch sẽ được nuôi ở nhiệt độ 35℃ trong 3 ngày Cuối cùng, tiến hành đếm và tính toán mật độ vi sinh vật theo công thức đã quy định.
Lặp lại thí nghiệm 2 lần
➢ Chang đĩa, ủ trong tủ ấm 3 ngày
➢ Công thức tính mật độ vi sinh vật
2.2.3.2 Xác định khả năng sống sót
Khả năng sống sót của vi sinh vật được chia thành 2 giai đoạn
- Giai đoạn 1: khả năng sống sót của vi sinh vật ngay sau sấy
- Giai đoạn 2: khả năng sống sót của vi sinh vật sau các tháng bảo quản
N, N i : mật độ vi sinh vật sau sấy (hoặc sau các tháng bảo quản) trên 1 gram chế phẩm
N 0 : mật độ chủng trước khi sấy (hoặc khi sấy) trên 1 gram tổng chất khô
∑C: tổng số khuẩn lạc đếm trên đĩa thạch n1,n2: số đĩa đọc kết quả ở 2 nồng độ pha loãng liên tiếp
- Độ giảm mật độ vi sinh vật ∆ LogCFU/g:
N i : mật độ chủng sau sấy (hoặc sau các tháng bảo quản) trên 1 gram chế phẩm
N 0 : mật độ chủng trước khi sấy (hoặc sau khi sấy) trên 1 gram tổng chất khô
2.2.3.3 Xác định độ ẩm của chế phẩm
Chế phẩm được lấy đại diện mẫu, sấy mẫu tại tủ sấy ở nhiệt độ 105℃ tới độ ẩm không đổi
25 m0: khối lượng chế phẩm trước sấy mi: khối lượng chế phẩm sau sấy
2.2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu
Mức độ khác nhau có ý nghĩa của khả năng sống sót được tính toán bằng phần mềm IBM SPSS Statistics 26 Độ tin cậy 95%
