Giới hạn của đề tài: 8 IV Những giả thuyết của đề tài: 8 V Phương pháp và phương tiện nghiên cứu: 8 VI Các bước thực hiện đề tài: 8 PHẦN II: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Xác định chỉ số vật lí, chỉ số hóa học của tinh dầu
II.2.1 Đánh giá cảm quan:
Tinh dầu tần dày lá là chất lỏng màu vàng sáng, trong, nhẹ hơn nước, có mùi thơm dịu.
II.2.2 Xác định chỉ số vật lí:
Tỷ trọng của tinh dầu tại 20 0 C là tỉ số khối lượng tinh dầu ở 20 0 C trên khối lượng của cùng một thể tích nước cất cũng ở 20 0 C.
C á c h x á c đ ị n h : Trước tiên ta rửa sạch bình đo tỷ trọng (tỷ trọng kế) tráng lại bằng etanol rồi sấy thật khô.
Cân tỷ trọng kế rỗng (m0)
Cho nước cất vào đầy tới cổ bình, đậy nút, lau khô phần nước trào Cân khối lượng của bình và nước cất (m )
Với m0 : khối lượng tỷ trọng kế rỗng (g). m1 : khối lượng tỷ trọng kế và nước (g). m2 : khối lượng tỷ trọng kế và tinh dầu (g)
Kết quả: Tính được tỷ trọng của tinh dầu là: dTD = 0.9057
II.2.3 Xác định chỉ số hóa học:
Chỉ số acid (Index Acid):
Chỉ số acid là lượng mg KOH cần thiết để trung hòa các acid tự do có trong 1g tinh dầu Phản ứng này diễn ra khi KOH tác động để trung hòa các acid tự do có mặt trong tinh dầu.
Cho vào erlen 100ml: 10ml etanol và 5 giọt dung dịch phenolphthalein Chuẩn độ hỗn hợp bằng dung dịch KOH 0,1N cho đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 30 giây Sau đó, thêm 1ml tinh dầu và lắc đều để dầu tan hoàn toàn Tiếp tục chuẩn độ dung dịch bằng dung dịch KOH 0,1N cho đến khi màu hồng bền xuất hiện Thực hiện phép đo 3 lần và ghi lại thể tích dung dịch KOH 0,1N (V KOH) sử dụng trong chuẩn độ, sau đó tính kết quả trung bình.
Chỉ số acid được tính theo công thức
VKOH: số ml dung dịch KOH 0.1N dùng chuẩn độ kể từ khi thêm tinh dầu. f: hệ số điều chỉnh nồng độ KOH 0.1N
5,61: số mg KOH có trong 1 ml dung dịch KOH 0.1 N d: tỷ trọng của tinh dầu
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình
Bảng 1:Kết quả xác định chỉ số acid của tinh dầu tần dày láKết luận: Chỉ số acid của tinh dầu tần dày lá là: IA = 3.9157
Chỉ số savon hóa (Index Savon):
Chỉ số xà phòng hóa là lượng mg KOH cần thiết để phản ứng với toàn bộ acid tự do và acid kết hợp dưới dạng ester có trong 1g tinh dầu.
Quá trình savon hóa tinh dầu bao gồm:
KOH trung hoà các acid tự do: KOH + RCOOH RCOOK + H2O và KOH xà phòng hoá các ester: KOH + R 1 COOR 2 R 1 COOK + R 2 OH
Để thực hiện quá trình chuẩn độ, đầu tiên lấy một erlen 100 ml khô và sạch, sau đó cho vào 1 ml tinh dầu và 15 ml KOH 0.1N Đun hỗn hợp trong 1 giờ để savon hóa ester và trung hòa các acid tự do có trong tinh dầu Sau khi để nguội, thêm vào erlen 15 ml nước cất và 5 giọt phenolphthalein, lắc đều Tiến hành chuẩn độ bằng dung dịch HCl 0,1N cho đến khi dung dịch vừa mất màu hồng Thực hiện phép đo ba lần và ghi nhận thể tích dung dịch HCl 0.1N (V1) đã sử dụng trong quá trình chuẩn độ.
Ta thực hiện tương tự với mẫu trắng, ghi thể tích HCl 0,1N (V0) đã chuẩn độ.
Chỉ số savon được tính theo công thức: IS 5,61.F (V 0 V 1 ) d TD
Trong đó: V0: thể tích dung dịch HCl dùng cho mẫu trắng (ml).
V1: thể tích dung dịch HCl dùng cho mẫu tinh dầu (ml). dTD: tỷ trọng của mẫu tinh dầu (g)
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình
Bảng 2:Kết quả xác định chỉ số savon hóa của tinh dầu tần dày lá
Kết luận: Chỉ số savon hóa của tinh dầu tần dày lá là: IS = 40.8082
Chỉ số ester hóa (Index Ester)
Chỉ số ester hóa của tinh dầu là số mg KOH cần thiết để trung hòa lượng acid béo nằm ở dạng ester có trong 1g tinh dầu
Chỉ số ester hóa của tinh dầu bằng hiệu số giữa chỉ số savon và chỉ số acid:
III Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng tinh dầu trong quá trình chưng cất:
Chúng tôi tiến hành khảo sát 4 yếu tố: thời gian để héo nguyên liệu, thời gian chưng cất, lượng nước chưng cất, nguyên liệu xay và không xay.
Nguyên tắc: cố định 3 yếu tố và thay đổi một yếu tố để chọn được mức tối ưu cho yếu tố đó.
Tiếp tục cố định một yếu tố và thay đổi yếu tố khác cho đến khi xác định được 4 mức tối ưu cho từng yếu tố trong quá trình ly trích.
III.1 Khảo sát nguyên liệu xay và không xay: Cố định 3 yếu tố: thời gian để héo nguyên liệu, thời gian chưng cất, lượng nước chưng cất.
Bảng 3: Hàm lượng tinh dầu tần dày lá theo nguyên liệu xay và không xay:
Nguyên liệu Thời gian để héo (giờ)
Thời gian chưng cất (giờ)
Thể tích nước (ml) Khối lượng tinh dầu (gam)
Hình 7: Đồ thị hàm lượng tinh dầu theo nguyên liệu xay và không xay
Nguyên liệu xay nhuyễn cho phép thu được lượng tinh dầu nhiều hơn so với nguyên liệu không xay Điều này là do quá trình xay nhuyễn làm tăng bề mặt tiếp xúc của nguyên liệu với nước, từ đó cải thiện hiệu suất quá trình ly trích.
III.2 Khảo sát thời gian để héo nguyên liệu:
Chúng tôi đã cố định các yếu tố như thời gian chưng cất, lượng nước chưng cất và nguyên liệu xay nhuyễn, đồng thời thay đổi thời gian héo nguyên liệu ở các mốc 0h, 3h, 6h và 9h Sau khi ly trích, chúng tôi sẽ cân và so sánh lượng tinh dầu thu được tại các thời gian khác nhau để xác định thời gian héo tối ưu.
Bảng 4: Hàm lượng tinh dầu tần dày lá theo thời gian để héo:
Thời gian để héo (giờ)
Khối lượng tinh dầu (gam)
Hình 8: Đồ thị hàm lượng tinh dầu theo thời gian để héo
Hàm lượng tinh dầu trong nguyên liệu giảm dần theo thời gian Theo quan sát đồ thị, trong 3 giờ đầu, lượng tinh dầu giảm không đáng kể, nhưng sau đó, mức giảm trở nên rõ rệt hơn Do đó, để tối ưu hóa lượng tinh dầu thu được, việc chưng cất nên được thực hiện ngay sau khi thu hoạch.
Khảo sát thời gian chưng cất 23 III.4 Khảo sát lượng nước chưng cất 24 IV Xác định thành phần hóa học của tinh dầu
Sau khi xác định thời gian héo tối ưu, chúng ta sẽ cố định các yếu tố khác và thay đổi thời gian chưng cất lần lượt là 1h, 1h30, 2h, 2h30, 3h, 3h30 và 4h Mục tiêu là cân và so sánh lượng tinh dầu thu được để xác định thời gian chưng cất tối ưu nhất.
Bảng 5: Hàm lượng tinh dầu tần dày lá theo thời gian chưng cất:
Khối lượng mẫu (gam) Thể tích nước (ml) Thời gian để héo (giờ) Khối lượng tinh dầu (gam)
Hình 9: Đồ thị hàm lượng tinh dầu theo thời gian chưng cất
Hàm lượng tinh dầu thay đổi theo thời gian chưng cất, với sự gia tăng rõ rệt khi thời gian chưng cất được kéo dài Tuy nhiên, sau 2.5 giờ, lượng tinh dầu tăng không đáng kể Do đó, thời gian chưng cất tối ưu để khảo sát các yếu tố khác là 2.5 giờ.
III.4 Khảo sát lượng nước chưng cất:
Với 3 mức tối ưu của 3 yếu tố đã chọn, ta thay đổi lượng nước chưng cất như sau: 300ml, 400ml, 500ml, 600ml, 700ml Cân và ghi lại lượng tinh dầu thu được trong mỗi trường hợp, từ đó xác định được lượng nước chưng cất tối ưu.
Bảng 6: Hàm lượng tinh dầu tần dày lá theo lượng nước chưng cất:
Thời gian chưng cất (giờ)
Thời gian để héo (giờ)
Khối lượng tinh dầu (gam)
Lượng nước chưng cất (ml)
Hình 10: Đồ thị hàm lượng tinh dầu theo lượng nước chưng cất
Kết quả khảo sát cho thấy, với khối lượng mẫu 300 gam và lượng nước chưng cất 500 ml, ta thu được lượng tinh dầu tối ưu nhất.
IV Xác định thành phần hóa học của tinh dầu:
Thành phần hóa học của tinh dầu được xác định bằng phương pháp sắc kí khí ghép khối phổ GC/MS với các điều kiện như sau:
Máy sắc kí khí ghép khối phổ GC-MS: HP 6890
Cột mao quản: dài 30 m, đường kớnh trong 250 àm, lớp phim dày 250 àm.
Nhiệt độ phần bơm mẫu (injector): 250 0 C
Đầu dò khối phổ tứ cực (MSD)
Tốc độ dòng khí mang (He) 0.9 ml/phút, áp suất 6.9 psi
Chương trình nhiệt phân tích: bắt đầu ở 60 0 C, giữ trong 4 phút Sau đó tăng lên
100 0 C, với tốc độ tăng 10 0 C/phút Tiếp tục tăng đến 280 0 C với tốc độ tăng 30 0 C/phút và giữ trong 15 phút.
Bảng 7: Thành phần hóa học của tinh dầu tần dày lá:
STT Thời gian lưu Tên cấu phần Hàm lượng (%)
13 25,759 2,6-dimethyl-6-(4-methyl-3- pentenyl)bicycle[3.1.1]hept-
Nhận xét: Tinh dầu tần dày lá có thành phần chính là: carvacrol (51.468%), beta Cymene(23.363%), beta Caryophyllene (8.183%), alpha Bergamotene (5.772%), gamma Terpinene(5.332%).
Thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu tần dày lá
Chuẩn bị 26 V.2 Thí nghiệm 27 VI Định tính thành phần hợp chất tự nhiên có trong cây tần dày lá
Tinh dầu được pha ở những nồng độ khác nhau dựa vào biểu thức:
Trong đó: C: nồng độ tinh dầu ( l -1 )
V: độ pha loãng ( l)Tinh dầu được pha loãng trong dung môi DMSO (Dimethyl Sulfoxide) với nồng độ
Các chủng vi khuẩn thử nghiệm là Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis và nấm men Candida albicans được tăng sinh và cấy trên môi trường chuyên biệt.
Nổng độ vi khuẩn: 1,0.10 6 cfu/ml
Sau khi hoàn nguyên trong dung môi, tiến hành tẩm tinh dầu lên các đĩa giấy vô khuẩn để tạo ra các đĩa giấy có nồng độ tinh dầu thay đổi từ 1 µl/l đến 10^-4 µl/l Sau đó, để các đĩa giấy khô ở nhiệt độ phòng và sử dụng ngay.
Cấy lên đĩa thạch MH (Mueller Hinton): Dùng que gòn nhúng vào huyền dịch vi khuẩn, cấy phủ đầy mặt đĩa thạch theo 3 chiều.
Đặt đĩa cấy đã tẩm dịch trích: Dùng kẹp vô trùng đặt đĩa giấy lên mặt thạch (5 đĩa cho một hộp thạch).
Quan sát đường kính của vòng vô khuẩn và đo đường kính của vòng vô khuẩn:
Có hoạt tính kháng khuẩn: có vòng vô khuẩn (đường kính vòng vô khuẩn > 6 mm).
Không có hoạt tính: Không có vòng vô khuẩn (đường kính vòng vô khuẩn = 6 mm hoặc
