GIỚI THIỆU
Đặt vấn đề
Ô nhiễm môi trường và việc sử dụng hóa chất trong thực phẩm và mỹ phẩm đang làm tăng số lượng gốc tự do trong cơ thể, dẫn đến các bệnh nguy hiểm như ung thư và viêm gan Gốc tự do là các nguyên tử hoặc phân tử có điện tử độc lập, gây tổn thương cho tế bào và làm phát sinh các bệnh thoái hóa Chất kháng oxy hóa có khả năng ngăn ngừa sự oxy hóa do gốc tự do gây ra, giúp bảo vệ sức khỏe Thêm vào đó, khí hậu nóng ẩm tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển, gây ra nhiều bệnh truyền nhiễm và có nguy cơ bùng phát dịch bệnh nếu không được kiểm soát.
Thuốc tổng hợp có thể gây ra nhiều tác dụng phụ ảnh hưởng đến sức khỏe, vì vậy việc tìm kiếm các hợp chất thiên nhiên an toàn và hiệu quả đang ngày càng được chú trọng Chiết xuất từ động, thực vật không chỉ an toàn mà còn có khả năng kháng oxy hóa cao, được nhiều người lựa chọn Việt Nam, với khí hậu và thổ nhưỡng phong phú, là quốc gia nổi bật với sự đa dạng của các loại cây dược liệu Do đó, việc khảo sát và tìm kiếm các loại cây tự nhiên có khả năng chống oxy hóa là rất cần thiết.
Sài đất ba thùy (Wedelia trilobata L.) là một loài thực vật phổ biến ở Việt Nam, đặc biệt nổi bật với hoa chứa nhiều polyphenol có lợi Thuộc họ Cúc, loài cỏ dại này thường mọc thành thảm dày và nở hoa quanh năm Sài đất ba thùy đã được sử dụng trong y học cổ truyền ở nhiều quốc gia như Nam Mỹ, Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ và Việt Nam để điều trị nhiều bệnh Nghiên cứu cho thấy chiết xuất từ hoa của loài này chứa các hợp chất như tannin, flavonoid và phenol, tạo thành nhóm polyphenol chính của Sài đất ba thùy.
Sài đất ba thùy là một loại thảo dược có nhiều tác dụng dược lý quan trọng, bao gồm khả năng kháng oxy hóa, giảm đau, kháng viêm, kháng khuẩn, và chữa lành vết thương Ngoài ra, nó còn có tác dụng diệt ấu trùng, kháng ung thư, bảo vệ gan, điều trị tiểu đường và hỗ trợ các vấn đề sinh sản ở phụ nữ Với những lợi ích này, Sài đất ba thùy có tiềm năng lớn cho việc nghiên cứu sâu hơn về các hoạt động sinh học, đặc biệt là khả năng kháng oxy hóa của nó.
Cấu trúc của các hợp chất polyphenol chứa liên kết không bão hòa, khiến chúng dễ bị oxy hóa khi tiếp xúc với ánh sáng, nhiệt độ, pH, nước và enzym Do đó, việc tăng cường độ ổn định của các hợp chất này là cần thiết bằng cách bảo vệ chúng khỏi các tác hại vật lý và hóa học trước khi ứng dụng Một giải pháp tiềm năng là bao gói các hợp chất polyphenol trong các vật liệu sinh học để bảo vệ chúng khỏi các tác nhân có hại từ môi trường.
Fibroin, một loại protein từ tơ tằm, đã được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp dược phẩm trong nhiều thập kỷ nhờ vào tính linh hoạt và ổn định của nó Với cấu trúc liên kết hydro và tính chất lưỡng tính, fibroin đóng vai trò quan trọng trong kỹ thuật mô, đồng thời là chất mang hiệu quả cho các phân tử kháng oxy hóa như resveratrol, quercetin, curcumin và alpha mangostin Tuy nhiên, trong lĩnh vực dẫn truyền dịch chiết dược liệu, thông tin về khả năng của fibroin còn hạn chế, ngoại trừ một nghiên cứu của Bayraktar và cộng sự về việc tải nạp chiết xuất từ lá olive trong vi hạt fibroin.
Nghiên cứu về chiết xuất từ hoa Sài đất ba thùy (Wedelia trilobata L.) cho thấy nhiều hoạt tính sinh học như kháng oxy hóa, kháng viêm và kháng ung thư Tuy nhiên, hiện tại vẫn còn thiếu thông tin về thành phần hóa học và khả năng kháng oxy hóa của các cao chiết từ hoa này tại Việt Nam Đề tài “Bào chế và khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của hệ vi hạt từ fibroin tơ tằm chứa dịch chiết hoa Sài đất ba thùy” được thực hiện nhằm xác định thành phần hóa học, định lượng polyphenol tổng và khảo sát khả năng kháng oxy hóa của các cao chiết từ MeOH, EtOH 60% và EtOH 96%, cũng như các hệ vi hạt chứa dịch chiết, tạo cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo.
Mục tiêu nghiên cứu
Đề tài nghiên cứu "Bào chế và khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của hệ vi hạt từ fibroin tơ tằm chứa dịch chiết hoa Sài đất ba thùy (Wedelia trilobata L.)" nhằm mục tiêu phát triển các sản phẩm có khả năng chống oxy hóa hiệu quả từ nguồn nguyên liệu tự nhiên Nghiên cứu này không chỉ đóng góp vào việc ứng dụng fibroin tơ tằm trong lĩnh vực y tế và mỹ phẩm mà còn khai thác tiềm năng của hoa Sài đất ba thùy như một nguồn chất chống oxy hóa quý giá.
Định tính một số hợp chất có trong các cao chiết từ hoa Sài đất ba thùy
Định lượng polyphenol tổng có trong các cao chiết từ hoa Sài đất ba thùy
Chiết fibroin từ kén tơ tằm
Bào chế và tải dịch chiết từ cao chiết vào hệ vi hạt fibroin tơ tằm
Đánh giá một số đặc tính hóa lý của các hệ vi hạt fibroin
Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa in vitro của cao chiết hoa Sài đất ba thùy và các hệ vi hạt được tải dịch chiết từ hoa này cho thấy tiềm năng ứng dụng trong lĩnh vực bảo vệ sức khỏe Nghiên cứu này cung cấp thông tin quan trọng về khả năng chống oxy hóa, góp phần vào việc phát triển các sản phẩm tự nhiên có lợi cho sức khỏe.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Hoa Sài đất ba thùy được thu hái từ thành phố Cần Thơ vào tháng 10/2021 Cây Sài đất ba thùy trong nghiên cứu này được xác định dựa trên đặc điểm hình thái theo tài liệu "Cây cỏ Việt Nam" của Phạm Hoàng Hộ.
Nghiên cứu định tính các nhóm hợp chất như alkaloid, flavonoid, steroid, saponin, các chất khử và acid hữu cơ trong cao chiết từ hoa Sài đất ba thùy được thực hiện bằng các dung môi MeOH, EtOH 60% và EtOH 96% Các hợp chất này có ý nghĩa quan trọng trong việc đánh giá giá trị dược lý và ứng dụng của hoa Sài đất ba thùy.
- Chiết fibroin từ kén tơ tằm
- Bào chế và tải dịch chiết từ các cao chiết vào hệ vi hạt fibroin tơ tằm
- Đánh giá một số tính chất hóa lý của hệ vi hạt:
+ Hiệu suất tải dịch chiết của hệ vi hạt và khả năng tải của hệ vi hạt
+ Khả năng giải phóng polyphenol vào môi trường
+ Đánh giá độ kết tinh của các hệ vi hạt sau khi được tải dịch chiết từ các cao chiết
Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa in vitro của cao chiết hoa Sài đất ba thùy và các hệ vi hạt tải dịch chiết từ hoa này cho thấy tiềm năng đáng kể trong việc chống oxy hóa Nghiên cứu này góp phần làm sáng tỏ giá trị sinh học của hoa Sài đất ba thùy, mở ra hướng đi mới cho các ứng dụng trong ngành dược phẩm và thực phẩm.
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 10/2021 đến tháng 2/2022 tại Phòng thí nghiệm Hóa Sinh 2, Bộ môn Hóa học, Khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại học Cần Thơ.
Nội dung và phương pháp nghiên cứu
- Tìm hiểu sơ lược về cây Sài đất ba thùy và đặc điểm của tơ tằm
- Thu mua kén tơ và chiết fibroin từ tơ tằm: bằng phương pháp chiết nóng hỗ trợ vi sóng
Hoa Sài đất ba thùy được thu hái và phơi khô trong bóng râm trong vòng 14 ngày, sau đó được nghiền thành bột mịn bằng máy móc.
Cao chiết hoa Sài đất ba thùy được điều chế thông qua phương pháp ngâm dầm kết hợp siêu âm Cụ thể, 30 g bột hoa Sài đất ba thùy được ngâm dầm với các dung môi trong 3 ngày, sau đó lọc dịch chiết và thêm dung môi tương tự để thực hiện quá trình siêu âm ở 50℃ trong 90 phút Quá trình này được lặp lại 3 lần để chiết kiệt các chất có trong bột hoa Cuối cùng, các dịch chiết được gom lại và cô quay ở áp suất thấp, thu được các loại cao MeOH, EtOH 60% và EtOH 96% từ hoa Sài đất ba thùy.
- Định lượng polyphenol tổng trong bột dược liệu bằng phương pháp đo quang sau khi phản ứng với thuốc thử Folin-Ciocalteu
- Bào chế hệ vi hạt fibroin tơ tằm bằng phương pháp đồng ngưng tụ
- Đánh giá một số tính chất hóa lý của hệ vi hạt:
+ Kích thước: Phương pháp tán xạ ánh sáng động (DLS)
+ Hiệu suất và khả năng tải dịch chiết của hệ vi hạt và khả năng tải: Phương pháp đo quang phổ UV-Vis
+ Khả năng giải phóng polyphenol ra môi trường đệm pH: Phương pháp đo quang phổ UV-Vis
+ Đánh giá độ kết tinh của các hệ vi hạt sau khi được tải dịch chiết từ các cao chiết: Máy quang phổ hồng ngoại FT-IR
Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa in vitro của cao chiết hoa Sài đất ba thùy và các hệ vi hạt chứa dịch chiết từ hoa này cho thấy tiềm năng ứng dụng trong lĩnh vực dinh dưỡng và y học Nghiên cứu này cung cấp thông tin quý giá về khả năng chống oxy hóa của các hợp chất tự nhiên trong hoa Sài đất ba thùy, mở ra hướng đi mới cho việc phát triển sản phẩm chăm sóc sức khỏe.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Hoa Sài đất ba thùy có những đặc điểm nhận dạng đặc trưng, bao gồm hình dáng và màu sắc của hoa Nghiên cứu cũng đã chỉ ra các thành phần hóa học quan trọng có trong hoa, giúp xác định tính chất của nó Đặc biệt, hoa Sài đất ba thùy cho thấy hoạt tính kháng oxy hóa đáng kể, góp phần vào giá trị dinh dưỡng và ứng dụng trong y học.
- Phát hiện thêm ứng dụng tiềm năng của hệ vi hạt fibroin, rút ra những dữ kiện về tương tác lý hóa của hoạt chất với hệ thống
Hoa Sài đất ba thùy, theo Y học cổ truyền Việt Nam, được biết đến với nhiều công dụng quý giá trong việc hỗ trợ điều trị bệnh Nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng loại hoa này có thể được ứng dụng trong sản xuất theo phương pháp hiện đại, mở ra hướng đi mới cho việc phát triển dược phẩm Việc kết hợp giữa tri thức cổ truyền và công nghệ hiện đại hứa hẹn mang lại hiệu quả cao trong việc nâng cao sức khỏe cộng đồng.
Nghiên cứu đã chỉ ra rằng các nguồn dược liệu tự nhiên có tiềm năng lớn trong việc phát triển thuốc, giúp hạn chế việc sử dụng thuốc Tây y với nhiều tác dụng phụ Việc khai thác và ứng dụng các dược liệu thiên nhiên không chỉ hỗ trợ trong phòng ngừa mà còn trong điều trị bệnh một cách hiệu quả và an toàn hơn.
Việc nâng cao giá trị tơ tằm Việt Nam không chỉ góp phần cải thiện kinh tế cho các khu vực nuôi tằm mà còn mở ra cơ hội phát triển dược phẩm hiệu quả trong tương lai.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phương tiện nghiên cứu
3.1.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian: Từ tháng 10/2021 đến tháng 3/2022
- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Hóa Sinh 2 - Bộ môn Hóa học, khoa Khoa học Tự nhiên - Đại học Cần Thơ
3.1.2 Dụng cụ và thiết bị
- Tủ sấy, bếp điện, giấy lọc
- Máy cô quay chân không (BUCHI)
- Cân phân tích (Mettle Toler, Switzerland)
- Becher: 100 mL, 500 mL (Trung Quốc)
- Bình cô quay loại 500 mL (Trung Quốc)
- Ống đong: 10 mL, 50 mL, 100mL, ống nhỏ giọt (Trung Quốc)
- Máy khuấy từ có gia nhiệt (Trung Quốc)
- Máy đo quang phổ JascV-730 (Nhật Bản)
- Máy siêu âm đứng, máy siêu âm
- Máy quang phổ hồng ngoại IR
- Máy lắc ngang, máy ly tâm, máy ly tâm lạnh
Dung môi và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu này được trình bày trong Bảng 3.1
Bảng 3.1 Hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu
Dung môi và hóa chất Ghi chú
MeOH, EtOH 96%, EtOH 60%, NaCl, hydrocloric acid, gallic acid
DPPH (1,1-dipheny-2-picrylhyrazyl), ascobic acid 99%, Folin- ciocalteu
Nước cất, Na2CO3 99,8%, EtOH 96%, acid chlohydric, natri hydroxide, đệm phosphate (pH 7,4)
Trung Quốc Đức Việt Nam
Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Thu và xử lý mẫu
Hoa Sài đất ba thùy được thu hái tại Thành phố Cần Thơ vào tháng 10/2021 Sau khi thu mẫu, các hoa bị sâu và hư hỏng được loại bỏ, sau đó tiến hành phơi khô dưới bóng râm cho đến khi đạt độ khô cần thiết.
Kén tằm: kén tằm giống Bombyx mori M45 được thu thập từ xã Phương Định, huyện Trực Ninh, tỉnh Nam Định
3.2.2 Xác định độ ẩm dược liệu Ðộ ẩm là lượng nước chứa trong 100 g dược liệu Dược liệu tươi thường chứa một lượng nước rất lớn: lá chứa khoảng 60-80% nước, thân và cành chứa khoảng 40-50% nước Không có một dược liệu nào đạt độ khô tuyệt đối (độ ẩm 0%), nhưng đối với mỗi dược liệu đều được quy định một độ ẩm an toàn
Nguyên tắc sấy khô dược liệu là sử dụng sức nóng để bay hơi hoàn toàn lượng nước có trong chúng Bằng cách cân trọng lượng của dược liệu trước và sau quá trình sấy, ta có thể tính toán được phần trăm nước còn lại trong dược liệu khô.
Thí nghiệm xác định độ ẩm của dược liệu theo Dược điển Việt Nam V được thực hiện bằng phương pháp sấy Các dược liệu như lá, rễ, và thân cần được chia nhỏ trước khi đo độ ẩm, trong khi nụ hoa và hạt nhỏ có thể được xác định trực tiếp mà không cần chia nhỏ Độ ẩm của bột dược liệu được đo bằng máy đo độ ẩm Kern Dab.
Cao chiết được chế biến qua phương pháp ngâm dầm kết hợp siêu âm, trong đó dung môi chiết thấm qua màng tế bào của cây, hòa tan các chất bên trong Quá trình thẩm thấu xảy ra giữa các hợp chất trong tế bào và dung môi, cho đến khi đạt được sự cân bằng nồng độ Dưới tác động của siêu âm, dung môi tạo bọt trong các hốc nhỏ của dược liệu, giúp đẩy các hợp chất ra ngoài và hòa tan chúng vào dung môi.
Phương pháp chiết xuất này dễ thực hiện với thiết bị đơn giản và chỉ cần một lượng mẫu cây vừa phải, vì vậy nó được áp dụng trong nghiên cứu này Quy tắc chiết là thực hiện nhiều lần với một lượng dung môi nhỏ mỗi lần Quy trình điều chế cao Sài đất ba thùy từ các dung môi khác nhau được minh họa trong Hình 3.1.
Hoa Sài đất ba thùy khô (112 g) được xử lý bằng cách loại bỏ phần hư, phơi khô ở nhiệt độ phòng thí nghiệm và xay nhỏ thành 96 g bột mịn Đề tài áp dụng phương pháp chiết ngâm dầm kết hợp siêu âm để điều chế cao tổng, với tỷ lệ bột dược liệu:dung môi là 1:60 (w/v) Sau mỗi 24 giờ, dịch chiết được siêu âm ở 50℃ và thu gom, lặp lại 3 lần với tỷ lệ tương ứng Dịch chiết sau đó được lọc qua giấy lọc và cô quay để thu hồi dung môi, cuối cùng thu được dịch chiết cao tổng Công thức tính hiệu suất điều chế cao từ bột nguyên liệu ban đầu được trình bày trong (3.1).
Chiết xuất fibroin từ kén tằm
Fibroin được chiết xuất từ kén tằm Bombyx mori M45 thông qua phương pháp chiết nóng hỗ trợ vi sóng Đầu tiên, 10 g kén tơ tằm được loại bỏ sericin bằng dung dịch Na2CO3 0,5% ở 100℃ trong 1 giờ Sau khi rửa sạch với nước cất và làm khô tự nhiên, sản phẩm được hòa tan vào hỗn hợp CaCl2:H2O:Ca(NO3)2:EtOH theo tỷ lệ 30:45:5:20 Cuối cùng, dung dịch tơ tằm được gia nhiệt bằng lò vi sóng (900 W) trong 2 phút và sau đó được thẩm phân với nước cất qua màng lọc cellulose (10 000 MWCO).
Hình 3.1 Quy trình điều chế các cao hoa Sài đất ba thùy từ các dung môi MeOH,
Quy trình chiết fibroin tơ tằm bắt đầu bằng việc để dung dịch trong 3-5 ngày Sau đó, dung dịch được ly tâm ở tốc độ 10.000 vòng/phút và nhiệt độ 4℃ trong 30 phút để loại bỏ tạp chất Cuối cùng, fibroin tơ tằm được đông khô ở nhiệt độ -55℃ và áp suất 10^-4 Torr, sau đó được bảo quản lạnh để phục vụ cho các thí nghiệm sau này.
Phương pháp định tính thành phần hóa học
Quy trình định tính được thực hiện theo phương pháp phân tích thành phần hóa thực vật đã được cải tiến từ quy trình của Ciuley (Trường Đại học Dược khoa Bucarest, Rumani) Mục tiêu là xác định các hợp chất có trong dịch chiết MeOH, EtOH 96% và EtOH 60%, nhằm đánh giá sơ bộ thành phần hóa học của hoa Sài đất ba thùy.
Mỗi 2 g bột dược được chiết tương tự với các dung môi tương tự như quy trình chiết cao đã nêu ở trên Dịch chiết được cô quay đến còn khoảng 20 mL
3.4.2 Khảo sát sự hiện diện của các nhóm hợp chất có trong các loại cao chiết
3.4.2.1 Khảo sát sự hiện diện của alkaloid
Lấy khoảng 5 mL dịch chiết cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn Hòa cắn trong
4 mL dung dịch HCl 5% Chia dung dịch acid vào 4 ống nghiệm nhỏ Thực hiện định tính alkaloid bằng các thuốc thử Wagner
So sánh kết quả với ống nghiệm đối chứng không có thuốc thử, nếu dung dịch đục hoặc có tủa: Có alkaloid
3.4.2.2 Khảo sát sự hiện diện của flavonoid
Để kiểm tra sự hiện diện của flavonoid, lấy khoảng 3 mL dịch chiết cho vào ống nghiệm lớn và thêm vài giọt dung dịch NaOH loãng Dung dịch sẽ chuyển sang màu vàng, sau đó thêm vài giọt H2SO4 loãng, màu vàng sẽ biến mất hoặc chuyển sang không màu Điều này chứng tỏ có sự hiện diện của flavonoid trong mẫu thử.
Add 0.5 mL of 1% NaOH/EtOH solution to 3 mL of the extract solution, resulting in colors ranging from yellow to orange to red Flavones, isoflavones, flavanones, chalcones, and leucoanthocyanidins will display a yellow color, while flavonols will show colors from yellow to orange, and aurones will produce red to purplish-red hues Additionally, the reaction with concentrated H2SO4 solution is also significant.
Khi nhỏ 0,5 mL dung dịch H2SO4 đậm đặc vào 3 mL dung dịch cao chiết, nếu có sự hiện diện của flavon và flavonol, dung dịch sẽ chuyển sang màu vàng đậm-cam và phát huỳnh quang đặc biệt Trong khi đó, chalcon và auron sẽ tạo ra màu đỏ hoặc xanh dương-đỏ, còn flavanol sẽ cho màu cam đến đỏ.
3.4.2.3 Khảo sát sự hiện diện của saponin
Mỗi 3 mL được cho vào 2 ống nghiệm riêng biệt: Ống 1: 5 mL HCl 0,1N (pH=1) + 3 giọt dung dịch thử Ống 2: 5 mL NaOH 0,1N (pH) + 3 giọt dung dịch thử
Để kiểm tra sự hiện diện của saponin trong mẫu, hãy bịt miệng ống và lắc mạnh trong 1 phút, sau đó để yên và quan sát các cột bọt trong cả hai ống nghiệm Nếu cột bọt ở cả hai ống nghiệm bằng nhau và bọt có độ bền tương tự, có khả năng có saponin triterpen Ngược lại, nếu ống nghiệm có pH 13 có cột bọt cao hơn nhiều so với ống nghiệm pH 1, điều này có thể chỉ ra sự hiện diện của saponin steroid.
3.4.2.4 Khảo sát sự hiện diện của các chất khử
Khi nhỏ 0,5 mL dung dịch thuốc thử Tollens vào 3 mL dung dịch cao chiết, nếu có sự hiện diện của đường khử, sẽ xuất hiện hiện tượng bạc bám vào thành ống nghiệm hoặc tạo thành kết tủa đen.
3.4.2.5 Khảo sát sự hiện diện của các acid hữu cơ
Lấy 2 mL dịch chiết cho vào một ống nghiệm Thêm vào dung dịch một ít tinh thể Na2CO3 Nếu có các bọt khí nhỏ sủi lên từ các tinh thể Na2CO3: Có acid hữu cơ.
Định lượng polyphenol bằng phương pháp đo quang
Phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Folin-Ciocalteu nhằm xác định hàm lượng polyphenol toàn phần Thuốc thử này, chứa phosphomolybdate và phosphotungstate, sẽ bị oxy hóa khi tiếp xúc với phenol và polyphenol, tạo thành phức hợp màu xanh có độ hấp thu mạnh ở 765 nm Độ hấp thu phụ thuộc vào môi trường kiềm nhẹ, do đó Na2CO3 được thêm vào để tạo điều kiện này Hàm lượng polyphenol được xác định qua phương trình đường chuẩn dựa trên mối liên hệ giữa giá trị OD và nồng độ gallic acid, với kết quả được biểu thị bằng mg gallic acid đương lượng trên trọng lượng bột khô (mg GAE/g DPW).
Dung dịch thuốc thử: Pha dung dịch Folin-Ciocalteu 10% được pha bằng nước cất và bảo quản trong tối
Dung dịch Na2CO3 10%: 10 g Na2CO3 hòa tan hoàn toàn trong 20 mL nước cất sau đó cho vào bình, định mức đến vạch
Để chuẩn bị dung dịch chuẩn gallic acid, cần cân chính xác khoảng 0,1 gam gallic acid và hòa tan trong dung môi, sau đó pha loãng thành 100 mL để thu được dung dịch chuẩn gốc với nồng độ 1000 µg/ml Tiếp theo, lần lượt lấy 1, 2, 3, 4 và 5 mL dung dịch chuẩn gốc gallic acid, pha loãng thành 100 mL để tạo ra các dung dịch có nồng độ 10, 20, 30, 40 và 50 µg/ml, phục vụ cho các thí nghiệm.
Thêm 2,5 mL Folin-Ciocalteu 10% vào 0,5 mL dung dịch axit gallic và ủ trong 3-8 phút ở 25℃ Tiếp theo, thêm 2 mL dung dịch Na2CO3 10% vào hỗn hợp và ủ trong 1 giờ trong bóng tối Đo mật độ hấp thụ quang phổ ở bước sóng 765 nm Xây dựng phương trình đường chuẩn tuyến tính dựa vào độ hấp thu quang phổ và nồng độ axit gallic (0, 2, 4, 6, 8, 10 µg/mL) Thực hiện thí nghiệm lặp lại 3 lần để đảm bảo độ chính xác.
3.5.3.2 Xác định hàm lượng polyphenol
Một gram bột dược liệu khô được chiết xuất theo quy trình đã mô tả, thu được dịch chiết Sau khi cô quay để thu hồi dung môi, dịch chiết được pha loãng thành 100 mL trong dung môi chiết Tiếp theo, thêm 2,5 mL Folin-Ciocalteu 10% vào 0,5 mL dịch chiết và ủ hỗn hợp ở nhiệt độ 25℃ trong khoảng 3-8 phút, sau đó bổ sung 2 mL dung dịch Na2CO3.
Ủ hỗn hợp trong 1 giờ ở điều kiện bóng tối, sau đó đo mật độ hấp thụ quang phổ tại bước sóng tối ưu 765 nm, thực hiện song song với mẫu trắng và lặp lại thí nghiệm 3 lần để đảm bảo độ chính xác.
Hàm lượng polyphenol tổng theo chất khô trong mẫu phân tích được tính theo công thức (3.2):
Hàm lượng polyphenol tổng = C thực V k 1000 m x100 (3.2)
Trong đú: Cthực: nồng độ polyphenol toàn phần trong dung dịch thử (àg/ml)
V: thể tích dung dịch thử (ml) k: hệ số pha loãng m: khối lượng bột dược liệu (g)
Phương pháp bào chế hệ vi hạt fibroin
3.6.1 Bào chế hệ vi hạt fibroin trống (FMPs-Blank)
Cân 0,055 g, 0,11 g và 0,165 g fibroin, hòa tan trong 5 mL nước cất để tạo ra dung dịch fibroin 1%, 2% và 3% Sau đó, ly tâm ở 4000 vòng/phút trong 5 phút và lấy 2 mL dung dịch trong Nhỏ từ từ 1 mL dung môi (MeOH, EtOH 60%, EtOH 96%) vào 2 mL dung dịch fibroin trong nước và lắc trong 1 giờ Cuối cùng, bảo quản ở nhiệt độ 4℃ trong 24 giờ và tiếp tục ly tâm.
Sau khi quay với tốc độ 000 vòng/phút trong 40 phút, phần nổi được loại bỏ để thu được FMPs-Blank Phần cắn sau đó được đông khô và bảo quản ở nhiệt độ 4℃ cho đến khi tiến hành thí nghiệm tiếp theo.
3.6.2 Bào chết hệ vi hạt fibroin được tải dịch chiết (FMPs-WT)
Việc điều chế hạt FMPs chứa polyphenol từ chiết xuất hoa WT được thực hiện tương tự như hạt FMPs-Blank, nhưng với việc thay thế 1 mL dung môi.
Pha 1 mL dung dịch cao chiết khô bằng các dung môi chiết và định lượng hàm lượng polyphenol để tạo dung dịch có nồng độ 7/10/10 mg cho cao chiết MeOH, EtOH 60%, và EtOH 96% Sau đó, nhỏ từ từ vào 2 mL dịch fibroin trong nước và lắc trong 1 giờ Bảo quản dung dịch ở nhiệt độ 4℃ trong 24 giờ, rồi ly tâm ở 6.000 vòng/phút trong 40 phút để thu phần dịch trong, dùng để xác định hàm lượng polyphenol tự do còn lại Phần cặn được đông khô và bảo quản ở 4℃ cho các thí nghiệm tiếp theo.
Phương pháp xác định một số tính chất lý hóa của hệ vi hạt
3.7.1 Xác định hàm lượng polyphenol được tải vào hạt và khả năng tải của hệ vi hạt
Hàm lượng polyphenol trong hạt được xác định qua phương pháp đo quang phổ UV-Vis, bằng cách so sánh nồng độ trong dung dịch trước và sau khi phản ứng với thuốc thử Folin-Ciocalteu ở bước sóng 765 nm Từ đó, hàm lượng polyphenol tải được (EE%) và khả năng tải của hệ vi hạt (DL%) được tính toán theo các công thức đã nêu.
EE% =Hàm lượng trước khi nạp − Hàm lượng sau khi nạp
Hàm lượng trước khi nạp ∗ 100 (3.3)
DL% =Tổng hàm lượng polyphenol được tải vào hạt
3.7.2 Đo kích thước hệ vi hạt
Kích thước hạt trung bình và phân bố kích thước hạt (PI) được xác định thông qua phương pháp tán xạ ánh sáng động (DLS) với máy phân tích MicroTrac S3500 Mẫu hạt FMPs và FMPs-WT đã được đông khô và sau đó được tái phân bố.
5 mL nước DI và phép đo được thực hiện ở 25℃ ở một góc cố định là 90° [143]
3.7.3 Xác định khả năng giải phóng polyphenol của hệ vi hạt
Khả năng giải phóng polyphenol từ vi hạt FMPs-WT được thực hiện thông qua phương pháp lắc Mẫu hạt được phân tán trong 50 mL dung dịch đệm phosphate (pH=7,4) với tốc độ 200 vòng/phút trong thời gian 2,5 giờ Tại mỗi khoảng thời gian 30 phút, quá trình giải phóng được theo dõi để đánh giá hiệu quả.
Trong nghiên cứu này, mẫu 1 mL được lấy ra sau các khoảng thời gian 60, 90, 120, 150, 180, 210 và 240 phút, và được thêm vào một lượng đệm tương ứng Mẫu sau đó được ly tâm ở tốc độ 18,000 vòng/phút trong 5 phút Hàm lượng polyphenol trong phần dịch sau ly tâm được xác định bằng phương pháp đo quang với thuốc thử Folin-Ciocalteu tại bước sóng 765 nm Đường chuẩn để xác định hàm lượng polyphenol trong dung dịch đệm phosphate được xây dựng trong khoảng nồng độ 2-10 µg/mL, với công thức y = ax + b Cuối cùng, phần trăm tích lũy giải phóng (%T) được tính theo công thức (3.5).
Trong đó: Ct, Ci: nồng độ của polyphenol được giải phóng tại thời điểm t và i
V0: tổng thể tích dung dịch đệm giải phóng (50 mL)
V: thể tích mẫu rút tại mỗi thời điểm (1 mL)
Mi: tổng lượng polyphenol rút tại thời điểm i
3.7.4 Đánh giá tương tác của hệ vi hạt và các hợp chất trong dịch chiết Đánh giá sự tương tác giữa fibroin và dịch chiết dựa vào phổ FT-IR của các mẫu FMPs, FMPs-WT và các cao chiết được, phổ thu được bằng máy quang phổ FT/IR 6300 (Jasco-Nhật Bản, dải tần từ 4000 đến 400 cm -1 ) với phương pháp viên KBr Các phân tích được thực hiện trong điều kiện lọc không khí khô với bộ mã hóa 256 hình ảnh giao thoa được thu thập ở độ phân giải 4.0 cm -1 [10, 91]
Mũi tín hiệu amide I và amide II đóng vai trò quan trọng trong việc xác định độ kết tinh của hệ vi hạt Để xác định độ kết tinh, chúng ta áp dụng các công thức (3.6) và (3.7).
CIIRI và CIIRII là các giá trị CI được tính từ mật độ quang học của các dải amide I và II Cụ thể, D1626 và D1525 đại diện cho mật độ quang học của các phần tinh thể fibroin tại các dải amide I và II, trong khi D1655 và D1557 tương ứng là mật độ quang học của các phần vô định hình fibroin tại các dải amide I và II.
Khảo sát khả năng quét gốc tự do DPPH của cao chiết và các hệ vi hạt
Hiệu quả quét gốc tự do DPPH của cao chiết hoa Sài đất ba thùy được thực hiện dựa theo phương pháp của Shekhar el al (2014) có hiệu chỉnh [144]
DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) là một gốc tự do ổn định, tồn tại dưới dạng bột màu đen và có màu tím đặc trưng trong dung dịch Gốc tự do này hấp thu ánh sáng với bước sóng cực đại tại 519 nm, và độ hấp thu giảm khi nó nhận một điện tử hydrogen từ các chất kháng oxy hóa, dẫn đến sự chuyển đổi màu sắc từ đen tím sang vàng nhạt Vì lý do này, DPPH được sử dụng phổ biến trong các thử nghiệm đánh giá hiệu quả hoạt động quét gốc tự do của các chất kháng oxy hóa thông qua sự thay đổi độ hấp thu ở 519 nm.
Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của các dung dịch cao chiết được đánh giá thông qua sự giảm độ hấp thu quang phổ ở bước sóng 519 nm sau khi phản ứng với mẫu thử Chất kháng oxy hóa trong mẫu sẽ tương tác với gốc tự do DPPH, dẫn đến lượng gốc tự do còn lại được xác định tại bước sóng này Từ sự giảm độ hấp thu, có thể tính toán hiệu suất làm sạch gốc tự do và xây dựng đồ thị tuyến tính biểu diễn hiệu suất theo nồng độ mẫu, từ đó xác định giá trị IC50 dựa vào phương trình tuyến tính.
Để pha dung dịch DPPH nồng độ 0,1 mM, cần cân chính xác 1,97 mg DPPH cho vào bình định mức 50 mL Sau đó, thêm MeOH đến vạch và lắc đều cho đến khi dung dịch tan hoàn toàn Cuối cùng, dung dịch được bảo quản ở nhiệt độ 4℃ trong điều kiện tối.
Pha dung dịch Vitamin C nồng độ 40 μg/mL: cân chính xác 2 mg Vitamin
Cho 20 mL dung dịch vào bình định mức, sau đó thêm MeOH đến vạch và lắc đều cho đến khi tan hoàn toàn Hút chính xác 2 mL dung dịch đã pha và cho vào ống ly tâm.
8 mL MeOH lắc đều, được 10 mL dung dịch Vitamin C nồng độ 20 μg/mL dùng cho thí nghiệm
Để pha dung dịch cao chiết hoa Sài đất ba thùy nồng độ 1000 μg/mL, cần cân chính xác 2 mg cao chiết và cho vào ống effendorf Sau đó, thêm 2 mL dung môi và lắc đều cho đến khi tan hoàn toàn Tiếp theo, hút 1 mL dung dịch vừa pha và cho vào ống ly tâm, sau đó thêm 9 mL dung môi để thu được dung dịch cao chiết nồng độ 100 μg/mL phục vụ cho các thí nghiệm.
3.8.3 Khảo sát khả năng quét gốc tự do của cao chiết
Khảo sát khả năng quét gốc tự do DPPH của Vitamin C và cao chiết được thực hiện bằng cách xây dựng đường chuẩn giữa khả năng quét gốc tự do và dãy nồng độ chuẩn Nồng độ chuẩn kháng oxy hóa của Vitamin C được xác định với các mức 0; 1,5; 3; 4,5; 6; 7,5; 9 µg/mL, trong khi đó, các cao chiết có cùng dãy nồng độ là 0, 3, 6, 9, 12, 15 µg/mL Từ đó, nồng độ tại đó 50% gốc tự do được làm sạch (IC50) sẽ được tính toán.
Quy trình thử nghiệm bao gồm việc hòa trộn V1 với dung dịch Vitamin C hoặc dung dịch cao chiết, sau đó thêm vào V2 dung dịch gốc tự do DPPH nồng độ 0,1 mM và ủ trong tối ở nhiệt độ phòng trong 30 phút Đo độ hấp thu quang phổ tại bước sóng 519 nm, sử dụng mẫu trắng không chứa Vitamin C hoặc cao chiết Toàn bộ quá trình được thực hiện trong môi trường tránh sáng và các thí nghiệm được lặp lại 3 lần để lấy giá trị trung bình.
Bảng 3.1 Quy trình khảo sát khả năng làm sạch gốc tự do DPPH của các cao MeOH, EtOH 60% và EtOH 96% từ hoa Sài đất ba thùy
Nồng độ cao chiết cuối cùng μg/mL
500 àL cho vào sau cùng
Bảng 3.2 Quy trình khảo sát khả năng làm sạch gốc tự do DPPH của chất đối chứng Vitamin C
Nồng độ Vitamin C cuối cùng (μg/mL)
500 àL cho vào sau cùng
3.8.4 Khảo sát khả năng quét gốc tự do của các hệ vi hạt fibroin
Việc tải dịch chiết từ cao chiết hoa Sài đất vào hệ vi hạt phụ thuộc vào tính đồng đều của các hợp chất và khả năng giải phóng hoạt chất Do đó, nghiên cứu này nhằm khảo sát khả năng làm sạch gốc tự do của hệ vi hạt theo thời gian tại các mốc 30, 120 và 240 phút Khối lượng hạt được tính toán dựa trên hàm lượng polyphenol tại giá trị IC50 của cao chiết Đối với hệ vi hạt, khối lượng hạt phản ứng (Mpu) với DPPH sẽ được xác định lại dựa vào biểu đồ giải phóng hoạt chất và hàm lượng polyphenol tổng trong cao chiết tại IC50.
Trong đó: Mpu: khối lượng hạt đem phản ứng (mg) mp: hàm lượng polyphenol tổng tại IC50 (àg)
Mh: khối lượng hạt thu được (mg)
H: phần trăm giải phóng tại thời điểm cao nhất mh: khối lượng polyphenol cú trong hạt (àg)
Mẫu FMPs-WT sau khi đông khô được cân chính xác và tái phân bố trong môi trường đệm phosphate pH=7,4, tạo ra dung dịch có nồng độ polyphenol gần tương đương với nồng độ cao chiết Hỗn hợp được chuẩn bị bằng cách thêm 0,5 mL dung dịch DPPH 0,1 mM trong MeOH vào 1,5 mL dịch huyền phù vi hạt, sau đó lắc với tốc độ 200 vòng/phút trong thời gian 30, 120 và 240 phút Cuối cùng, hỗn hợp sau phản ứng được ly tâm ở 2000 vòng/phút.
Trong quá trình nghiên cứu, chất rắn được loại bỏ trong 5 phút và độ hấp thu quang phổ của DPPH được đo tại bước sóng 519 nm Chất đối chứng được sử dụng trong thí nghiệm là axit ascorbic và FMPs-Blank, với các thí nghiệm được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác của kết quả.
Xử lý kết quả
Bài viết trình bày việc vẽ đồ thị biểu diễn hiệu suất quét gốc tự do theo nồng độ của Vitamin C và các loại cao chiết, từ đó thu được các phương trình hồi quy tuyến tính dạng y = ax + b Dựa vào các phương trình này, giá trị IC50 của Vitamin C và các loại cao chiết được tính toán So sánh khả năng kháng oxy hóa giữa hai loại cao chiết và chất đối chứng Vitamin C được thực hiện thông qua giá trị IC50 Ngoài ra, khả năng làm sạch gốc tự do của hệ vi hạt theo thời gian cũng được tính toán theo phương trình (3.9).
Trong đó: A0 là độ hấp thụ của DPPH không chứa cao chiết
A1 là độ hấp thụ khi có mặt của mẫu thử hoặc mẫu chuẩn.
