MỠ ĐẦU
Việt Nam có điều kiện tự nhiên thuận lợi cho việc trồng khoai môn, với tổng diện tích cây có củ đạt 741,3 nghìn ha vào năm 2012 Hiện nay, nhiều địa phương đang mở rộng diện tích trồng khoai môn do hiệu quả kinh tế cao hơn so với trồng lúa Tại đồng bằng Sông Cửu Long, khoai môn được trồng chủ yếu ở An Giang, Đồng Tháp, Trà Vinh và Bến Tre, đóng góp vào cơ cấu cây trồng và mang lại lợi ích kinh tế cho nông dân.
Sự phát triển diện tích trồng khoai môn đang đối mặt với nhiều thách thức, đặc biệt là các loại bệnh hại nghiêm trọng ảnh hưởng đến năng suất, trong đó bệnh thối nhũn do vi khuẩn Erwinia sp là đáng lo ngại nhất Bệnh thường xuất hiện vào mùa mưa, từ khi cây được 2,5 tháng tuổi đến thu hoạch, và gây hại nặng ở những ruộng bón nhiều phân đạm Để kiểm soát bệnh, nông dân thường phải sử dụng một lượng lớn thuốc hóa học, điều này không chỉ ảnh hưởng xấu đến môi trường mà còn đến sức khỏe người tiêu dùng Do đó, việc áp dụng các biện pháp sinh học là cần thiết để bảo vệ sức khỏe của nông dân, người tiêu dùng và giảm thiểu ô nhiễm môi trường đất, nước trong tương lai Hơn nữa, việc lạm dụng thuốc hóa học còn tiêu diệt các vi sinh vật có lợi, dẫn đến mất cân bằng sinh thái và dễ bùng phát dịch bệnh.
Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một trong những vi sinh vật tiềm năng trong phòng trừ sinh học bệnh cây, nhờ vào khả năng quản lý hiệu quả một số bệnh hại thực vật Chúng có nhiều cơ chế kháng bệnh như tiết kháng sinh, enzyme ngoại bào, hợp chất chuyển hóa thứ cấp, cạnh tranh và ký sinh, đồng thời còn kích thích sự phát triển của cây trồng (Palaniyandi, 2013) Nghiên cứu của Yan Min et al đã chỉ ra những lợi ích này.
Nghiên cứu năm 2000 đã chỉ ra rằng 26 chủng Streptomyces sp có hoạt tính kháng lại vi khuẩn Erwinia carotovora trên cây cải bắp tại Trung Quốc Gần đây, nhiều nghiên cứu cũng đã xác nhận khả năng của xạ khuẩn trong việc quản lý các bệnh do vi khuẩn gây hại cây trồng, như vi khuẩn Xanthomonas axonopodis pv citri gây bệnh loét trên cây có múi (Nguyễn Hoàng Sang, 2017) và Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh trên cây khoai lang (Nguyễn Công Văn).
Xanthomonas oryzae pv oryzae là tác nhân gây bệnh bạc lá lúa, cho thấy tiềm năng lớn của xạ khuẩn trong việc quản lý nhiều mầm bệnh vi khuẩn gây hại trên các loại cây trồng khác nhau (Nguyễn Xuân Cảnh và cộng sự, 2016).
Đề tài "Khảo sát đặc tính đối kháng của các chủng xạ khuẩn đối với vi khuẩn Erwinia sp gây bệnh thối nhũn trên khoai môn" nhằm mục đích tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng cao với vi khuẩn Erwinia sp và khảo sát khả năng tiết enzyme lipase, protease của các chủng xạ khuẩn tiềm năng.
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
Sơ lược về cây khoai môn
Cây khoai môn có tên khoa học là Colocasia esculenta (L.) Schott, chi
Khoai môn thuộc họ Ráy (Araceae) và là một trong những cây trồng được canh tác lâu đời nhất tại Hawaii, nơi nó còn được gọi là kalo Cây khoai môn được trồng thâm canh và sử dụng làm thức ăn nhiều nhất tại các nước thuộc quần đảo Thái Bình Dương Tuy nhiên, diện tích trồng khoai môn lớn nhất lại tập trung ở các nước Tây Phi, vùng Caribee và các vùng thuộc Châu Á Tại Việt Nam, khoai môn được trồng tại hầu hết các vùng sinh thái trong cả nước, bao gồm Sơn La, Lào Cai, Yên Bái, Bắc Kạn, Lạng Sơn, Trà Vinh, Đồng Tháp,
Khoai môn đứng thứ mười bốn trong sản lượng rau toàn cầu, với năng suất trung bình đạt 6 tấn/ha và tổng sản lượng 12 triệu tấn/năm Tại Việt Nam, khoai môn sọ chiếm ưu thế với diện tích trồng khoảng 15.000 ha và năng suất từ 13-15 tấn/ha, xếp thứ tư trong các loại cây ăn củ, sau khoai tây, khoai lang và sắn Ngoài ra, mỗi năm, Việt Nam xuất khẩu khoai môn sang các thị trường như Đài Loan, Nhật Bản và Singapore, mang về doanh thu trên 400.000 USD, với giá khoảng 350 USD/tấn.
Khoai môn không chỉ mang lại nguồn thu nhập ổn định cho nông dân mà còn có giá trị dinh dưỡng cao Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Ngọc Huệ và Đinh Thế Lộc (2005), củ khoai môn chứa từ 1,4% đến 3,0% protein, vượt trội hơn so với khoai mỡ, sắn và khoai lang, đồng thời cung cấp nhiều axit amin cần thiết cho cơ thể Lá khoai môn cũng rất giàu protein, với khoảng 23% protein theo khối lượng khô, trong khi củ chỉ chứa từ 7,0% đến 13,2% Ngoài ra, khoai môn còn cung cấp canxi, photpho, sắt, vitamin C, thiamin, riboflavin và niacin, các thành phần thiết yếu cho chế độ ăn uống Do đó, khoai môn đóng vai trò quan trọng trong việc cung cấp lương thực và giá trị kinh tế từ Châu Á, Châu Phi, Tây Ấn Độ đến Nam Mỹ (Lê Thị Hương, 2011).
Bệnh thối nhũn do vi khuẩn Erwinia sp trên cây khoai môn
Bệnh hại trên củ khoai môn thường xuất hiện từ giai đoạn tạo củ đến khi thu hoạch, đặc biệt là trong mùa mưa, gây thiệt hại nặng nề trên các rẫy bón nhiều phân đạm Giai đoạn cây 2,5 tháng tuổi đến thu hoạch là thời điểm bệnh phát triển mạnh, và nó còn ảnh hưởng nghiêm trọng đến hom giống sau thu hoạch.
Cây khoai môn bị bệnh thường có dấu hiệu suy yếu, héo xanh và lá rủ Củ bị thối phát ra mùi hôi khó chịu, mô củ bị phân rã, khiến khi nhổ lên dễ bị đứt rời khỏi gốc Bề ngoài vùng nhiễm có thể vẫn nguyên vẹn, nhưng bên trong đã chuyển thành chất nhầy Bệnh thường xuất hiện khi khoai môn đã tạo củ, với vi khuẩn xâm nhập từ vỏ củ vào thịt củ, chủ yếu tại phần tiếp giáp giữa thân giả và củ, sau đó lan ra các mô xung quanh Khi bệnh nặng, phần thân giả và lá khoai môn có triệu chứng héo xanh, đặc biệt khi trời nắng, dễ khiến thân giả tuột khỏi củ dưới mặt đất.
Bệnh thối nhũn củ khoai môn, do vi khuẩn Erwinia spp gây ra, đã được ghi nhận tại Hawaii (Raabe et al., 1981) Theo nghiên cứu của Ooka (1990), hai loài vi khuẩn Erwinia carotovora và Erwinia chrysanthemi là nguyên nhân chính gây ra bệnh này ở Hawaii.
Theo Winslow et al (1920), Erwinia được phân loài thuộc giới
(Kingdom): Bacteria, ngành (Phylum): Proteobacteria, lớp (Class): Proteobacteria, bộ (Order): Enterobacteriales, họ (Family): Enterobacteriaceae, chi (Genus): Erwinia
Vi khuẩn Erwinia là một loại vi khuẩn gram âm, không có khả năng tạo nội bào tử và thuộc nhóm vi khuẩn yếm khí tùy ý Theo Agrios (2005), Erwinia có hình dạng roi thẳng, kích thước dao động từ 0,5 - 1,0 µm đến 1,0 - 3,0 µm, và có khả năng di chuyển nhờ vào những roi dạng lông bao xung quanh.
Vi khuẩn Erwinia sp được phân lập trên nhiều môi trường khác nhau như KB, YDC, CVP và MS Trên môi trường King’B, khuẩn lạc của vi khuẩn này có màu trắng kem nhạt, bóng tròn, lồi, với rìa mịn và không phát huỳnh quang.
Loài E chrysanthemi thường xuất hiện trên các môi trường có màu trắng xám đến màu kem, với đặc điểm bề mặt mịn, tròn và phẳng hoặc hơi nhô lên Khuẩn lạc của E chrysanthemi có màu trắng xám, hình dạng tròn và nhầy khi được nuôi cấy trên môi trường có chiết xuất thịt bò (CABI và EPPO, 2003).
Sau 24 giờ nuôi cấy trên môi trường YDC, loài E carotovora xuất hiện với màu trắng đục, dạng tròn và nhầy (Nguyễn Thị Thanh Hà, 2014) Theo nghiên cứu của Bradbury (1977) và Gupta cùng Thind (2006), khuẩn lạc của E carotovora pv carotovora và pv atroseptica trên hầu hết các môi trường có màu trắng xám đến kem - trắng, với đặc điểm mịn, tròn, sáng lấp lánh và hơi nhô lên, dễ dàng quan sát trên các đĩa nuôi cấy sau khoảng thời gian 24 giờ.
Nhóm vi khuẩn Erwinia gây thối mềm là những vi khuẩn kỵ khí tùy ý, có khả năng lên men đường và dương tính với catalase, nhưng âm tính với oxidase Chúng sản sinh các hợp chất như B-galactosidase, H2S, D-galactose, D-glucose, glycerol, D-ribose, D-mannose và sucrose, đồng thời không có khả năng sản xuất urê hoặc sinh acid từ adonitol (Schaad, Jones và Chun).
2001) Các xét nghiệm sinh hóa để phân biệt loài của nhóm thối mềm do
Erwinia sp gây ra được Hyman (1995) khảo sát qua bảng 2.1
Vi khuẩn gây thối mềm có đặc điểm sinh hóa và tính gây bệnh nổi bật nhờ vào khả năng sản sinh enzyme và độc tố Chúng sản xuất các men phân giải pectin như pectinase, protopectinase và polygalacturonase, dẫn đến việc làm mềm nhũn tế bào cây ký chủ Đồng thời, các độc tố thuộc nhóm vivotoxin gây héo cây và phá hủy màng tế bào, mạch dẫn, làm cho mô cây bị thối và biến dạng Quá trình này phản ánh cách xâm nhiễm của vi khuẩn Erwinia vào cây ký chủ Ngoài ra, vi khuẩn còn tiết ra các enzyme như isozyme, isoprotase, xylanase và các hợp chất như siderophores chrysobactin cùng indigoidine, góp phần vào hệ thống xâm nhiễm (Vũ Triệu Mân, 2007).
Bảng 2.1 Một số xét nghiệm sinh hóa phân biệt các loài Erwinia gây thối mềm (Hyman, 1995)
Một số phản ứng thử E caratovora pv carotovora
Sản sinh sắc tố màu xanh trên môi trường PDA - - V
Ghi chú: (+) có; (-) không và (V) là chưa xác định
Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển là 23 - 30 0 C và nhiệt độ tối hảo cho phép là 32 - 40 0 C Ngưỡng nhiệt độ chết là trên 55 0 C
* Phổ ký chủ và phân bố
Vi khuẩn Erwinia gây thối nhũn có khả năng tấn công nhiều loại cây trồng và sản phẩm lưu trữ Theo nghiên cứu, có ba loài chính của Erwinia gây thối mềm, bao gồm E carotovora pv carotovora, E chrysanthemi và E carotovora pv atroseptica, chúng là nguyên nhân chính gây bệnh thối đen ở khoai tây và các cây trồng quan trọng khác Trong số đó, Erwinia atroseptica chủ yếu phân bố ở vùng ôn đới, trong khi E carotovora có mặt ở cả vùng ôn đới và nhiệt đới trên toàn cầu, và E chrysanthemi được tìm thấy ở các khu vực nhiệt đới cũng như vùng ôn đới ấm.
Sơ lượt về xạ khuẩn
2.3.1 Giới thiệu chung về xạ khuẩn
Xạ khuẩn là vi khuẩn đặc biệt Tên xạ khuẩn - Actinomycete - bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp “actys” (tia) và ”mykes” (nấm) do chúng có khuẩn lạc
Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn gram dương, hiếu khí, có tỷ lệ G + C cao (>55%) trong trình tự 16S rARN, thường có hình phóng xạ và dạng sợi phân nhánh giống như nấm (myces) (Ashutosh et al., 2008; Prescott et al., 2008).
Xạ khuẩn là một nhóm vi sinh vật thuộc lớp Actinobacteria, phân lớp Actinobacteridae, và bộ Actinomycetales, bao gồm 10 phân bộ, 35 họ, 110 chi và khoảng 1000 loài Đặc biệt, trong số này có 478 loài thuộc chi Streptomyces, trong khi hơn 500 loài còn lại được xếp vào nhóm xạ khuẩn hiếm.
Theo nghiên cứu của Kọmpfer et al (2012), ngành Actinobacteria bao gồm 6 lớp, 23 bộ, 53 họ và 252 chi Hai chi nổi bật trong ngành này là Actinomyces và Streptomyces, chứa các chủng xạ khuẩn với vai trò quan trọng trong nông nghiệp.
Actinomyces thuộc họ Actinomycetaceae, bộ Actinomycetales, trong khi chi Streptomyces thuộc họ Streptomycetaceae, bộ Streptomycetales
Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật sống tự do và hoại sinh, phân bố rộng rãi trong tự nhiên, có mặt trong đất, nước, rác, phân chuồng và bùn Chúng đóng vai trò quan trọng trong vòng tuần hoàn tự nhiên bằng cách phân hủy và sử dụng các chất hữu cơ khó phân hủy như acid humic Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng hòa tan lignin và phân hủy các hợp chất liên quan nhờ vào việc sản sinh enzyme thủy phân cellulose, hemicellulose và peroxidase ngoại bào.
2001) Các chủng xạ khuẩn cũng xuất hiện trong môi trường giàu hữu cơ như các compost, ở cả hai pha ôn hòa (mesophilic) và chịu nhiệt (thermophilic) (Steger, 2006)
Sự phân bố của xạ khuẩn chịu ảnh hưởng lớn từ khí hậu, môi trường đất và phương pháp canh tác Theo nghiên cứu của Waksman (1961), trong 1 gam đất có thể chứa từ 29.000 đến 2.400.000 mầm xạ khuẩn, chiếm từ 9% đến 45% tổng số vi sinh vật trong đất, trong đó 70% là xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces.
2.3.2 Vai trò của xạ khuẩn trong phòng trừ bệnh
Theo Phạm Văn Kim (2000), vi sinh vật có khả năng ngăn chặn mầm bệnh thông qua nhiều cơ chế khác nhau Chúng có thể trực tiếp tiêu diệt mầm bệnh bằng cách tiết ra kháng sinh và enzyme phân hủy vách tế bào của tác nhân gây bệnh Ngoài ra, vi sinh vật còn làm giảm sức sống của mầm bệnh bằng cách ký sinh lên chúng hoặc hạn chế sự phát triển của chúng thông qua cạnh tranh về dinh dưỡng và không gian sống Vi sinh vật cũng có thể gián tiếp giúp cây trong việc ức chế sự phát triển của mầm bệnh.
8 mầm bệnh thông qua kích thích tính kháng bệnh cây trồng Xạ khuẩn cũng có những cơ chế tương tự
Một số cơ chế mà xạ khuẩn sử dụng để hạn chế mầm bệnh bao gồm:
* Khả năng tiết kháng sinh
Kháng sinh là các hợp chất có nguồn gốc từ vi sinh vật, được tổng hợp tự nhiên hoặc hóa học Ở nồng độ thấp, chúng có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt các vi sinh vật gây bệnh (Nduka, 2007).
Theo nghiên cứu của Qin et al (1994), xạ khuẩn có khả năng sản sinh nhiều chất kháng sinh có tác dụng ức chế sự phát triển của các loại nấm gây hại cho thực vật, với tỷ lệ 60 - 70% xạ khuẩn có khả năng này Đồng thời, Holt et al cũng đưa ra những phát hiện tương tự.
Năm 1994, các nhà nghiên cứu đã xác nhận rằng kháng sinh là hợp chất chủ yếu được sản xuất từ xạ khuẩn, với khả năng ức chế cao đối với các vi sinh vật khác thông qua cơ chế tiết kháng sinh.
Silvia và Mika (2008) cho biết hơn 80% trong số 8000 chất kháng sinh trên toàn thế giới có nguồn gốc từ xạ khuẩn Theo nghiên cứu của Ambarwati et al (2012), đã phát hiện 8000 hợp chất ức chế vi sinh vật trong phòng trừ sinh học, trong đó Streptomyces chiếm 45,6%.
Chất kháng sinh từ xạ khuẩn có tính chọn lọc, tác động đến một nhóm vi sinh vật nhất định, nhưng cũng sở hữu phổ kháng sinh rộng, giúp kìm hãm sự phát triển của nhiều loài vi sinh vật khác nhau Nhờ vào đặc tính này, chúng trở thành những yếu tố quan trọng trong nông nghiệp, y học, thực phẩm và sản xuất Một số loại kháng sinh nổi bật bao gồm streptomycins, cycloheximide, actinomycins, tetracyclines, cycloserine, azoserine, erythromycins và sarkomycin (Waskman, 1959).
Theo Phạm Văn Kim (2000) thì xạ khuẩn có thể tiết ra một số loại kháng sinh để phòng trị bệnh cho cây trồng như blasticidin-S do xạ khuẩn
Streptomyces griseochromongenes, kasugamicin từ Streptomyces kasugagiensi, aureofungin từ S cinnamomen, và validamycin từ xạ khuẩn S hygroscopicus đều là những chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn Trong phân chuồng ủ hoai mục chứa nhiều loại xạ khuẩn, các chất kháng sinh này có khả năng ức chế sự phát triển của mầm bệnh Do đó, việc bón phân chuồng vào vườn trồng cây bơ bị bệnh thối rễ có thể giúp cải thiện tình trạng bệnh lý này.
Phytophthora cinnamon gây ra thì thấy có hiệu quả trong kiểm soát bệnh Bên cạnh đó, theo báo cáo của Getha và Vikineswarv cũng ghi nhận rằng
Streptomyces violaceusniger ức chế nấm thông qua cơ chế tiết kháng sinh như
Niphithricin, Azalomycin, Guanidylfungins và Malonylniphimycin
Kháng sinh do xạ khuẩn tiết ra không chỉ có khả năng tiêu diệt vi sinh vật một cách chọn lọc mà còn an toàn cho sự phát triển của cây trồng, không gây độc hại cho con người và gia súc Ở nồng độ thích hợp, các chất này còn có tác dụng kích thích khả năng nảy mầm của hạt và sự sinh trưởng của cây (Trần Thị Thanh, 2011).
Xạ khuẩn, với khả năng tiết kháng sinh vượt trội, đang được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là trong nông nghiệp.
* Khả năng tiết enzyme ngoại bào
Cơ chế kiểm soát tác nhân gây bệnh cây trồng chủ yếu thông qua việc phân hủy vách tế bào của chúng Xạ khuẩn có khả năng sản xuất nhiều enzyme ngoại bào, bao gồm chitinase, glucanase và cellulose, góp phần vào quá trình này (Valois et al.).
1996) giúp phân hủy vách tế bào gây bệnh a) Khả năng phân giải protease
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP
Phương tiện
3.1.1 Thời gian và địa điểm
Đề tài được thực hiện từ tháng 05 đến tháng 10 năm 2018 tại phòng thí nghiệm Bệnh cây thuộc Bộ môn Bảo vệ thực vật, Khoa Nông Nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ.
3.1.2 Dụng cụ và vật liệu thí nghiệm
Dụng cụ thí nghiệm trong phòng: bao gồm micropipet, đĩa Petri, ống nghiệm, bình tam giác, ống đong, đũa cấy, đèn cồn, giấy bạc, giấy thấm, cồn 70°…
Trong phòng thí nghiệm, các thiết bị quan trọng bao gồm tủ cấy vi sinh, tủ sấy, tủ thanh trùng khô, máy lắc, máy đo pH, cân điện tử, máy lắc ngang và tủ lạnh trữ mẫu ở nhiệt độ 5°C Những thiết bị này đóng vai trò thiết yếu trong việc đảm bảo quy trình thí nghiệm chính xác và hiệu quả.
3.1.3 Các môi trường sử dụng trong thí nghiệm:
Môi trường MS (Mannitol Soyal four medium) (Hobbs et al., 1989)
Môi trường Tween 80 agar (Kumar et al,, 2012)
Môi trường khử hoạt tính protease (Trích Trần Thị Nhã Uyên, 2010)
3.1.4 Nguồn vi sinh vật nghiên cứu:
Chủng vi khuẩn Erwinia sp được lấy từ Bộ môn Bảo vệ Thực vật, Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ, đã được xác định là nguyên nhân gây bệnh thối nhũn trên khoai môn tại xã Hội An Đông, huyện Lấp Vò, tỉnh Đồng Tháp.
- 23 nguồn xạ khuẩn có khả năng phòng trị bệnh do vi khuẩn trên củ khoai lang và bệnh do nấm trên khoai môn (Bảng 3.1):
Bảng 3.1 Nguồn xạ khuẩn nhận dùng trong thí nghiệm
Chủng xạ khuẩn Đối kháng bệnh Nguồn
Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh trên khoai lang
Nguyễn Công Văn (2016) DH-TV5, DH-TV6, TG1, ĐT13, LV-ĐT1, LV-ĐT22
Phytophthora colocasiae gây bệnh cháy lá trên khoai môn Đỗ Văn Thinh
(2017) TĐ2, LV-ĐT11, TL13, TTr7,
Sclerotium spp gây bệnh thối gốc thân khoai môn
Nguyễn Thái Linh (2017) LV-ĐT11, CM-AG1,
Colletotrichum spp gây bệnh thán thư trên khoai môn
- 103 chủng xạ khuẩn phân lập được từ mẫu đất trồng khoai môn của một số tỉnh Đồng bằng Sông Cửu Long.
Phương pháp
3.2.1 Phân lập các chủng xạ khuẩn vùng rễ trên cây khoai môn:
Mục tiêu của nghiên cứu là thu thập các chủng xạ khuẩn từ vùng rễ cây khoai môn nhằm đánh giá khả năng phòng trị bệnh thối nhũn do vi khuẩn Erwinia sp gây hại trên củ khoai môn.
Phương pháp thu mẫu đất:
Mẫu đất được thu thập từ vùng rễ trồng khoai môn tại một số tỉnh ở Đồng bằng sông Cửu Long, với độ sâu khoảng 20 cm Sau khi thu thập, các mẫu đất được cho vào túi nylon riêng biệt và mang về phòng thí nghiệm để tiến hành phân lập xạ khuẩn.
Phương pháp phân lập xạ khuẩn: dựa trên phương pháp Hsu and
Quy trình phân lập xạ khuẩn bắt đầu bằng việc cân 4 gam đất và thêm 40 ml nước cất thanh trùng vào ống falcon 50 ml, sau đó lắc trong 30 phút Tiếp theo, thực hiện pha loãng mẫu ở bốn nồng độ khác nhau: 10^-1, 10^-2, 10^-3 và 10^-4 Rút 50 µl huyền phù từ các nồng độ 10^-3 và 10^-4, cho vào đĩa petri chứa môi trường ISP4, và dùng que để chà huyền phù cho đến khi bề mặt môi trường ráo.
Khi xạ khuẩn phát triển trên môi trường ISP4, chúng được tách sang môi trường MS bằng phương pháp vạch đơn Cuối cùng, nguồn xạ khuẩn được cấy trữ và bảo quản ở nhiệt độ 8°C.
3.2.2 Đánh giá khả năng đối kháng của các chủng xạ khuẩn đối với vi khuẩn Erwinia sp gây bệnh thối nhũn trên cây khoai môn trong điều kiện phòng thí nghiệm (thí nghiệm 1)
Nghiên cứu nhằm xác định khả năng đối kháng của các chủng xạ khuẩn đối với vi khuẩn Erwinia sp., tác nhân gây bệnh thối nhũn trên cây khoai môn, được thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm Kết quả sẽ cung cấp thông tin quan trọng cho việc phát triển các biện pháp kiểm soát bệnh hiệu quả.
Phương pháp: Gồm 2 thí nghiệm :
Trong thí nghiệm 2a, chúng tôi tiến hành đánh giá khả năng đối kháng sơ khởi của các chủng xạ khuẩn đối với vi khuẩn Erwinia sp với hai lần lặp lại Kết quả cho thấy một số chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng hiệu quả với vi khuẩn Erwinia sp., từ đó chúng tôi đã chọn ra các chủng phù hợp để tiếp tục thực hiện các thí nghiệm sau.
Hình 3.1 Sơ đồ minh họa tách ròng xạ khuẩn trên môi trường MS
- Thí nghiệm 2b: Đánh giá khả năng đối kháng của các chủng xạ khuẩn được chọn ra từ thí nghiêm 2a với chủng vi khuẩn Erwinia sp
Cả 2 thí nghiệm được thực hiện với phương pháp giống nhau Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên một nhân tố, số nghiệm thức là số chủng xạ khuẩn
Vi khuẩn Erwinia sp được nuôi cấy trong môi trường King’B trên đĩa petri trong 3 ngày Sau đó, 5ml nước cất thanh trùng được thêm vào đĩa để thu được huyền phù, và tiến hành điều chỉnh để đạt được huyền phù có OD600 bằng 0,3.
Nguồn xạ khuẩn được nuôi trong môi trường MS trong 7 ngày Sau đó, 5 ml nước cất thanh trùng được cho vào đĩa, và bào tử xạ khuẩn được cạo lấy, lọc qua vải để thu được huyền phù xạ khuẩn Tiếp theo, thực hiện phương pháp pha loãng và đếm mật số trên môi trường MS, sau đó điều chỉnh huyền phù xạ khuẩn về mật số mong muốn.
Hũa 100 àl huyền phự vi khuẩn (mật số 10^8 cfu/ml) kết hợp với 10 ml môi trường King’B 16% đã được làm nguội ở 50°C, sau đó cho vào đĩa petri và lắc đều Tiếp theo, để đĩa nguội và tạo giếng trên đĩa petri bằng dụng cụ đục tròn có đường kính thích hợp.
Sử dụng micropipet 5 mm, tiến hành cấy 12 chủng vi khuẩn với mật độ 10^8 cfu/ml vào các giếng đã được đục sẵn, mỗi giếng chứa một chủng vi khuẩn khác nhau Mỗi đĩa petri được bố trí 2 điểm cấy cách đều nhau, với khoảng cách 1,5 cm từ thành đĩa Tất cả các đĩa petri được đặt trong điều kiện phòng thí nghiệm để đảm bảo môi trường kiểm tra tối ưu.
Môi trường King’B 16% có chứa huyền phù vi khuẩn
Hình 3.2 Sơ đồ minh họa thí nghiệm đánh giá khả năng đối kháng của các chủng xạ khuẩn đối với vi khuẩn Erwinia sp
Tiến hành đo bán kính vòng vô khuẩn ở các thời điểm 1, 2, 3, 5 và 7 sau ngày bố trí
3.2.3 Khảo sát khả năng sinh tổng hợp protease của các chủng xạ khuẩn triển vọng
Mục tiêu của nghiên cứu là đánh giá khả năng đối kháng với vi khuẩn Erwinia sp gây bệnh thối nhũn trên khoai môn thông qua cơ chế tiết enzyme protease của các chủng xạ khuẩn có triển vọng Thí nghiệm 2 sẽ khảo sát khả năng tiết enzyme protease của các chủng xạ khuẩn này trên môi trường thạch.
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 1 nhân tố, 4 lặp lại, mỗi nghiệm thức là 1 chủng xạ khuẩn có triển vọng
Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của Mitra and Chakrabartty (2005); Trần Thị Nhã Uyên (2010):
Xạ khuẩn được nuôi trong môi trường MS trong 7 ngày Sau đó, cho 5 ml nước cất thanh trùng vào đĩa và cạo lấy bào tử xạ khuẩn, lọc qua vải lược để thu được huyền phù xạ khuẩn Tiến hành pha loãng và đếm mật số trên môi trường MS Cuối cùng, pha huyền phù xạ khuẩn về mật số 10^8 cfu/ml theo nhu cầu sử dụng.
Xạ khuẩn được cấy thành 2 điểm trên môi trường chứa cơ chất là casein, mỗi điểm là một khoanh giấy thấm (5 mm) có tẩm huyền phù xạ khuẩn
Tiến hành trán dung dịch TCA 10% lên đĩa petri trong 30 giây và ghi nhận bán kính vòng phân giải protein sau 3, 5, 7 và 9 ngày Thí nghiệm 3 nhằm xác định hàm lượng protease của các chủng xạ khuẩn triển vọng.
