Khảo sát hoạt tính sinh học của sản phẩm thủy phân dầu dừa bằng enzyme lipase

TÓM TẮT LUẬN VĂN Như đã biết, các chất béo bão hòa có nhiều lợi ích cho sức khỏe, đặc biệt là acid lauric thành phần chính trong dầu dừa, với những hoạt tính sinh học có giá trị như: kháng khuẩn, kháng nấm, kháng oxy hóa,... Luận văn đã phân lập được phân đoạn phân cực chứa các acid béo tự do (bao gồm acid lauric) và phân đoạn không phân cực bao gồm các este qua phản ứng thủy phân dầu dừa bằng enzyme lypase Porcine pancreas và đồng thời khảo sát, đánh giá hoạt tính sinh học sản phẩm thu được bằng các phương pháp bắt gốc tự do DPPH (hoạt tính kháng oxy hóa); khuếch tán đĩa thạch và pha loãng (hoạt tính kháng vi sinh vật). Từ đó đưa ra điều kiện thủy phân tối ưu để cho sản phẩm có hoạt tính sinh học cao nhất. Các kết quả đạt được từ thực nghiệm như sau:  Qua khảo sát sơ bộ hoạt tính kháng oxy hóa và kháng vi sinh vật, kết luận được: Sản phẩm sau thủy phân có hoạt tính cao nhất ở điều kiện thủy phân: tỉ lệ dầu:đệm 1:5 (vv); pH 7,5; tỉ lệ enzyme:cơ chất 0,5 % (w, vv); nhiệt độ 37 oC.  Phương pháp bắt gốc tự do DPPH đưa ra kết luận phân đoạn phân cực cho hoạt tính kháng oxy hóa cao hơn phân đoạn không phân cực với giá trị IC50 là 483,32±3,58 µgmL; trong khi phân đoạn không phân cực cho giá trị IC50 là 654,15±8,68 µgmL.  Phương pháp pha loãng đưa ra kết luận phân đoạn phân cực cho hoạt tính kháng vi sinh vật cao hơn phân đoạn không phân cực với giá trị MIC ở các chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus (MRSA), Methicillinsensitive Staphylococcus aureus (MSSA) và Enterococcus faecalis (E.faecalis) là < 4000 µgmL; trong khi phân đoạn không phân cực cho giá trị MIC là > 5000 µgmL. MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN I TÓM TẮT LUẬN VĂN II MỤC LỤC III DANH MỤC HÌNH V DANH MỤC BẢNG VI DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VII LỜI MỞ ĐẦU VIII CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1 1.1 DẦU DỪA 1 1.1.1 Nguồn gốc 1 1.1.2 Phân loại 2 1.1.3 Thành phần và tính chất 3 1.1.4 Ứng dụng 5 1.2 ENZYME LIPASE 6 1.2.1 Khái niệm 6 1.2.2 Nguồn gốc 6 1.2.3 Cấu trúc và tính chất enzyme lipase Porcine pancreas 7 1.2.4 Ứng dụng 8 1.3 PHẢN ỨNG THỦY PHÂN XÚC TÁC ENZYME LIPASE 8 1.3.1 Định nghĩa 8 1.3.2 Cơ chế xúc tác của enzyme lipsase 10 1.3.3 Ứng dụng của sản phẩm thủy phân 12 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 14 2.1 MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 14 2.2 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ 14 2.2.1 Nguyên liệu 14 2.2.2 Hóa chất 16 2.2.3 Thiết bị 16 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.3.1 Khảo sát nguyên liệu dầu dừa 16 2.3.2 Phương pháp kháng oxy hóa bắt gốc tự do DPPH 20 2.3.3 Phương pháp khảo sát khả năng kháng vi sinh vật 22 2.4 NỘI DUNG THỰC NGHIỆM 26 2.4.1 Khảo sát tính chất ban đầu của nguyên liệu 26 2.4.2 Nghiên cứu điều kiện thủy phân dầu dừa bằng xúc tác enzyme Lipase 26 2.4.3 Chiết tách sản phẩm sau phản ứng thủy phân 30 2.4.5 Xác định khả năng kháng vi sinh vật của sản phẩm thủy phân 33 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ BÀN LUẬN 34 3.1 KHẢO SÁT NGUYÊN LIỆU DẦU DỪA 34 3.2 KHẢO SÁT TÍNH KHÁNG OXY HÓA PHÂN ĐOẠN PHÂN CỰC CỦA SẢN PHẨM THỦY PHÂN 34 3.2.1 Ảnh hưởng của tỉ lệ dầu và đệm 35 3.2.2 Ảnh hưởng của pH dung dịch đệm 36 3.2.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme và cơ chất 37 3.2.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ 38 3.2.5 Đánh giá khả năng kháng oxy hóa của sản phẩm ở điều kiện phản ứng tối ưu 38 3.3 KHẢO SÁT TÍNH KHÁNG KHUẨN PHÂN ĐOẠN PHÂN CỰC CỦA SẢN PHẨM THỦY PHÂN 41 3.3.1 Ảnh hưởng của tỉ lệ dầu và đệm 41 3.3.2 Ảnh hưởng của pH đệm 42 3.3.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme và cơ chất 42 3.3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ 43 3.3.5 Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật sản phẩm ở điều kiện phản ứng tối ưu 44 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC 50 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây dừa ở Việt Nam 1 Hình 1.2 Cấu trúc lipase và mô hình trung tâm xúc tác 7 Hình 1.3 Cơ chế xúc tác của enzyme thủy phân lipase 11 Hình 2.1 Phản ứng bắt gốc tự do DPPH của chất kháng oxy hóa 20 Hình 2.2 Thực hiện cấy vi sinh vật lên dĩa thạch 26 Hình 2.3 Quy trình thủy phân dầu dừa sử dụng enzyme lipase 28 Hình 2.4 Sơ đồ chiết thu acid béo tự do 32 Hình 3.1 Ảnh hưởng của tỉ lệ dầu:đệm (vv) lên phần trăm bắt gốc DPPH 35 Hình 3.2 Ảnh hưởng của pH dung dịch đệm lên phần trăm bắt gốc DPPH 36 Hình 3.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme:cơ (%, wv) chất lên phần trăm bắt gốc DPPH 37 Hình 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ (oC) lên phần trăm bắt gốc DPPH 38 Hình 3.5 Phần trăm bắt gốc DPPH của phân đoạn phân cực 39 Hình 3.6 Phần trăm bắt gốc DPPH của phân đoạn không phân cực 39 Hình 3.7 Phần trăm bắt gốc DPPH của Acorbic acid 40 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Chỉ tiêu chất lượng của dầu dừa Tin Vui do nhà sản xuất cung cấp. 15 Bảng 3.1 Kết quả thí nghiệm khảo sát tính chất dầu dừa. 34 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ dầu:đệm (vv) lên đường kính vùng ức chế 41 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của pH đệm lên đường kính vùng ức chế 42 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme:cơ chất lên đường kính vùng ức chế 43 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên đường kính vùng ức chế của phân đoạn acid béo 44 Bảng 3.6 Khảo sát nồng độ mẫu acid béo lên từng vi sinh vật 45 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DPPH: 1,1 – diphenyl2picrylhydrazyl MIC: minimum bactericidal concentration MBC: minimum inhibitory concentration MHA: MuellerHinton Agar NA: Nutrient Agar LPP: Lipase Porcine pancrreas NB: Nutrient Broth LỜI MỞ ĐẦU Từ xưa, dừa là loài cây rất thân thuộc với người Việt chúng ta, đặc biệt là người dân Nam bộ, không những là một loại quả có thể giải khát trong những ngày nắng nóng, mà tất cả các bộ phân của cây dừa là nguồn nguyên liệu cho các ngành mỹ phẩm, thực phẩm, mỹ nghệ và một số ngành khác. Trên thị trường, sản phẩm dầu dừa được sử dụng chủ yếu để chăm sóc sức khỏe và làm đẹp điển hình như dưỡng tóc, chống rạn da, dưỡng ẩm, tinh dầu massage,… Tuy nhiên để mở rộng ứng dụng của dầu dừa vào thực phẩm chức năng hay bảo quản thực phẩm thì cần nghiên cứu sâu hơn nữa. Thành phần chủ yếu của dầu dừa là các acid béo bão hòa – đa số là Triglyceride chuỗi trung bình. Ngoài việc có khả năng cung cấp năng lượng cho cơ thể một cách nhanh chóng thì nhóm hoạt chất này đã được chứng minh có nhiều hoạt tính sinh học như tính kháng khuẩn, tính kháng oxy hóa, có thể được sử dụng trong công nghệ thực phẩm và dược phẩm. Vì vậy các nghiên cứu về dầu dừa đang được dần mở rộng và chuyên sâu hơn. Mặc dù thủy phân bằng phương pháp hóa học cho hiệu suất cao, tuy nhiên phương pháp này không đảm bảo được độ tinh khiết cho sản phẩm do trong quá trình thực hiện sinh ra sản phẩm phụ và qui trình này thường tốn nhiêu năng lượng và đòi hỏi các lò phản ứng tốn kém. Nhằm vào mục đích, tăng độ tinh khiết của sản phẩm đầu ra để có thể làm nguyên liệu cho các sản phẩm yêu cầu gắt gao như dược phẩm, mỹ phẩm hay công nghệ thực phẩm thì thủy phân dầu dừa bằng enzyme lipase là một giải pháp hợp lý. Với ưu điểm enzyme Porcine pancreas có tính đặc hiệu cao đối với cơ chất trong điều kiện nhiệt độ, pH nhất định, nên sản phẩm thu được có độ tinh sạch cao, ngoài ra phản ứng diễn ra ở điều kiện áp suất khí quyển và nhiệt độ thường, cho nên phương pháp này cũng rất thân thiện với môi trường. Do đó, trong luận văn này, chúng tôi nghiên cứu và khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện thủy phân lên hoạt tính sinh học của sản phẩm. Từ đó, đưa ra điều kiện tối ưu của phản ứng để sản phẩm có hoạt tính sinh học tốt nhất. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 DẦU DỪA 1.1.1 Nguồn gốc Tên khoa học của dừa: Cocos nucifera. Bộ: Arecales Họ: Arecaceae (họ Cau) Chi: Cocos Dừa là một loại cây lớn, thân đơn trục (nhiều khi gọi là nhóm thân cau dừa) có thể cao tới 30 m, với các lá đơn xẻ thùy lông chim 1 lần, cuống và gân chính dài 46 m các thùy với gân cấp 2 có thể dài 6090 cm; lá kèm thường biến thành bẹ dạng lưới ôm lấy thân; các lá già khi rụng để lại vết sẹo trên thân. Nguồn gốc của cây dừa chưa được biết đến rõ ràng, có lẽ vì dừa đã được có mặt rộng rãi ở khắp các khu vực nhiệt đới của thế giới từ rất nhiều năm trước đây. Dừa được cho là có nguồn gốc từ khu vực ven biển của Đông Nam Á (Malaysia, Indonesia, Philippines) và Melanesia. Dừa hiện nay được trồng khá phổ biến trên toàn thế giới ở nhiều loại đất. Và dừa đã trở thành thực vật quan trọng trong đời sống cũng như kinh tế của người dân ở các quốc gia như: Myanmar, Indonesia, Malaysia, Philippines, Ấn Độ, Sri Lanka, Kenya, Madagascar, Mozambique, Ecuador, Brazil, Mexio, Venezuela,... 1 Dầu dừa là sản phẩm chính từ dừa, được thu từ cơm của quả dừa; là sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, có công dụng làm thực phẩm, dược phẩm,... cung cấp lượng lớn các acid béo bão hòa chuỗi trung bình cho cơ thể con người 2. 1.1.2 Phân loại Dầu dừa hiện nay khá đa dạng và chủ yếu được phân loại theo quy trình sản xuất, trên thế giới có thể kể đến các loại hình sản xuất dầu dừa sau:  Phương pháp khô: Cơm dừa khô sẽ được ép và chiết dung môi, thời hạn sử dụng thấp, màu sắc và hương của dầu dừa được sản xuất bằng phương pháp này không phù hợp để sử dụng trong mỹ phẩm hoặc thực phẩm.  Phương pháp ướt: Đối với phương pháp này thì cơm dừa tươi sẽ được ép lấy phần nước, còn gọi là nước cốt dừa. Phần protein có trong nước cốt dừa sẽ gắn kết phần dầu và phần nước tạo thành một thể sữa (emulsion) và từ thể sữa này phần dầu sẽ được tách ra khỏi nước. Phương pháp truyền thống là nấu (thắng), hay còn được gọi là phương pháp nấu thủ công mà hiện nay nhiều người vẫn thực hiện tại nhà. Nhưng đối với sản xuất công nghiệp với một số lượng lớn thì phương pháp nấu dầu này không còn được sử dụng mà thay vào đó là sử dụng máy quay li tâm để xử lí sản phẩm đã được sơ chế bằng nhiệt độ (nóng và lạnh), axit, muối, enzim, điện,... hoặc kết hợp một hoặc nhiều cách trên.  Phương pháp RBD tinh chế, lọc, khử mùi: Đối với phương pháp RBD này cơm dừa khô được ép bằng sức nước kèm thêm nhiệt độ cho ra phần dầu. Phần dầu thô này hoàn toàn không tiêu hoá được vì chứa các chất ô nhiễm và cần được xử lí thêm bằng nhiệt độ và phương pháp lọc.  Phương pháp Hydro hoá: Để tăng nhiệt độ hoá lỏng của dầu dừa, người ta đã sử dụng phương pháp Hydro hoá các chất béo đơnđa không no có trong dầu dừa. Quá trình này làm cho một phần axit béo đơnđa không no trở thành chất béo chuyển hoá và làm tăng mức nhiệt độ hoá lỏng của dầu dừa từ 24 °C lên 3640 °C.  Phương pháp chưng cất phân đoạn: Với phương pháp chưng cất phân đoạn, các loại axit béo được tách riêng biệt để phù hợp với nhu cầu sử dụng.

TỔNG QUAN

DẦU DỪA

- Tên khoa học của dừa: Cocos nucifera.

Dừa là cây lớn, thân đơn trục, có thể cao tới 30 m Lá dừa là lá đơn xẻ thùy lông chim một lần, với cuống và gân chính dài từ 4-6 m, các thùy có gân cấp 2 dài 60-90 cm Lá kèm thường biến thành bẹ dạng lưới ôm lấy thân, và khi lá già rụng, để lại vết sẹo trên thân cây.

Cây dừa có nguồn gốc chưa rõ ràng, nhưng được cho là xuất phát từ khu vực ven biển Đông Nam Á, bao gồm Malaysia, Indonesia và Philippines, cũng như Melanesia Hiện nay, dừa được trồng rộng rãi trên toàn thế giới, thích nghi với nhiều loại đất khác nhau Cây dừa đã trở thành một thực vật quan trọng trong đời sống và kinh tế của nhiều quốc gia như Myanmar, Indonesia, Malaysia, Philippines, Ấn Độ, Sri Lanka, Kenya, Madagascar, Mozambique, Ecuador, Brazil và Mexico.

Dầu dừa, một sản phẩm quý giá từ quả dừa, được chiết xuất từ cơm dừa và mang lại giá trị dinh dưỡng cao Nó không chỉ được sử dụng trong ẩm thực mà còn có công dụng trong y học, cung cấp một lượng lớn acid béo bão hòa chuỗi trung bình cho cơ thể con người.

Hình 1.1 Cây dừa ở Việt Nam

Dầu dừa hiện nay rất phong phú và được phân loại chủ yếu dựa trên quy trình sản xuất Trên toàn cầu, có nhiều phương pháp sản xuất dầu dừa khác nhau.

Phương pháp khô để sản xuất dầu dừa bao gồm việc ép và chiết xuất từ cơm dừa khô, tuy nhiên, sản phẩm này có thời hạn sử dụng thấp Màu sắc và hương vị của dầu dừa thu được từ phương pháp này không đạt yêu cầu cho việc sử dụng trong mỹ phẩm hoặc thực phẩm.

Phương pháp ướt trong sản xuất nước cốt dừa bắt đầu bằng việc ép cơm dừa tươi để lấy nước, tạo thành một thể sữa (emulsion) nhờ vào sự kết hợp giữa protein, dầu và nước Phương pháp truyền thống thường sử dụng nấu (thắng), nhưng trong sản xuất công nghiệp quy mô lớn, phương pháp này đã được thay thế bằng máy quay li tâm, kết hợp với các phương pháp xử lý nhiệt độ, axit, muối, enzim và điện để đạt hiệu quả tối ưu.

Phương pháp RBD (Refined, Bleached, Deodorized) là quy trình tinh chế dầu dừa, trong đó cơm dừa khô được ép bằng sức nước và nhiệt độ để thu được dầu Tuy nhiên, dầu thô này không thể tiêu hóa do chứa các chất ô nhiễm, vì vậy cần được xử lý thêm bằng nhiệt độ và phương pháp lọc để loại bỏ tạp chất và đảm bảo an toàn cho người sử dụng.

Phương pháp Hydro hoá được áp dụng để nâng cao nhiệt độ hoá lỏng của dầu dừa bằng cách chuyển đổi các axit béo không no trong dầu thành chất béo chuyển hoá Quá trình này giúp tăng nhiệt độ hoá lỏng của dầu dừa từ 24 °C lên 36 °C, cải thiện tính chất và khả năng sử dụng của sản phẩm.

 Phương pháp chưng cất phân đoạn: Với phương pháp chưng cất phân đoạn, các loại axit béo được tách riêng biệt để phù hợp với nhu cầu sử dụng.

1.1.3 Thành phần và tính chất

Dầu dừa, được chiết xuất từ cơm quả dừa, là một sản phẩm dinh dưỡng quý giá, cung cấp lượng lớn acid béo bão hòa chuỗi trung bình cho cơ thể.

Dầu dừa chủ yếu chứa khoảng 92,1% acid béo bão hòa, trong đó 62% là acid béo chuỗi trung bình (6-12 nguyên tử) Thành phần acid béo trong dầu dừa được trình bày chi tiết trong bảng 1.1.

Bảng TỔNG QUAN.1 Thành phần và hàm lượng các acid béo trong dầu dừa tinh luyện của công ty TNHH dầu dừa Tin Vui

Cis-9-Octadecenoic acid, methyl ester C18:1 4.39

Cis- 9,12-Octadecadienoic acid, methyl ester C18:2 0.63

Dầu dừa chứa các phân tử chất béo được gọi là acid béo chuỗi trung bình (MCFA), khác với phần lớn chất béo trong chế độ ăn uống của con người, chủ yếu là acid béo chuỗi dài (LCFA) Sự khác biệt chính giữa MCFA và LCFA là chiều dài chuỗi carbon; MCFA có chuỗi từ 6 đến 12 nguyên tử carbon, trong khi LCFA có chuỗi từ 14 nguyên tử carbon trở lên.

Chiều dài chuỗi Carbon có ảnh hưởng lớn đến tính chất vật lý và hóa học của dầu Khi tiêu thụ, các quá trình chuyển hóa acid béo trong cơ thể phụ thuộc vào kích thước chuỗi Carbon, dẫn đến sự khác biệt trong hiệu ứng sinh lý giữa MCFA trong dầu dừa và LCFA trong chế độ ăn hàng ngày.

Tất cả các MCFA trong dầu dừa đều là acid béo bão hòa, do vậy mà nó có một số tính chất hóa lý:

Dầu dừa có nhiệt độ nóng chảy tương đối cao, cụ thể là trên 24 độ C, khi đó nó trở thành một chất lỏng không màu Ngược lại, dưới nhiệt độ này, dầu dừa sẽ đông đặc và chuyển thành dạng rắn màu trắng.

- Bền với nhiệt độ nên rất lý tưởng khi dùng để nấu nướng và chiên xào.

- Điểm khói của dầu dừa ở khoảng 182 o C.

- Mùi: dầu dừa có mùi dừa thơm dịu.

Dầu dừa không tan trong nước và có khả năng hòa tan hoàn toàn trong các dung môi không phân cực như petroleum, benzene, và carbon tetrachloride khi nhiệt độ vượt quá nhiệt độ nóng chảy Ngoài ra, dầu dừa còn hòa tan tốt trong ethanol so với nhiều loại dầu khác.

- Do dầu dừa có thành phần lớn là chất béo bão hòa nên có khả năng làm chậm quá trình oxy hóa, nên có khả năng chống mùi ôi.

Ngoài ra, trong dầu dừa còn có một số thành phần có hoạt tính sinh học có giá trị khác như:

- Acid béo bão hòa: đặc biệt là acid lauric có đặc tính kháng khuẩn tốt, đã được nghiên cứu trong nhiều công trình

Tocopherols là các chất chống oxi hóa tự nhiên có mặt trong hầu hết các loại dầu thực vật Trong dầu dừa, hàm lượng tocopherols tương đối thấp, chỉ khoảng 50 ppm (Taylor 1981).

ENZYME LIPASE

Enzyme lipase (acylhydrolases triacylglycerol, EC3.1.1.3) là một loại enzyme quan trọng, có chức năng xúc tác quá trình thủy phân triglyceride thành axit béo tự do và glycerol Ngoài vai trò trong phản ứng thủy phân, lipase còn tham gia vào các phản ứng khác như este hóa, alcol hóa và acid hóa trong môi trường.

Enzyme lipase có mặt rộng rãi trong tự nhiên, được tìm thấy ở nhiều loài động vật, thực vật, vi khuẩn, nấm men và nấm Các loại lipase từ các nguồn khác nhau có sự khác biệt rõ rệt về tính chất vật lý và sinh hóa, bao gồm axit béo đặc trưng, độ ổn định nhiệt và pH tối ưu Enzyme vi sinh vật mang lại nhiều lợi ích hơn so với enzyme từ thực vật và động vật nhờ vào sự đa dạng, khả năng đạt sản lượng cao, dễ dàng trong thao tác di truyền, cung cấp liên tục và khả năng phát triển nhanh trên môi trường rẻ tiền Đồng thời, enzyme vi sinh vật cũng ổn định, an toàn và dễ sản xuất hơn so với enzyme có nguồn gốc thực vật và động vật.

1.2.3 Cấu trúc và tính chất enzyme lipase Porcine pancreas

Lipase từ các nguồn động vật, thực vật và vi sinh vật có sự khác biệt đáng kể, trong đó lipase từ tụy lợn (lipase Porcine pancreas - LPP) là nguồn rẻ nhất và quan trọng nhất để thu nhận enzyme này Mặc dù phạm vi sử dụng của lipase Porcine pancreas nhỏ hơn so với lipase vi sinh vật, nhưng enzyme này vẫn có độ ổn định cao và hoạt động hiệu quả trong môi trường khan.

LPP là một protein hình cầu được tạo thành từ một chuỗi duy nhất gồm 449 amino acid Cấu trúc không gian của chúng gồm hai vùng xác định, hình 1.2

The N-terminal region serves as a crucial component of the protein structure, featuring an alpha helix and parallel beta strands within the sequence of amino acids 1 to 336 Key catalytic residues, including Serine, Aspartic acid, and Histidine, are strategically positioned at specific amino acid locations to facilitate enzymatic activity.

- Vùng C – terminal hầu hết là các gấp β, chứa amino acid 337 – 349, vùng này tương tác với colipase Colipase là một protein cofactor nhỏ, với khối lượng phân tử khoảng 10 kDa.

Cấu trúc tinh thể của enzyme LPP có những chỗ võng bao phủ bộ ba xúc tác, cản trở sự tiếp xúc của cơ chất với bộ ba này Võng rộng nhất được hình thành do cầu nối disulfide giữa Cys238 và Cys262, trong khi một võng khác được tạo ra bởi phần 76 – 85, được gọi là “nắp”.

N – terminal, bao phủ trung tâm hoạt động ngăn không cho cơ chất đi vào tâm hoạt

Cấu trúc lipase bao gồm một nắp được giữ ổn định nhờ các liên kết hydro với colipase Khi nắp mở, cơ chất có thể tiếp xúc với trung tâm xúc tác, cho phép quá trình hoạt động diễn ra hiệu quả.

Enzyme lipase có khả năng tham gia vào phản ứng thủy phân và có thể xúc tác cho quá trình este hóa glycerol từ mono, di và triglycerides Tính linh hoạt này mang lại ứng dụng tiềm năng cho enzyme lipase trong các ngành công nghiệp thực phẩm, chất tẩy rửa, dược phẩm, da, dệt may, mỹ phẩm và giấy.

Enzyme từ vi sinh vật đóng vai trò quan trọng trong nhiều lĩnh vực, bao gồm xử lý nước thải bằng cách tẩy dầu mỡ từ lipid bị tắc cống, trong dược phẩm để giải quyết các hỗn hợp racemic, trong ngành sữa thông qua quá trình thủy phân sữa và chất béo, trong da để loại bỏ chất béo từ da thú, trong chất tẩy rửa để loại bỏ dầu và vết chất béo, cũng như trong y tế để chẩn đoán triglyceride trong máu.

PHẢN ỨNG THỦY PHÂN XÚC TÁC ENZYME LIPASE

Việc sản xuất acid béo thông qua quá trình thủy phân từ chất béo và dầu tự nhiên đóng vai trò quan trọng trong việc khai thác kinh tế từ nguyên liệu tái tạo Các sản phẩm này bao gồm dầu từ ngô, hạt cải dầu, hướng dương, cọ, dừa, ô liu, cùng với chất béo động vật như mỡ.

Dầu và chất béo thuộc nhóm hợp chất gọi là este béo hoặc chất béo trung tính, và quá trình thủy phân của chúng diễn ra thông qua các phản ứng với nước, tạo ra acid béo tự do và glycerol Hiện nay, có ba phương pháp chính để thủy phân sản xuất acid béo: tách hơi nước áp lực cao, thủy phân kiềm và thủy phân bằng enzyme.

Trong kỹ thuật thủy phân xúc tác enzyme, enzyme lipase được hòa trộn với dầu để tạo thành hệ phân tán lỏng – lỏng, nơi enzyme này xúc tác cho phản ứng thủy phân triglycerides thành glycerol và acid béo tự do Mỗi mole triglycerides sẽ cho ra 1 mole glycerol và 3 mole acid béo, với phản ứng diễn ra tại bề mặt giao giữa pha nước và pha dầu, do triglycerides không tan trong nước Để tăng cường diện tích tiếp xúc giữa hai pha và nâng cao độ bền của hệ nhũ tương, chất nhũ hóa có thể được bổ sung nhằm ổn định hệ phản ứng và cải thiện hiệu suất.

 Ưu điểm: Nó giải quyết được những hạn chế của phản ứng thủy phân khác.

- Tách hơi nước áp lực cao: Vì với nhiệt độ và áp suất cao (thường khoảng 250 o C,

70 bar) cần thiết để tách hơi nước sẽ không thể áp dụng để thủy phân các triglycoside nhạy cảm, không liên hợp (có thể bị phân hủy do nhiệt ),

- Thủy phân kiềm: Chi phí năng lượng cao và xà phòng hình thành cần phải có tính acid, từ đó sản xuất các sản phẩm acid béo.

Phản ứng xúc tác enzyme thủy phân triglyceride diễn ra ở nhiệt độ môi trường xung quanh, thường là 35 oC và áp suất khí quyển, giúp tiết kiệm năng lượng và sử dụng năng lượng hiệu quả hơn so với các phương pháp thủy phân khác.

Sản phẩm đạt được có độ tinh khiết cao, với hàm lượng tạp chất ở mức tối thiểu, đồng thời thân thiện với môi trường hơn so với các loại xúc tác hóa học.

- Vì thời gian thủy phân của một mẻ là từ 2 – 3 ngày nên khó khăn cho việc thực hiện phản ứng liên tục.

- Giá thành enzyme vẫn còn cao.

Việc lặp lại quá trình động lực với hệ nhũ tương gặp nhiều khó khăn do sự ổn định của nhũ tương thấp, điều này chịu ảnh hưởng lớn từ các phương pháp chuẩn bị khác nhau.

1.3.2 Cơ chế xúc tác của enzyme lipsase

Enzyme lipase tham gia vào phản ứng thủy phân triacylglycerol tạo thành các acid béo tự do được thể hiện trên hình 1.3.

Khi triacylglycerol tiếp xúc với vùng kỵ nước của enzyme lipase, nó tương tác với bộ ba xúc tác Ser152, His263 và Asp176 để thực hiện phản ứng thủy phân Sự hình thành liên kết hydro giữa oxy của Asp176 và nitơ trong Histidin định vị His263, cho phép nitơ của His263 tạo liên kết hydro với nhóm hydroxyl của Ser152 Liên kết hydro này kéo hydro ra khỏi liên kết với oxy, giúp enzyme sẵn sàng hoạt động.

Phản ứng đầu tiên diễn ra khi nhóm OH- của serin tấn công cacbon glycerol thứ nhất, tạo ra một phản ứng thế ái nhân Sự tấn công này làm yếu đi liên kết giữa cacbon glycerol thứ nhất và oxy của este, khiến oxy trở nên linh động hơn Oxy sau đó nhận thêm một proton H+ từ nhóm OH- của Ser152 để trung hòa điện tích âm Kết quả là sản phẩm acid béo từ vị trí đầu tiên được hình thành và tự do hoàn toàn Tuy nhiên, phần glycerol vẫn giữ liên kết với oxy của Ser152, nhưng liên kết này cần phải bị phá vỡ để enzyme tiếp tục hoạt động hiệu quả.

Bước thứ hai của cơ chế thủy phân diễn ra khi diglyceride được hình thành và di chuyển từ nửa chứa glycerol Để giải phóng glycerol, một nhóm hydroxyl cần liên kết với cacbon đầu tiên của glycerol, trong khi một ion H+ sẽ thêm proton vào oxy của Ser152 Một phân tử nước từ môi trường bên ngoài cung cấp các thành phần này, và thông qua tương tác hydro, phân tử nước sẽ bị phân ly.

Ion hydronium (H3O +) được hình thành từ cầu nối hydro giữa H + và OH - của hai phân tử nước khác nhau Ion này có momen lưỡng cực lớn, hoạt động như một tác nhân ái nhân lên cacbon glycerol đầu tiên Khi oxy của Ser152 rời khỏi nhóm, chuỗi bên tích điện âm của Ser152 nhanh chóng thêm một proton từ ion H + trong nước, dẫn đến sự hình thành sản phẩm diglyceride Cuối cùng, liên kết hydro giữa nitơ thơm của His263 và nhóm hydroxyl trên Ser152 được phục hồi, trở về cấu trúc ban đầu, sẵn sàng cho phản ứng tiếp theo.

Hình TỔNG QUAN.1 Cơ chế xúc tác của enzyme thủy phân lipase

Phản ứng thủy phân tiếp theo biến diglyceride thành một acid béo và một monoglyceride, với cơ chế hai bước tương tự như thủy phân triglyceride Tuy nhiên, trong trường hợp này, các tấn công ái nhân diễn ra trên cacbon thứ ba của glycerol Kết quả của quá trình này là tạo ra một monoglyceride và acid béo mới, sau đó enzyme sẽ tiếp tục hoạt động với triglyceride khác.

1.3.3 Ứng dụng của sản phẩm thủy phân

Acid béo trong dầu dừa không chỉ có nhiều ứng dụng trực tiếp mà còn được chuyển đổi thành các dẫn xuất khác nhau, mở rộng phạm vi ứng dụng trong ngành công nghiệp hóa hữu cơ Các acid béo khác nhau có thể trải qua nhiều quy trình để tạo ra các sản phẩm đa dạng Dưới đây là những ứng dụng phổ biến của các sản phẩm này.

Các acid béo trong dầu dừa đóng vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp chế biến chất tẩy rửa và sản xuất xà phòng Trong số đó, acid lauric được xem là nguyên liệu quý giá, đặc biệt được ưa chuộng trong sản xuất xà phòng và chất tẩy rửa trên toàn cầu Các sản phẩm từ triglycerid chuỗi trung bình, ester polyol và alkanolamide cũng được chiết xuất từ các acid béo này, góp phần nâng cao chất lượng sản phẩm vệ sinh.

Acid lauric không chỉ quan trọng trong ngành công nghiệp hóa hữu cơ mà còn nổi bật với khả năng kháng khuẩn, đặc biệt được chú ý trong y học và mỹ phẩm Khi được hấp thụ vào cơ thể, acid lauric chuyển hóa thành monolaurin, một hợp chất có khả năng chống lại virus, vi khuẩn và nấm bằng cách phá hủy lớp màng lipid của chúng.

Nghiên cứu của Teruaki Nakatsuji và cộng sự (2009) đã chỉ ra rằng acid lauric có khả năng kháng khuẩn đối với Propionibacterium acnes trong điều trị viêm mụn Vulgaris cao gấp 15 lần so với benzoyl peroxide (BPO), một chất thường được sử dụng trong điều trị mụn trứng cá Hơn nữa, acid lauric không gây độc hại trong quá trình sử dụng và đặc hiệu với vi khuẩn gây mụn mà không ảnh hưởng đến các u nang tuyến bã nhờn trên da.

THỰC NGHIỆM

MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Sau khi phân tích tài liệu, nghiên cứu chỉ ra những ưu điểm vượt trội của phương pháp thủy phân bằng enzyme lipase Porcine pancreas Mục tiêu của luận văn là tối ưu hóa qui trình thủy phân dầu dừa bằng enzyme này nhằm tạo ra sản phẩm có hoạt tính sinh học tốt nhất Nội dung nghiên cứu sẽ tập trung vào việc xác định các điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân.

 Chuẩn bị và đánh giá tính chất của nguyên liệu.

 Thủy phân dầu dừa bằng enzyme lipase Porcine pancreas

 Tách phân đoạn sản phẩm sau thủy phân.

 Khảo sát khả năng kháng oxy bằng phương pháp bắt gốc tự do DPPH của sản phẩm sau thủy phân ở các điều kiện phản ứng khác nhau.

 Khảo sát khả năng kháng vi sinh vật của sản phẩm sau thủy phân ở các diều kiện phản ứng khác nhau.

NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ

Dầu dừa tinh luyện Tin Vui, do công ty TNHH MTV dầu dừa Tin Vui (Việt Nam) cung cấp, là nguyên liệu nghiên cứu chính Các thông số chi tiết của sản phẩm được trình bày trong bảng 2.1.

Bảng THỰC NGHIỆM.2 Chỉ tiêu chất lượng của dầu dừa Tin Vui do nhà sản xuất cung cấp.

STT Tên chỉ tiêu Giới hạn phát hiện

1 Hàm lượng tạp chất tính theo khối lượng, % 0.01 Không phát hiện

2 Chỉ số peroxide, meq/kg - 1.8

3 Chỉ số xà phòng hóa, - 250

4 Hàm lượng acid béo tự do theo acid oleic tính theo khối lượng, % - 0.1

5 Chỉ số acid, mg KOH/g - 0.1

Hàm lượng aflatoxin, àg/kg

Không phát hiện Không phát hiện Không phát hiện

7 Tổng số vi sinh vật hiếu khí, CFU/g - < 10

11 Tổng số nấm men và nấm mốc, CFU/g - < 10

 Chế phẩm enzyme lipase Porcine pancreas:

Chế phẩm dạng bột thu được từ tuyến tụy lợn, Type II hiệu L3126 do hãng Sigma- Aldrich (Mỹ) cung cấp

Một đơn vị hoạt độ riêng của enzyme (U) được định nghĩa là lượng protein enzyme có khả năng giải phóng một àmol acid béo từ sự thủy phân cơ chất dầu olive trong 1 giờ tại pH 7,7 và nhiệt độ 37°C, với hoạt độ đạt từ 100 đến 500 unit/mg protein Nếu sử dụng triacetin làm cơ chất tại pH 7,4 và nhiệt độ 37°C trong 1 giờ, hoạt độ sẽ dao động từ 30 đến 90 unit/mg protein [hãng Sigma-Aldrich (Mỹ)]

- Mononatri orthophotphate (NaH2PO4.2H2O) (Trung Quốc)

- Dinatri hydrophosphate (Na2HPO4.12H2O) (Trung Quốc)

- DPPH (1,1-Diphenyl - 2 - picrylhydrazyl) (Sigma Chemical Co.)

- Mueller-Hinton Agar (Ấn Độ)

Và một số hóa chất cần thiết khác.

Các thiết bị cơ bản cần thiết bao gồm: cân kỹ thuật 4 số, cân phân tích, tủ sấy, tủ cấy, tủ ấm ở 37oC, máy cô quay, máy đo độ hấp thu UV-Vis, máy đồng hòa áp suất cao, máy khuấy từ gia nhiệt, nồi hấp tiệt trùng, cùng với một số thiết bị cần thiết khác.

Dụng cụ cơ bản trong phòng thí nghiệm bao gồm micropipette với các kích thước 1000, 100 và 10 µL; pipette với các thể tích 10, 5, 2 và 1 mL; bể cô quay có dung tích 250 và 500 mL; nhiệt kế; beaker với dung tích 500 và 200 mL; bình tam giác có dung tích 1000, 500 và 100 mL; bình định mức với thể tích 100 và 10 mL; đũa thủy tinh; ống nhỏ giọt thủy tinh cùng với một số dụng cụ cần thiết khác.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Khảo sát nguyên liệu dầu dừa

 Định nghĩa: Chỉ số acid là số lượng mg KOH cần thiết để trung hòa các acid tự do trong 1 g chất thử.

 Nguyên tắc: Dùng dung dịch KOH 0.1N để trung hòa các acid tự do trong chất cần thử, với phenolphtalein làm chất chỉ thị màu.

Chỉ số acid trong dầu mỡ không có quy định cố định; khi dầu mỡ bị biến chất, chỉ số acid sẽ tăng cao Do đó, đối với dầu mỡ thực phẩm, chỉ số acid thấp luôn được đánh giá là tốt hơn.

Dung dịch KOH 0,1 N trong cồn 96 %.

Chỉ thị phenolphtalein (C20H14O4) 1% trong cồn 96 %.

Hỗn hợp dung môi gồm 1 thể tích etylic và 3 thể tích cồn 95%.

Cân chính xác 3-5 g dầu mỡ (nếu chỉ số axit thấp có thể đến 10 g) cho vào bình cầu

Pha 200 mL dung dịch với 50 mL dung môi hỗn hợp, lắc đều và nếu chưa hoà tan, có thể đun nhẹ trên nồi cách thủy cho đến khi hoà tan hoàn toàn Sau đó, thêm 2 giọt chỉ thị phenolphtalein và tiến hành chuẩn độ bằng dung dịch KOH 0,1 N trong cồn để tránh xà phòng hóa, đặc biệt khi hỗn hợp chứa 20% trở lên Tiến hành chuẩn độ cho đến khi dung dịch chuyển sang màu hồng tươi và giữ màu trong ít nhất 30 giây.

Trong đó: a - số mL dung dịch KOH 0,1N chuẩn độ ở bình thí nghiệm. b - số ml KOH 0,1N dùng chuẩn độ ở bình kiểm tra. c - số gam chất béo.

5,611 - số mg KOH trong 1 mL KOH 0,1N.

Độ acid của dầu mỡ được biểu thị bằng tỷ lệ phần trăm acid béo tự do, thường tính theo acid oleic do sự phổ biến của nó trong nhiều loại dầu Công thức tính độ acid là: Độ axit = % acid béo tự do = AV 0,503.

Trong quá trình ôi hóa chất béo, các peroxyd hình thành có khả năng phản ứng với KI trong môi trường acid, dẫn đến việc giải phóng iod Định phân iod được thực hiện bằng cách sử dụng dung dịch thiosulfate natri.

Chỉ số peroxyd được tính bằng số mili – đương lượng thiosulfate kết hợp hết với lượng iod được giải phóng.

Dung dịch choloroform – acid acetic.

Dung dịch hồ tinh bột 1%.

Dung dịch natri thiosulfate Na2S2O3.

Dung dịch KI bão hòa, được pha mới nhất, làm sạch iod và các chất iod tự do.

Lấy 2 erlen dung tích 250ml Cho vào bình 1 (bình thí nghiệm) 2 g dầu, bình 2 (bình kiểm tra) 2 mL nước cất Cho thêm vào mỗi bình 10 mL dung dịch hỗn hợp axit axetic và clorofom (tỉ lệ 2:1), 1 mL dung dịch KI mới pha (hoặc một ít tinh thể KI), đậy nút Lắc hỗn hợp cẩn thận và đặt vào chỗ tối 10 phút Cho thêm 25 mL nước cất Cho thêm 0,5 mL dung dịch hồ tinh bột 1% và chuẩn độ iod tạo thành bằng dung dịch Na2S2O3 0,1N cho đến khi mất màu xanh.

Chỉ số peroxyd được tính theo công thức:

Trong đó: V1 - thể tích dung dịch Na2S2O3 dùng định phân mẫu thí nghiệm, mL.

V2 - thể tích dung dịch Na2S2O3 dùng định phân mẫu trắng, mL.

N - nồng độ dung dịch Na2S2O3 đã dùng. m - khối lượng mẫu thí nghiệm, g.

2.3.1.3 Hàm lượng lipid tổng - phương pháp Adam-Rose-Gottlieb.

Trong môi trường amoniac và cồn, việc chiết xuất lipid được thực hiện bằng ete và ete dầu hỏa Sau khi cân lipid, chúng ta có thể tính toán hàm lượng lipid có trong 100g thực phẩm.

Dung dịch ethanol – amoniac (208,5 mL ethanol + 7,5 mL NH4OH đậm đặc, định mức nước cất lên 250 mL).

Cho vào phễu chiết 10 mL dầu, 10 mL dung dịch ethanol – amoniac, 11 mL diethylether và 1-2 giọt phenolphtalein 1%, sau đó lắc mạnh trong 10-15 phút và để yên trong 30 phút Tiến hành tách bỏ lớp dưới, thêm 10 mL ether dầu hỏa vào phễu chiết, lắc mạnh và để yên trong 15 phút trước khi tách bỏ lớp lắng dưới đáy Cuối cùng, cho lớp trên vào bình cô quay và cô quay ở 50 o C cho đến khi đạt khối lượng không đổi.

Hàm lượng lipid được xác định theo công thức

Trong đó: m - khối lượng mẫu sau tích ly lipid và cô quay cho bay hết dung môi, gam.

V: thể tích mẫu, mL (V= 10mL).

2.3.2 Phương pháp kháng oxy hóa bắt gốc tự do DPPH

Các chất nghiên cứu có khả năng kháng oxy hóa thông qua cơ chế bắt gốc tự do, cụ thể là chuyển đổi gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) từ màu tím sang màu vàng nhạt Để xác định khả năng bắt gốc tự do của các chất này, phương pháp đo độ hấp thu mẫu tại bước sóng λ = 517 nm được áp dụng, với axit ascorbic (Vitamin C) được sử dụng làm chất đối chiếu.

Hình THỰC NGHIỆM.2 Phản ứng bắt gốc tự do DPPH của chất kháng oxy hóa

2.3.2.2.1 Khảo sát sơ bộ khả năng bắt gốc tự do

- DPPH được hũa tan trong dung mụi methanol ở nồng độ 20 àg/mL.

- Các mẫu thử nghiệm được giữ nguyên nồng độ ban đầu.

Cho 200 µL mẫu thử vào 2800 µL dung dịch DPPH, sau đó lắc đều và thực hiện phản ứng ở nhiệt độ phòng trong buồng tối trong 30 phút Cuối cùng, đo độ hấp thu của mẫu tại bước sóng λ = 517 nm.

- Mẫu trắng được thực hiện bằng cỏch cho 200 àL mẫu thử vào 2800 àL dung dịch DPPH, vortex cho đều và đo độ hấp thu ở bước sóng λ = 517 nm.

- Ống khụng bao gồm 200 àL methanol và 2800 àL dung dịch DPPH, vortex đều và đo độ hấp thu ở bước sóng λ = 517 nm.

- Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

- Hoạt tính kháng oxy hóa theo phương pháp bắt gốc tự do DPPH được tính theo công thức.

Tỉ lệ bắt gốc DPPH: (%) 1  s b  100 c

Trong đó: Ac: Độ hấp thu của DPPH khi không có mẫu (ống không)

As: Độ hấp thu của dung dịch chứa mẫu thử

Ab: Độ hấp thu của mẫu trắng.

Dựa trên các giá trị phần trăm bắt gốc DPPH, chúng tôi đã tiến hành so sánh và lựa chọn mẫu thử có tỉ lệ bắt gốc cao nhất để xác định giá trị IC50.

2.3.2.2.2 Tiến hành xác định giá trị IC50

 Xác định IC 50 của mẫu thử nghiệm

- DPPH được hũa tan trong dung mụi methanol ở nồng độ 20 àg/mL.

- Hòa tan mẫu trong methanol ở các nồng độ khác nhau: 200; 400; 600; 800; và

Cho 500 àL mẫu vào 2500 àL dung dịch DPPH và thực hiện cho từng nồng độ Dung dịch được lắc đều và phản ứng diễn ra ở nhiệt độ phòng trong buồng tối trong vòng 30 phút Sau đó, đo độ hấp thu tại bước sóng λ = 517 nm.

- Mẫu trắng được thực hiện bằng cỏch cho 500 àL mẫu thử vào 2500 àL dung dịch DPPH, vortex cho đều và đo độ hấp thu ở bước sóng λ = 517 nm.

- Mỗi thí nghiệm được thử nghiệm lặp lại 3 lần để tính giá trị trung bình Giá trị

IC50 được tính thông qua đường chuẩn phần trăm ức chế.

 Xác định IC 50 của Ascorbic acid

Hòa tan Ascorbic acid trong nước cất với nồng độ ban đầu 1 mg/mL Để pha loãng, lấy 0,1 mL dung dịch Ascorbic acid 1 mg/mL và thêm 9,9 mL nước cất, tạo thành 10 mL dung dịch Ascorbic acid với nồng độ 10 µg/mL.

- Pha loãng dung dịch Ascorbic acid trong nước ở các nồng độ khác nhau: 2; 4; 6; 8 àg/mL.

Cho 500 µL dung dịch axit ascorbic vào 2500 µL dung dịch DPPH, thực hiện từng nồng độ riêng lẻ Dung dịch được lắc đều và phản ứng diễn ra ở nhiệt độ phòng trong buồng tối trong thời gian 30 phút, sau đó đo độ hấp thu tại bước sóng λ = 517 nm.

- Mẫu trắng được thực hiện bằng cỏch cho 500 àL dung dịch Ascorbic acid vào

2500 àL dung dịch DPPH, vortex cho đều và đo độ hấp thu ở λ = 517 nm.

- Mỗi thí nghiệm được thử nghiệm lặp lại 3 lần để tính giá trị trung bình Giá trị IC50 được tính thông qua đường chuẩn phần trăm ức chế.

2.3.3 Phương pháp khảo sát khả năng kháng vi sinh vật

2.3.3.1 Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật là xem xét khả năng tăng trưởng của vi sinh vật khi có mặt của chất kháng sinh ở nồng độ nhất định Có hai chỉ số đánh giá khả năng kháng vi sinh vật là MIC và MBC.

Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là mức kháng sinh thấp nhất có khả năng ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật, giúp quan sát được bằng mắt thường trong các điều kiện nhất định.

NỘI DUNG THỰC NGHIỆM

2.4.1 Khảo sát tính chất ban đầu của nguyên liệu

Thực hiện theo phương pháp đã được trình bày trong mục 2.3.1.

2.4.2 Nghiên cứu điều kiện thủy phân dầu dừa bằng xúc tác enzyme Lipase

Các bước tiến hành quá trình thủy phân dầu dừa bằng enzyme lipase được trình bày trong hình 2.3.

Để chuẩn bị nhũ dầu, khảo sát sơ bộ cho thấy lượng gelatine tối ưu cho độ bền nhũ từ 5-6 giờ là 1,5% (w/v) Dựa trên các điều kiện thủy phân, lượng dầu, đệm và gelatine 1,5% (w/v) được chuẩn bị phù hợp Hỗn hợp này sẽ được đồng hóa bằng máy đồng hóa áp suất cao ở áp suất 200 bar trong 10 phút, sau đó thu nhận nhũ dầu để tiến hành bước thủy phân dầu bằng enzyme lipase.

- Cho dung dịch enzyme vào erlen chứa nhũ dầu, canh chỉnh nhiệt độ cho phù hợp và bắt đầu tính giờ

- Sau 6 giờ, kết thúc phản ứng thủy phân bằng cách vô hoạt enzyme lipase với 5 mL ethanol 99 o và để nguội

Để định lượng sơ bộ lượng acid béo sinh ra, hút 3 mL dịch sau thủy phân và tiến hành chuẩn độ với dung dịch NaOH 0,1N, sử dụng phenolphtalein 1% làm chất chỉ thị Tiến hành chuẩn độ cho đến khi màu hồng bền xuất hiện trong 30 giây.

Quá trình thủy phân dầu dừa bằng enzyme lipase chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố, bao gồm nguồn nguyên liệu, tỉ lệ dầu: đệm, pH, tỉ lệ enzyme:cơ chất, nhiệt độ và thời gian thủy phân Luận văn này sẽ tập trung khảo sát bốn yếu tố chính: tỉ lệ dầu: đệm, pH, tỉ lệ enzyme:cơ chất và nhiệt độ, trong khi các yếu tố khác sẽ được nghiên cứu trong các công trình nghiên cứu tiếp theo.

2.4.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ dầu:đệm

- Tỉ lệ dầu : đệm của nhũ dầu thay đổi: 1:1; 1:2; 1:3; 1:4; 1:5 (%, v/v)

Gelatin Dầu dừa Đệm pH Đồng hóa

Hình 2.3 Quy trình thủy phân dầu dừa sử dụng enzyme lipase

- Tỉ lệ enzyme cơ chẩt: 0,6 (%, w/v)

- Thời gian thủy phân: 6 giờ.

- Phần trăm bắt gốc tự do DPPH của sản phẩm thủy phân sau khi chiết.

- Đường kính vùng ức chế vi sinh vật của sản phẩm thủy phân sau khi chiết.

2.4.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của pH:

- pH của nhũ dầu thay đổi: 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5

- Tỉ lệ dầu: đệm tối ưu chọn từ mục 2.4.2.1

- Tỉ lệ enzyme cơ chẩt: 0,6 (%, w/v)

2.4.2.3 Khảo sát tỉ lệ enzyme:cơ chất

- Tỉ lệ enzyme:cơ chất của nhũ dầu thay đổi: 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8 (%, w/v)

- Tỉ lệ dầu:đệm tối ưu chọn từ mục 2.4.2.1

- pH thủy phân tối ưu chọn từ mục 2.4.2.2

2.4.2.4 Khảo sát nhiệt độ thủy phân

- Nhiệt độ thủy phân thay đổi: 32; 37; 42; 47; 52 o C

- Tỉ lệ dầu:đệm tối ưu chọn từ mục 2.4.2.1

- pH thủy phân tối ưu chọn từ mục 2.4.2.2

- Tỉ lệ enzyme cơ chẩt tối ưu chọn từ mục 2.4.2.3

2.4.3 Chiết tách sản phẩm sau phản ứng thủy phân

Sau khi thủy phân dầu dừa bằng enzyme lipase, sản phẩm chính thu được gồm các acid béo tự do, glycerol, cùng với mono-, diglycerides và triglycerides chưa được thủy phân Dịch sau thủy phân sẽ được chia thành hai phân đoạn: phân đoạn không phân cực (dầu sau thủy phân) và phân đoạn phân cực (chủ yếu chứa các acid béo).

Quy trình tách chiết sản phẩm sau phản ứng thủy phân được thể hiện trong hình 2.4.

Quá trình tách phân đoạn sản phẩm thủy phân bắt đầu bằng việc trung hòa hỗn hợp bằng KOH 0,5 N, sau đó thực hiện chiết xuất với 100 mL n-hexan.

Trong quy trình chiết xuất, 50 mL nước cất được cho vào bình chiết, sau đó thu được hai lớp: lớp dưới chứa phân đoạn phân cực với acid béo tự do dạng muối K và lớp trên chứa phân đoạn không phân cực tan trong n-hexan Phân đoạn phân cực được acid hóa bằng HCl 6 N đến pH ≈ 1, tiếp theo được chiết xuất với diethylether để thu hồi acid béo tự do Các phân đoạn sau đó được làm khan bằng Na2SO4 khan và cô quay ở 45 °C để loại bỏ dung môi, thu được sản phẩm cuối cùng sau thủy phân.

Mục tiêu của nghiên cứu này là khảo sát hoạt tính sinh học của acid béo trong dầu dừa, được thủy phân bằng enzyme lipase từ tuyến tụy heo Để thực hiện nghiên cứu, chúng tôi sẽ sử dụng phân đoạn phân cực, chứa các acid béo tự do, nhằm đánh giá hoạt tính sinh học của chúng.

Chuyển qua bình chiết Dầu sau thủy phân

Hình 2.4 Sơ đồ chiết thu acid béo tự do

2.4.4 Xác định khả năng kháng oxy hóa của sản phẩm thủy phân

Phân đoạn phân cực chứa acid béo sẽ được khảo sát khả năng kháng oxy hóa dưới các điều kiện thủy phân khác nhau Mẫu tối ưu với phần trăm bắt gốc cao nhất sẽ được đánh giá khả năng kháng oxy hóa thông qua việc xác định giá trị IC50 và so sánh với khả năng kháng oxy hóa của Ascorbic acid.

Thực hiện theo phương pháp DPPH đã được trình bày trong mục 2.3.2.

2.4.5 Xác định khả năng kháng vi sinh vật của sản phẩm thủy phân

Phân đoạn phân cực chứa acid béo sẽ được khảo sát khả năng kháng vi sinh vật dưới các điều kiện thủy phân Mẫu tối ưu với đường kính vùng ức chế lớn nhất sẽ được chọn để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) nhằm đánh giá khả năng kháng vi sinh vật.

Thực hiện theo phương pháp kháng vi sinh vật đã được trình bày trong mục 2.3.3.

KẾT QUẢ & BÀN LUẬN

KHẢO SÁT NGUYÊN LIỆU DẦU DỪA

Dựa trên kết quả khảo sát tính chất của dầu dừa, thông số từ nhà sản xuất và các tiêu chuẩn Codex về chất lượng dầu dừa, chúng tôi đã tổng hợp bảng so sánh kết quả như sau:

Bảng KẾT QUẢ & BÀN LUẬN.3 Kết quả thí nghiệm khảo sát tính chất dầu dừa.

Tên chỉ tiêu Kết quả thí nghiệm

Thông số nhà sản xuất

Tiêu chuẩn Codex Hàm lượng tạp chất tính theo khối lượng, % - Không phát hiện -

Chỉ số peroxide, meq/kg 2.0 1.8 ≤ 15

Hàm lượng acid béo tự do theo acid oleic tính theo khối lượng, % 0,06 0.1 0,3

Chỉ số acid, mg KOH/g 0,13 0.1 0.5

Dầu dừa có chỉ số acid và peroxide lần lượt là 0,13 mg KOH/g và 2 meq/kg, cho thấy khả năng chống oxi hóa tốt và thuận lợi cho việc bảo quản Với hàm lượng lipid tổng đạt 99,25%, dầu dừa thể hiện độ tinh khiết cao, làm cho nó trở thành nguyên liệu lý tưởng cho các nghiên cứu.

KHẢO SÁT TÍNH KHÁNG OXY HÓA PHÂN ĐOẠN PHÂN CỰC CỦA SẢN PHẨM THỦY PHÂN

Mẫu thử nghiệm được áp dụng để đánh giá khả năng kháng oxy hóa thông qua phản ứng với gốc tự do DPPH Sự hiện diện của các chất kháng oxy hóa sẽ làm giảm gốc tự do và thay đổi màu sắc của dung dịch ban đầu Quy trình khảo sát được thực hiện theo mục 2.3.2.

Sau khi dầu dừa được thủy phân bằng enzyme lipase, dịch thủy phân sẽ được chiết tách theo quy trình đã mô tả Tiếp theo, hoạt tính kháng oxy hóa của phân đoạn phân cực, chứa các acid béo tự do, sẽ được khảo sát sơ bộ bằng phương pháp bắt gốc tự do DPPH.

3.2.1 Ảnh hưởng của tỉ lệ dầu và đệm

Các phân đoạn phân cực sau thủy phân ở các tỉ lệ dầu:đệm khác nhau được đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa, thể hiện ở hình 3.1.

Khi thay đổi tỉ lệ dầu:đệm từ 1:1 đến 1:5, phần trăm bắt gốc DPPH đạt cao nhất ở tỉ lệ 1:4 (v/v) với 21,44%, trong khi thấp nhất là 13,94% ở tỉ lệ 1:1 (v/v) Hình 3.1 cho thấy, khi tỉ lệ dầu:đệm tăng lên, tỉ lệ bắt gốc DPPH cũng tăng dần, nhưng giảm xuống còn 18,98% ở tỉ lệ 1:5.

Tỉ lệ dầu so với đệm là 1:4 (v/v) là tối ưu cho việc tạo nhũ tương dầu dừa, giúp tạo ra nhũ tương bền vững với diện tích bề mặt liên pha dầu-nước lớn, từ đó tăng cường hiệu quả của sản phẩm.

Tỉ lệ dầu:đệm (v/v) ảnh hưởng đến phần trăm bắt gốc DPPH, cho thấy sự quan trọng của diện tích bề mặt tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất Môi trường tối ưu cho enzyme hoạt động sẽ dẫn đến sản phẩm có hoạt tính cao.

Khi tỉ lệ dầu và đệm là 1:1 (v/v), lượng dầu cao làm giảm khả năng tạo nhũ của hệ, dẫn đến diện tích bề mặt phân pha dầu-nước nhỏ, từ đó giảm tiếp xúc giữa enzyme lipase và cơ chất, làm enzyme hoạt động kém Hơn nữa, khi lượng nước thấp, cân bằng động lực học bị thay đổi, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chuyển hóa este thay vì phản ứng thủy phân.

Từ kết quả thu được, chọn tỉ lệ dầu:đệm = 1:4 (v/v) cho các thí nghiệm tiếp theo.

3.2.2 Ảnh hưởng của pH dung dịch đệm

Các phân đoạn phân cực sau thủy phân ở các pH khác nhau được đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa, thể hiện ở hình 3.2.

Enzyme lipase từ tuyến tụy heo hoạt động hiệu quả nhất trong khoảng pH 6-9, tùy thuộc vào loại cơ chất Chúng tôi đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng của pH trong khoảng 6-8,5, và kết quả cho thấy phần trăm bắt gốc DPPH dao động từ 14,5-20%, với giá trị tối ưu đạt được tại pH 7,5.

Do đó, chọn pH 7,5 là điều kiện thủy phân tiếp theo.

3.2.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme và cơ chất

Hình 3.2 Ảnh hưởng của pH dung dịch đệm lên phần trăm bắt gốc DPPH

Các phân đoạn phân cực sau thủy phân ở các tỉ lệ enzyme:cơ chất khác nhau được đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa, thể hiện ở hình 3.3.

Khi tăng tỉ lệ enzyme:cơ chất từ 0,4 % (w/v) lên 0,5 % (w/v), tỉ lệ bắt gốc DPPH tăng lên và đạt cực đại 37,469 % Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng tỉ lệ enzyme:cơ chất, phần trăm bắt gốc DPPH bắt đầu giảm dần Nguyên nhân của hiện tượng này cần được xem xét kỹ lưỡng.

Khi tỉ lệ enzyme:cơ chất cao, lượng cơ chất để enzyme thủy phân trở nên ít, dẫn đến hỗn hợp thủy phân loãng Điều này hạn chế khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất, làm giảm lượng axit béo thu được và khả năng bắt gốc DPPH cũng không cao.

Khi tỷ lệ enzyme:cơ chất quá thấp, lượng cơ chất để enzyme thủy phân tăng cao, nhưng do enzyme không đủ, không thể thủy phân hoàn toàn lượng cơ chất, dẫn đến kết quả bắt gốc DPPH giảm.

Từ kết quả thí nghiệm (hình 3.3) có thể kết luận rằng tỉ lệ enzyme:cơ chất 0,5% (w/v) cho hoạt tính kháng oxi hóa tốt nhất (37,47%).

Như vậy, tỉ lệ enzyme:cơ chất 0,5% (w/v) được chọn để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.

3.2.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Hình 3.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme:cơ (%, w/v) chất lên phần trăm bắt gốc DPPH

Các phân đoạn phân cực sau thủy phân ở các nhiệt độ khác nhau được đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa, thể hiện ở hình 3.4.

Khi nhiệt độ thủy phân tăng từ 37 oC lên 52 oC, tỉ lệ bắt gốc DPPH giảm mạnh từ 36,06% xuống 14,19% Sự giảm này có thể giải thích bởi enzyme Porcine pancreas hoạt động tối ưu ở nhiệt độ từ 35-40 oC; khi vượt quá 40 oC, enzyme lipase Porcine pancreas mất hoạt tính, dẫn đến sản phẩm thủy phân có hoạt tính giảm Vì vậy, nhiệt độ 37 oC là thích hợp cho phản ứng thủy phân.

3.2.5 Đánh giá khả năng kháng oxy hóa của sản phẩm ở điều kiện phản ứng tối ưu

Qua quá trình khảo sát chọn được điều kiện thủy phân dầu dừa bằng enzyme lypase Porcine pancreas:

- Tỉ lệ enzyme:cơ chất 0,5 % (w/v);

Hình 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ ( o C) lên phần trăm bắt gốc DPPH

Xác định và so sánh giá trị IC50 của các sản phẩm thu được từ phân đoạn phân cực và không phân cực trong điều kiện phản ứng tối ưu là cần thiết Nghiên cứu khả năng bắt gốc DPPH của các sản phẩm được thực hiện trong khoảng nồng độ từ 200 đến 1000 µg/mL, với kết quả được thể hiện rõ trong hình 3.5 và 3.6.

Kết quả từ hình 3.5 và 3.6 cho thấy phân đoạn phân cực có khả năng bắt gốc tự do vượt trội hơn so với phân đoạn không phân cực Giá trị Q % của phân đoạn phân cực, chứa các acid béo tự do, dao động từ 28,61 % đến 86,43 %, với IC50 đạt được.

Hình 3.5 Phần trăm bắt gốc DPPH của phân đoạn phân cực

Hình 3.6 Phần trăm bắt gốc DPPH của phân đoạn không phân cực

483,32±3,58àg/mL thỡ phõn đoạn khụng phõn cực (bao gồm cỏc este) cho kết quả Q

Tỷ lệ bắt gốc tự do DPPH trong dầu dừa dao động từ 21,09% đến 73,47%, với giá trị IC50 là 654,15±8,68 µg/mL Nguyên nhân là do các chất không xà phòng hóa như sterol và tocopherol (vitamin E) chỉ chiếm 0,5% trong dầu dừa, nhưng lại có tính chất phân cực và khả năng chống oxi hóa Ngoài ra, các acid béo tự do trong phân đoạn phân cực cũng góp phần vào khả năng bắt gốc tự do DPPH Trong khi đó, ở phân đoạn không phân cực, các acid béo tồn tại dưới dạng liên kết ester với glycerol, dẫn đến khả năng bắt gốc tự do DPPH thấp hơn so với phân đoạn phân cực.

Tiến hành khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của chất đối chứng Axit Ascorbic trong khoảng nồng độ từ 2-10 µg/mL (hình 3.7) nhằm đánh giá khả năng bắt gốc DPPH của sản phẩm thu được.

KHẢO SÁT TÍNH KHÁNG KHUẨN PHÂN ĐOẠN PHÂN CỰC CỦA SẢN PHẨM THỦY PHÂN

3.3.1 Ảnh hưởng của tỉ lệ dầu và đệm

Các phân đoạn phân cực sau thủy phân ở các tỉ lệ dầu:đệm khác nhau được đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật, thể hiện ở bảng 3.2.

Bảng KẾT QUẢ & BÀN LUẬN.4 Ảnh hưởng của tỉ lệ dầu:đệm (v/v) lên đường kính vùng ức chế

Tỉ lệ dầu:đệm Đường kính vòng kháng vi sinh vật (mm)

MRSA MSSA E.faecalis S typhi E.coli

Theo bảng 3.2, phân đoạn phân cực cho thấy hoạt tính kháng vi sinh vật chủ yếu đối với các vi khuẩn gram dương như MRSA, MSSA, đặc biệt mạnh nhất với E.faecalis, với đường kính vùng ức chế khoảng 14-16 mm So sánh đường kính vùng ức chế giữa các chủng vi khuẩn ở các tỉ lệ dầu:đệm khác nhau cho thấy không có sự chênh lệch đáng kể, chỉ khoảng 1-2 mm Điều này chứng tỏ các tỉ lệ dầu:đệm không ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính kháng vi sinh vật của phân đoạn phân cực Do đó, dựa trên kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa, tỉ lệ dầu:đệm = 1:4 (v/v) được chọn để tiếp tục nghiên cứu hoạt tính.

3.3.2 Ảnh hưởng của pH đệm

Các phân đoạn phân cực sau thủy phân ở các pH khác nhau được đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật, thể hiện ở bảng 3.3.

Bảng KẾT QUẢ & BÀN LUẬN.5 Ảnh hưởng của pH đệm lên đường kính vùng ức chế pH Đường kính vòng kháng vi sinh vật (mm)

MRSA MSSA E.faecalis S.typhi E.coli Ps. aeruginosa

Kết quả khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật theo tỉ lệ dầu:đệm cho thấy các phân đoạn phân cực chỉ có khả năng ức chế các chủng vi khuẩn gram dương.

MRSA, MSSA và E.faecalis cho thấy khả năng kháng vi sinh vật khác nhau ở từng pH, tuy nhiên, sự khác biệt về đường kính vùng ức chế giữa các chủng vi khuẩn không đáng kể Điều này cho thấy pH không ảnh hưởng lớn đến hoạt tính kháng vi sinh vật của các phân đoạn phân cực Do đó, pH tối ưu cho hoạt tính kháng oxy hóa được xác định là 7,5.

3.3.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme và cơ chất

Các phân đoạn phân cực sau thủy phân ở các tỉ lệ enzyme:cơ chất (%, w/v) khác nhau được đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật, thể hiện ở bảng 3.4.

Bảng KẾT QUẢ & BÀN LUẬN.6 Ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme:cơ chất (%,w/v) lên đường kính vùng ức chế

Tỉ lệ enzyme:cơ chất

(%, w/v) Đường kính vòng kháng vi sinh vật (mm)

MRSA MSSA E.faecalis S.typhi E.coli

Tỉ lệ enzyme:cơ chất không ảnh hưởng đến hoạt tính kháng vi sinh vật của các phân đoạn phân cực, thể hiện qua ba chủng vi khuẩn gram dương MSSA, MRSA và E.faecalis với đường kính vùng ức chế tương đương Dựa vào kết quả phần trăm bắt gốc DPPH, tỉ lệ 0,5% (w/v) được chọn là tỉ lệ tối ưu cho phản ứng thủy phân.

3.3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Các phân đoạn phân cực sau thủy phân ở các nhiệt độ khác nhau được đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật, thể hiện ở bảng 3.5.

Bảng KẾT QUẢ & BÀN LUẬN.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên đường kính vùng ức chế của phân đoạn acid béo

( o C) Đường kính vòng kháng vi sinh vật (mm)

MRSA MSSA E.faecalis S.typhi E.coli Ps. aeruginosa

Khả năng kháng vi sinh vật của phân đoạn phân cực giảm nhẹ khi nhiệt độ tăng, chỉ kháng được các chủng vi khuẩn gram dương Kết quả cho thấy sự chênh lệch không đáng kể về đường kính vùng ức chế ở các nhiệt độ khác nhau, do đó 37 o C được chọn là nhiệt độ tối ưu dựa trên hoạt tính kháng oxy hóa.

Kết quả khảo sát tính kháng vi sinh vật của phân đoạn phân cực từ thủy phân dầu dừa cho thấy sản phẩm này, được tạo ra từ enzyme lipase tuyến tụy heo, có khả năng kháng vi sinh vật Hoạt tính kháng vi sinh vật của sản phẩm không phụ thuộc nhiều vào điều kiện thủy phân và chỉ thể hiện hiệu quả đối với một số loại vi sinh vật nhất định.

Ba chủng vi khuẩn gram dương bao gồm MRSA, MSSA và E.faecalis được khảo sát để xác định giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của sản phẩm thủy phân.

3.3.5 Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật sản phẩm ở điều kiện phản ứng tối ưu

Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật đã được thực hiện trên phân đoạn phân cực của sản phẩm thủy phân với nồng độ từ 500 đến 5000 àg/mL, dưới điều kiện tối ưu: tỉ lệ dầu:đệm 1:4, pH 7,5, tỉ lệ enzyme:cơ chất 0,5% và nhiệt độ 37 o C Kết quả về khả năng kháng vi sinh vật của phân đoạn này được trình bày chi tiết trong bảng 3.6.

Bảng KẾT QUẢ & BÀN LUẬN.8 Khảo sát nồng độ mẫu acid béo lên từng vi sinh vật

Phõn đoạn Nồng độ (àg/mL)

Theo bảng 3.6, mỗi chủng vi khuẩn có nồng độ ức chế khác nhau, với giá trị MIC của phân đoạn phân cực là 1000 àg/mL cho MRSA, 3000 àg/mL cho MSSA và 4000 àg/mL cho E.faecalis.

Phân đoạn không phân cực có giá trị MIC > 5000 àg/mL cho thấy sự khác biệt về hoạt tính kháng vi sinh vật giữa hai phân đoạn Phân đoạn phân cực chứa các acid béo tự do, trong đó acid lauric là thành phần chủ yếu và có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất trong các acid béo no mạch trung bình Sản phẩm thủy phân từ dầu dừa có khả năng kháng các chủng vi khuẩn gram dương, với acid lauric là thành phần chính có hoạt tính kháng khuẩn Thí nghiệm cho thấy điều kiện phản ứng không ảnh hưởng lớn đến hàm lượng acid lauric Theo nghiên cứu của Floriana Sundari Loung (2014), acid lauric trong sản phẩm thủy phân từ dầu dừa có khả năng kháng cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm, nhưng trong các nồng độ khảo sát, chỉ có hoạt tính với vi khuẩn Gram dương Điều này có thể do vi khuẩn Gram âm có lớp lipopolisaccharide bảo vệ, trong khi acid béo dễ dàng tương tác với vi khuẩn Gram dương nhờ lớp peptydoglycan dày Do đó, cần phân lập acid lauric hoàn toàn để khảo sát khả năng kháng vi khuẩn Gram âm.

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN & KIẾN NGHỊ Đề tài “Khảo sát hoạt tính sinh học của sản phẩm thủy phân dầu dừa bằng enzyme lipase” đã hoàn thành được mục tiêu ban đầu đề ra và thu được một số kết quả như sau:

Thủy phân dầu dừa đã được thực hiện bằng enzyme lipase từ tuyến tụy lợn, qua đó tách chiết sản phẩm thu được hai phân đoạn: phân cực, chứa các acid béo tự do, và phân không phân cực, chủ yếu là dầu sau thủy phân.

Khảo sát sơ bộ cho thấy hoạt tính kháng oxy hóa của phân đoạn phân cực Nghiên cứu cũng xác định điều kiện tối ưu để thủy phân dầu dừa bằng enzyme, nhằm đạt được sản phẩm có hoạt tính kháng oxy hóa tốt nhất Tỉ lệ dầu so với đệm được tối ưu hóa ở mức 1:4 (v/v) và pH là 7,5, cùng với tỉ lệ enzyme so với cơ chất thích hợp.

Kết quả nghiên cứu cho thấy giá trị IC50 của hai phân đoạn sản phẩm sau phản ứng thủy phân ở điều kiện tối ưu Cụ thể, phân đoạn phân cực có hoạt tính kháng oxy hóa cao hơn với IC50 là 483,32±3,58 µg/mL, trong khi đó IC50 của phân đoạn không phân cực là 654,15±8,68 µg/mL.

Khảo sát sơ bộ cho thấy hoạt tính kháng vi sinh vật của phân đoạn phân cực không bị ảnh hưởng nhiều bởi các điều kiện thủy phân Sản phẩm thủy phân này có khả năng kháng khuẩn đối với ba chủng vi sinh Gram dương, trong đó có MRSA.

Định dạng
Số trang	61
Dung lượng	35,97 MB