ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA HÓA HỌC Phạm Thùy Hương GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC PHÂN ĐOẠN DICLOMETAN CÂY MẢNH CỘNG (CLINACANTHUS NUTANS) Khóa luận tốt nghiệp đại học hệ chính quy Ngành Hóa dược (Chương trình đào tạo chuẩn) Hà Nội – 2021 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA HÓA HỌC Phạm Thùy Hương GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC PHÂN ĐOẠN DICLOMETAN CÂY MẢNH CỘNG (CLINACANTHUS NUTANS) Khóa luận tốt nghiệp đại học hệ chín.
TỔNG QUAN
GIỚI THIỆU VỀ HỌ ACANTHACEAE
Theo hệ thống phân loại của Takhtajan (2009), Clinacanthus sp Có vị trí phân loại trong giới thực vật như sau [6]
Phân lớp Hoa môi (Lamiidae)
Liên bộ Hoa môi (Lamianae)
Bộ hoa Mõm sói (Scrophulariales)
Sơ đồ 1: Vị trí phân loại của chi Clinacanthus theo Takhtajan
1.1.2 Thực vật học và phân bố:
Họ Ô rô (Acanthaceae) là một họ thực vật hai lá mầm, bao gồm khoảng 214-250 chi và 2.500-4.000 loài, tùy thuộc vào hệ thống phân loại Hệ thống phân loại APG công nhận ít chi hơn nhưng lại có nhiều loài hơn, với khoảng 220 chi và 4.000 loài Tại Việt Nam, họ Ô rô có khoảng 40 chi và khoảng 200 loài.
Hình 1: một số cây thuộc họ Ô rô (Acanthaceae)
Dây bông xanh Cây quả nổ
1.1.3 Một số đặc điểm của cây họ Ô rô (Acanthaceae) [5]
Thân: Phần lớn là cây thảo nhiều năm, cây bụi, cỏ đứng hay dây leo, ít khi là cây gỗ
Lá của cây có hình dạng đơn, mọc đối và không có lá kèm, với phiến lá nguyên hoặc có răng cưa Cụm hoa có thể mọc riêng lẻ hoặc tụ lại thành chùm, gié ở nách lá hoặc ngọn cây Nhiều loài trong họ này có cụm hoa với nhiều lá bắc và lá bắc con, thường được sắp xếp kết hợp và có lông hoặc gai.
Hoa: Lưỡng tính, không đều, mẫu 5 Mỗi hoa mọc ở nách một lá bắc và có hai lá bắc con
Bao hoa có năm lá có thể rời rạc hoặc dính liền, với năm cánh hoa kết hợp tạo thành một ống hình kèn không đều Phần trên của ống xòe ra thành hai môi không đồng nhất; môi trên được hình thành từ hai cánh hoa sau, trong khi môi dưới được tạo ra từ sự kết hợp của ba cánh hoa phía dưới.
Bộ nhị của hoa bao gồm hai nhị dài và hai nhị ngắn, hoặc có thể giảm còn hai nhị Nhị đích nằm trên ống tràng, xen kẽ với các cánh hoa Bao phấn thường có một rìa lông như bàn chải ở mặt lưng.
Bộ nhụy gồm 2 lá noãn sắp xếp theo vị trí trước và sau, dính liền tạo thành bầu trên với 2 ô, mỗi ô chứa từ 2 đến nhiều noãn, trong đó noãn được đính ở trung trụ Đĩa mật lớn bao quanh đáy bầu noãn.
Quả: thường là quả 2 nang ô, chứa 2 hay nhiều hạt ở mỗi ô
Hạt không có nội nhũ khô, có khả năng được phát tán xa nhờ vào cán phôi lớn và có thể bật lên như lò xo khi quả nứt ra Mỗi hạt đều có một cuống được hình thành từ việc cán noãn hóa mộc.
ĐẶC ĐIỂM LOÀI CLINACANTHUS NUTANS
Tên thường gọi: Mảnh cộng
Tên khác: Bìm bịp, lá cầm, cây xương khỉ
Tên khoa học: Clinacanthus nutans
Tên đồng nghĩa: Clinacanthus burmanni Nees
Hình 2: Cây mảnh cộng và hoa cây mảnh cộng
Tiểu mộc hơi trườn với lá lớn, thon dài 7-9 × 2–2,5cm, bề mặt lá láng và có bìa giún Gié hoa dày, xụ ở ngọn nhánh, với hoa màu đỏ cao từ 3-5cm, đài cao 1cm có lông trĩn Vành hoa dài 5cm, có môi đứng và môi dưới 3 răng Tiểu nhụy có 2 phần, bao phấn mang màu vàng xanh, và nang dài 1,5cm.
Nơi sống và thu hái
Cây mảnh cộng, một loài cây được nghiên cứu rộng rãi, phân bố chủ yếu ở các quốc gia như Thái Lan, Malaysia, Indonesia, Trung Quốc và Việt Nam Tại Việt Nam, cây này mọc hoang và được trồng phổ biến ở các tỉnh phía Nam cũng như khu vực Bắc Bộ, bao gồm Hòa Bình, Thanh Hóa, Hà Tây, Lâm Đồng, Tây Ninh, Đồng Nai và Bình Phước.
Mọc ở hàng rào, rừng thay lá, bình nguyên, bờ bụi Có thể thu hái cây lá quanh năm, dùng tươi hay phơi khô dùng dần
Thu hái: toàn bộ cây trên mặt đất.
TÁC DỤNG DƯỢC LÝ CỦA CÂY MẢNH CỘNG
Mảnh cộng, theo nhiều nghiên cứu toàn cầu, là một loại cây thuốc có tiềm năng chữa bệnh đáng chú ý Chiết xuất từ lá Mảnh cộng đã được chứng minh có tác dụng chống oxy hóa, ngăn chặn sự tăng sinh tế bào, phòng ngừa ung thư, kháng virus và giảm viêm.
Panthong và cộng sự đã chỉ ra răng các chiết xuất từ lá của C.nutans có hoạt tính chống viêm mạnh [33]
Payong Wanikiat đã chứng minh tác dụng kháng viêm mạnh mẽ của các chiết xuất từ loài Clinacathus nutans thông qua mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenin và phù tai chuột bằng ethyl phenylpropionat Kết quả nghiên cứu cho thấy khả năng ức chế myeloperoxidase đáng kể trong cả hai mô hình thí nghiệm.
1.3.2 Tác dụng chống oxy hóa
Nghiên cứu của Patchareewan Pannangpecth và cộng sự đã chỉ ra rằng cao chiết ethanol từ cây Mảnh cộng có tác dụng chống oxy hóa hiệu quả, được xác định qua khả năng thu dọn gốc tự do DPPH và ức chế sản xuất peroxid trong các đại thực bào chuột khi bị kích thích bởi myristat phorbol acetat (MPA), đồng thời bảo vệ hồng cầu khỏi sự tan huyết do AAPH.
Nghiên cứu của Yoke Keong Yong cho thấy dịch chiết cloroform từ Mảnh cộng có khả năng chống oxy hóa hiệu quả đối với các gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl và galvinoxyl, nhưng lại ít hiệu quả hơn đối với gốc tự do nitric oxid và hydrogen peroxide.
Lá Mảnh cộng tại Thái Lan được sử dụng để điều trị nhiễm herpes Nghiên cứu của Jayavasu và cộng sự đã chỉ ra rằng chiết xuất từ lá Mảnh cộng có khả năng bất hoạt virus herpes simplex type 2 (HSV-2) khi kết hợp với acyclovir Kết quả cho thấy chiết xuất này có hiệu quả ức chế sự hình thành mảng bám do HSV-2 trên dòng tế bào thận.
Nhóm tác giả Wirotesangthong đã nghiên cứu hiệu quả khả năng chống lại virus cúm H1N1 của dịch chiết từ lá Mảnh cộng khi thử nghiệm trên chuột [19]
1.3.4 Hoạt tính chống nọc độc rắn
Nghiên cứu cho thấy dịch chiết nước từ lá Mảnh cộng có khả năng chống lại nọc rắn, giảm tỷ lệ tử vong ở chuột bị hoành cơ hoành-thần kinh từ 100% xuống 63±3,34% Ngược lại, dịch chiết cồn 95% (2g/kg) không hiệu quả khi tiêm tĩnh mạch, màng bụng hoặc cho uống.
Nghiên cứu của Lau KW và cộng sự đã đánh giá hiệu lực của cao chiết methanol của lá Mảnh cộng trong 14 ngày với liều 250 mg/kg, 500 mg/kg, 1000
Nghiên cứu cho thấy rằng liều 7 mg/kg thể trọng ảnh hưởng đến hoạt động của acetylcholinesterase ở chuột đực, với hoạt tính cao nhất được ghi nhận ở gan, tiếp theo là não, thận và tim Việc uống dịch chiết methanol từ lá trong 14 ngày có khả năng điều chỉnh dẫn truyền thần kinh cholinergic thông qua việc kích hoạt hoạt tính acetylcholinesterase tại thận, gan và tim của chuột.
1.3.6 Tác dụng chống ung thư
Chiết xuất cloroform cho thấy hiệu quả chống tăng sinh cao nhất trên dòng tế bào 0,03% và Raji với tỷ lệ 88,97 ±1,07% ở nồng độ 100 ug/ml Hiệu quả này phụ thuộc vào nồng độ trên năm dòng tế bào ung thư khác, nhưng không ảnh hưởng đến tế bào IMR-32.
Năm 2015, Danmin Huang và nhóm tác giả đã phát hiện rằng chiết xuất cồn 30 từ lá Mảnh cộng có khả năng chống khối u thông qua việc tăng cường phản ứng miễn dịch, cho thấy tiềm năng của nó như một liệu pháp điều trị và phòng ngừa ung thư.
Năm 2019, Nik Abd Rahman và cộng sự đã nghiên cứu và chỉ ra rằng chiết xuất từ cây C nutans có khả năng chống khối u và chống oxy hóa hiệu quả trên mô hình vú chuột 4 TI mà không gây ra tác dụng phụ hay phản ứng viêm, ngay cả ở liều cao 1000 mg/kg.
1.3.7 Nghiên cứu về độc tính
Nghiên cứu về độc tính cấp từ dịch chiết etanol của Mảnh cộng lá cho thấy không có tác dụng phụ độc tính khi được sử dụng qua đường uống, tiêm dưới da hoặc tiêm màng bụng trên động vật Thêm vào đó, một nghiên cứu về độc tính mãn cho chuột uống dịch chiết trong 90 ngày đã cho kết quả khả quan, khi kiểm tra các cơ quan nội tạng không phát hiện bất kỳ sự bất thường nào.
1.3.8 Hoạt tính đáp ứng miễn dịch
Nghiên cứu của Busarawan Sriwanthan và cộng sự đã khảo sát ảnh hưởng của cao chiết cồn từ lá mảnh cộng lên hệ thống miễn dịch, đặc biệt là vai trò của nó trong việc điều chỉnh phản ứng miễn dịch qua tế bào trung gian (CMIR) trong ống nghiệm Kết quả cho thấy cao chiết này tác động đến tế bào lympho, chức năng của tế bào chết tự nhiên (NK), dẫn đến sự sản xuất tế bào lympho đáng kể và giảm hoạt động của tế bào NK Điều này chỉ ra rằng hiệu quả của mảnh cộng trong CMIR có thể liên quan đến việc tạo ra IL-4.
Các sản phẩm thương mại được làm từ Clinacanthus nutans hiện có trên thị trường
Hình 3: Các sản phẩm từ cây Mảnh Cộng
CÔNG DỤNG CỦA MẢNH CỘNG TRONG Y HỌC DÂN GIAN
Mảnh cộng được dùng chữa các vết thương do trâu bò húc Ở một số địa phương nhân dân dùng chữa dị ứng, uống trong và bôi ngoài da
Cây trồng làm hàng rào không chỉ có giá trị trang trí mà còn mang lại nhiều lợi ích sức khỏe Lá non có thể nấu canh, trong khi lá khô có mùi thơm dùng để ướp bánh Lá tươi có tác dụng chữa đau sưng mắt khi giã đắp và giúp giảm đau trong trường hợp trật gân, xương khớp, hoặc gãy xương Kết hợp với cây Mò Hoa Trắng, lá cây được giã ra để lấy nước uống, hỗ trợ điều trị bệnh lưỡi trắng ở trẻ em Tại Hải Nam, Trung Quốc, lá cây được sử dụng để trị thương tích do dao chém và điều trị thiếu máu, phong thấp, thường dùng cành lá khô sắc uống và lá tươi giã đắp ngoài da.
Trà Mảnh Cộng Dầu cù là Mảnh cộng, nghệ, riềng
Bánh Mảnh Cộng Thuốc khớp
Ở Lào và Campuchia, lá được sử dụng để đắp lên mi mắt nhằm chữa viêm mắt Tại Indonesia, lá có công dụng trong việc điều trị bệnh lỵ Ở Thái Lan, lá tươi giúp chữa bỏng, côn trùng đốt, eczema và mụn rộp Ngoài ra, dịch chiết cồn từ lá tươi còn được sử dụng để điều trị phát ban, cũng như các vết thương do rắn và côn trùng cắn, đặc biệt là tổn thương bộ phận sinh dục do virus HSV và VZS.
MỘT SỐ BÀI THUỐC THEO ĐÔNG Y TỪ CÂY MẢNH CỘNG
Bài 1: Chữa lở miệng ở người lớn và trẻ em: lá mảnh cộng tươi rửa sạch, giã nát thêm ít nước, lược lấy nước ngậm từ từ rồi nuốt Liều dùng: 20-60g/ngày [38]
Bài 2: Viêm gan mãn vàng da, nóng hâm hấp lòng bàn tay, sốt về chiều, tiểu vàng, bứt rứt, khó ngủ, đại tiện táo bón,sắc mặt sạm: Toàn cây mảnh cộng: 30g khô râu bắp 20g, lá cây vọng cách 12g, lá quao 12g, sâm đại hành 16g, trần bì 10g, sắc với 1000ml nước giữ sôi nhỏ lửa 30 phút, chia làm 3 lần uống trong ngày.[38]
Bài 3: Các khớp sưng đau mãn tính: toàn cây mảnh cộng 30g, rễ và thân cây gối hạc 20g, toàn cây trâu cổ 20g, chùm gởi cây dâu tằm 20g nấu với 1,2 lít nước còn 300ml chia 3 lần uống sau bữa ăn Uống liên tục 5-15 ngày.[38]
Bài 4: Chữa trướng bụng do sơ gan hoặc viêm thận mạn tính: dùng khiên ngưu tử 80g, hồi hương 40g tất cả nghiền mịn trộn đều mối ngày uống 1 lần mỗi lần uống 8g, uống khi đói bụng, chiêu thuốc bằng nước sôi, uống liên tục 2-3 ngày [38]
Bài 5: Chữa đại tiểu tiện không thông: mảnh cộng đem tán mịn , mỗi lần uống
Bài 6: Trị thoái hóa cột sống, gai cột sống, đau nhức lưng: lá cây mảnh cộng tươi 80g, lá cây thuốc cứu tươi 50g, của sâm đại hành tươi 50g, giã nhuyễn cả 3 thứ xào nóng với dấm, để ấm đắp vào chỗ đau, băng chặt lại mỗi tối trước khi đi ngủ, sáng mở ra, liên tục 5-10 ngày.[38]
TÍNH VỊ
Theo đông y mảnh cộng có vị cay, tính nóng, hơi có độc, vào 3 kinh: thủ thái âm phế, túc thiếu âm thận và thủ dương minh đại tràng [38]
CÔNG NĂNG CHỦ TRỊ
Theo đông y, thuốc có tác dụng tả thấp nhiệt ở hô hấp, giúp trục đờm, tiêu ẩm và lợi tiểu, hiệu quả trong việc chữa trị tiện bí, cước khí, hạ khí và cước thũng Ngoài ra, thuốc còn có khả năng sát khuẩn Tuy nhiên, theo tài liệu cổ, không nên sử dụng thuốc này cùng với khiên ngưu tử và ba đậu.
Có tác dụng lợi thủy, hành khí Dùng trong trường hợp trướng bụng, chân tay phù nề, ngực bụng đầy tức, khó thở, đại tiện bí, tiểu tiện ít
Theo y học cổ truyền, toàn cây có tác dụng giảm đau, hạ sốt, chống viêm, điều kinh [38]
TỔNG QUAN VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC
Global chemical studies have revealed that Mảnh cộng is rich in a variety of bioactive compounds, including alkaloids, saponins, flavonoids, triterpenoids, diterpenes, steroids, phytosterols, tannins, quinones, phenolics, glycosides, iridoids, carbohydrates, proteins, and amino acids.
Dampawwan (1976), Huntrakul và Reutrakul (1977) đã phân lập được stigmaserol, lupeol và β-sitosterol từ dịch chiết của lá, thân và rễ cây mảnh cộng.[11,12]
Năm 1983, Lin Li Yu đã phân lập betulin, lupeol và β-sitosterol từ rễ cây mảnh cộng [17]
Năm 1997, Teshima và cộng sự đã phân lập được 6 C-glucosyl flavone: vitexin
(5), isovitexin (6), shaftoside (1), isomollupentin-7-O-β glucopyranoside (2), orientin
(3) và isoorientin (4) từ dịch chiết methanol của thân và lá cây Mảnh cộng.[29]
Năm 1998 nhóm tác giả Teshima tiếp tục phân lập thêm 5 glucosid chứa nhóm sulfur: clinacosid A, clinacosid B, clinacosid C, cyclolinacosid A1 và cyclolinacosid A2 từ dịch chiết của thân và lá Mảnh cộng [30]
Năm 2001 Satakhum và cộng sự đã phân lập được 2 glycoglycerolipid: 1,2-O- dilinolenoyl-3-O-β-D-galactopyranosylglycerol và 1-O-palmitoyl-2-O-linolenoyl-3- O-(α-D-galactopyranosyl-(1"6')-O-β-D galactopyranosyl) glycerol từ lá cây Mảnh cộng.[25]
Cũng trong năm 2001 nhóm tác giả Dechatiwongse Ayudhya và cộng sự đã phân lập 132-hydroxy-(132-S)-phaeophytin b, purpurin 18 phytylester và phaeophorbide từ dịch chiết chloroform của lá cây Mảnh cộng [7]
Năm 2003, Janwitayanuchit W và cộng sự đã phân lập được trigalactosyl và digalactosyl diglycerides từ dịch chiết lá Mảnh cộng [14]
Năm 2004 Tuntiwachwuttikul và cộng sự đã phân lập được hỗn hợp 9 cerebroside và 1 moonoacyl monogalactosyl glycerol từ lá cây Mảnh cộng.[32]
In 2006, Sakdarat S and colleagues successfully isolated eight compounds from hexane and chloroform extracts, including 132-hydroxy-(132-S)-chlorophyll-b, 132-hydroxy-(132-R)-chlorophyll-b, 132-hydroxy-(132-S)-phaeophytin-b, 132-hydroxy-(132-R)-phaeophytin-b, 132-hydroxy-(132-S)-phaeophytin-a, 132-hydroxy-(132-R)-phaeophytin-a, purpurin-18-phytyl ester, and phaeophorbide-a.
Năm 2009, Sakdarat S và cộng sự đã phân lập thành công ba dẫn xuất chlorophyll từ dịch chiết chloroform của lá Mảnh Cộng, bao gồm 132-hydroxy-(132-R)-phaeophytin b, 132-hydroxy-(132-S)-phaeophytin a và 132-hydroxy-(132-R)-phaeophytin.
Hình 4: Các dẫn xuất chlorophyll phân lập từ Mảnh Cộng
In 2013, Yong and colleagues identified 14 chemical components, including n-pentadecanol, eicosane, and dibutyl phthalate, using GC-MS from the chloroform, methanol, and water extracts of Mảnh cộng leaves Additionally, Yang and associates isolated saponins, phenols, flavonoids, diterpenes, and phytosterols from the methanol extract of Mảnh cộng leaves in the same year.
Năm 2014, Chelyn và cộng sự đã phát hiện flavon C-glycosidic, bao gồm isovitexin, vitexin, isoorientin, orientin và axisoside, trong dịch chiết ethanol từ lá Mảnh cộng bằng phương pháp HPLC để định lượng.
Năm 2014, Tu và cộng sự đã phân lập thành công các phytochemical chứa lưu huỳnh, bao gồm clinamide A, B, C và 2-cis-entadamide A, entadamide từ dịch chiết ethanol của phần trên mặt đất của cây Mảnh cộng.
Tại Việt Nam năm 2014, Hồ Thị Hồng Phúc đã phân lập được một số chất từ dịch chiết cồn 96%: Pterocarpin (13), trcosan-1-ol, stigmasterol, 4- methoxy maackiain (12), 4-hydroxypterocarpin (14) [1]
In 2017, a research team led by Nguyễn Thị Trang Đài isolated four triterpenoid compounds from the dichloromethane extract of the Mảnh community plant, including fiedelin, morolic acid acetate, betulinic acid, and (3B)-hydroxyolean-12-en-28-oic acid.
Năm 2020, nhóm tác giả Nguyễn Thị Trang Đài đã phân lập thành công ba hợp chất từ cao chiết dichloromethane của thân cây Mảnh, bao gồm methyl tetracosanoat, candenatenin B và calycosin.
THỰC NGHIỆM
HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ
Bản mỏng silicagel GF254 (MERCK) pha thuận hoạt hóa trong tủ sấy nhiệt độ 105-110oC trong 60 phút
Chất hấp phụ được chọn dùng để chạy sắc ký cột là silicagel 60 pha thường (0,04-0,063 m) Merck
Dung môi được sử dụng trong quá trình thí nghiệm bao gồm n-hexan, metanol, ethyl axetat, diclorometan, n-butanol và etanol Các dung môi này cùng với các thuốc thử có độ tinh khiết cao là cần thiết cho phân tích TLC, chiết xuất và phân lập các chất.
Thuốc thử hiện hình các vết hữu cơ trên bản mỏng H2SO4 2%/Etanol hoặc FeCl3/ Ethanol
Cân bán vi lượng phân tích Precisa,cân kĩ thuật Precisa
Máy cát quay lớn Buchi và máy cất quay nhỏ Buchi
Bếp đun bình cầu,sinh hàn hồi lưu
Bình chiết, phễu chiết, bình nón, bình cầu, cốc thủy tinh, ống nghiệm, pipet pastuer Đèn UV tử ngoại hai bước sóng 245nm và 365nm
Máy HPLC Shimadzu LC20 đến từ Nhật Bản bao gồm các thành phần chính như bơm, bộ tiêm mẫu tự động, detector UV-VIS và phần mềm Labsoution, giúp truy xuất hình ảnh và số liệu một cách hiệu quả trên thiết bị HPLC.
Máy siêu âm có gia nhiệt hiệu Power sonic 405
2.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH, PHÂN TÁCH CÁC HỖN HỢP VÀ PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT Để phân tích, phân tách các phần chiết và phân lập các hợp chất đã sử dụng các phương pháp chiết, các phương pháp sắc ký phân tích như sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký điều chế như sắc ký cột thường (CC), sắc ký cột nhanh (FC), sắc ký cột tinh chế (Mini-C) và phương pháp kết tinh chọn lọc
2.2.1 Phương pháp chiết hồi lưu
Dược liệu được ngâm trong dung môi trong bình cầu đáy tròn, kết nối với hệ thống ngưng tụ Khi đun nóng, dung môi sẽ bốc hơi và quay trở lại bình chiết, giúp chiết xuất các hoạt chất từ dược liệu.
2.2.2 Phương pháp chiết hai pha lỏng
Phương pháp chiết xuất dựa trên sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha lỏng không hòa trộn, bao gồm pha nước và pha hữu cơ Trong quá trình này, các hợp chất hữu cơ được chuyển từ pha nước sang pha hữu cơ, trong khi các chất nền phân cực vẫn giữ lại trong pha nước Quá trình chiết có thể được thực hiện dưới các điều kiện kiểm soát như pH, độ phân cực của dung môi chiết, tỷ lệ thể tích pha hữu cơ so với pha nước, và nhiệt độ.
2.2.3 Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng (TLC) trên silica gel là phương pháp hiệu quả để phân tích các hợp chất hữu cơ, dựa vào quá trình hấp phụ và phân tách theo độ phân cực tương tự như sắc ký cột Phương pháp này cho phép lựa chọn hệ dung môi rửa giải cho sắc ký cột Để định tính các hợp chất, cần mô tả giá trị Rf và màu sắc của các vệt chất trên bản mỏng TLC Sắc ký đồ TLC giúp đánh giá định tính và số lượng các hợp chất có trong hỗn hợp.
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng silica gel DC-Alufolien 60 F254 (Merck, Darmstadt, CHLB Đức) với độ dày lớp silica gel là 0,2 mm Để phân tích mẫu, cần hòa tan mẫu thử trong dung môi phù hợp trước khi đưa lên bản mỏng.
(1 mg/ml), sau đó dùng capilla đưa dung dịch mẫu thử lên bản mỏng (10 μl) a) Dung môi triển khai
Trước khi sử dụng, các dung môi trong phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) cần được làm khan và chưng cất Hệ dung môi được pha trộn theo tỷ lệ phù hợp với từng mẫu phân tích và phải lắc kỹ để đảm bảo các dung môi hòa trộn đều Sau đó, hỗn hợp dung môi được cho vào bình triển khai sắc ký có nút nhám kín, với chiều cao dung môi đạt 0,5 cm Bình cần được để yên cho đến khi đạt trạng thái bão hòa trước khi tiến hành triển khai bản mỏng.
Bản mỏng được cắt với kích thước phù hợp cho tuyến xuất phát của dung môi cao 1 cm Sử dụng kẹp sắt để nhanh chóng đưa bản mỏng đã được tẩm mẫu vào vị trí cần thiết.
Khi thực hiện thí nghiệm với bình triển khai sắc ký, hãy đậy kín nắp và để yên trong một thời gian để theo dõi quá trình Khi nhận thấy dung môi đã đạt đến tuyến dung môi trên, sử dụng kẹp sắt để lấy bản mỏng ra khỏi bình Tiếp theo, tiến hành phát hiện các vệt chất trên bản mỏng để phân tích kết quả.
Bản mỏng được xử lý bằng cách phun dung dịch FeCl3 5% và H2SO4 2% trong ethanol, sau đó được nung nóng ở 120 độ C Sau khi xử lý, các vệt chất trên bản mỏng được đánh dấu, giá trị Rf được tính toán và màu sắc của các vệt chất được ghi nhận.
Sắc ký cột thường (CC) là phương pháp tách chất dựa vào trọng lực của dung môi Cột sắc ký có thiết kế với khóa dưới và nhám trên, với đường kính và chiều cao tùy thuộc vào lượng mẫu cần phân tách Chất hấp phụ sử dụng trong CC là silica gel (Merck, Darmstadt, CHLB Đức) với kích thước hạt từ 63-200 µm và 40-63 µm.
Dung môi hữu cơ cho sắc ký cột cần được làm khan, chưng cất và bảo quản trong bình kín để đảm bảo chất lượng Phương pháp nhồi cột sắc ký thường sử dụng là nhồi cột ướt.
Để chuẩn bị cột sắc ký, cần một lượng silica gel phù hợp với đường kính cột, chiều cao 30 cm, được khuấy đều thành bột nhão trong n-hexan khan Bột nhão này phải được loại bỏ bọt khí và nhồi vào cột sắc ký Sau đó, có thể sử dụng bơm nén hoặc trọng lực để cho dung môi n-hexan đi qua cột nhiều lần cho đến khi lớp silica gel ổn định hoàn toàn Cuối cùng, mẫu sẽ được đưa lên cột sắc ký bằng phương pháp tẩm mẫu trên silica gel.
Mẫu cần được hòa tan trong một lượng dung môi dễ bay hơi phù hợp Sau đó, trộn dung dịch với silica gel có kích thước hạt từ 40-63 µm theo tỷ lệ 1 g chất với 1,2 g đến 1,5 g silica gel Tiến hành bay hơi dung môi đến khi khô hoàn toàn để thu được bột mịn của mẫu chất hấp phụ trên silica gel Cuối cùng, bột này được đưa lên cột sắc ký trên lớp silica gel.
THỰC NGHIỆM
Mẫu thực vật lá và thân cây Mảnh Cộng được thu hái tại Hưng Yên vào tháng 10 năm 2020, đã được xác định tên khoa học bởi ThS Nguyễn Văn Trưởng thuộc khoa Tài nguyên dược liệu của Viện dược liệu.
Sau khi thu hái, mẫu thực vật được đem phơi trong bóng râm sau đó sấy ở nhiệt độ 50 độ C Mẫu khô được nghiền nhỏ thu được 3,3 kg bột
2.3.2 Điều chế phần chiết từ cây mảnh cộng
Bột mẫu 3,3 kg được chiết xuất bằng cồn 70 độ ở nhiệt độ 120 độ qua ba lần, lần đầu trong 2 giờ, lần hai trong 1,5 giờ, và lần ba trong 1 giờ Sau khi lọc tách dịch chiết ra khỏi nguyên liệu rắn, các dịch lọc cồn 70 được gộp lại và được cất dưới áp suất giảm, tiếp theo là cất nước để thu được cặn chiết tổng etanol.
Cặn chiết tổng được hòa trong 1 lít nước và sau đó được chiết riêng rẽ bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần, bắt đầu từ diclometan (DCM) đến n-butanol (n-BuOH), tạo ra các dịch chiết hữu cơ tương ứng.
Hiệu suất thu nhận các phần chiết từ cây Mảnh Cộng được trình bày trong
Bảng 1: Hiệu suất điều chế phần chiết từ cây Mảnh Cộng
STT Phần chiết Khối lượng (g) Hiệu xuất (%) *
(*) Tính theo khối lượng mấu lá khô ban đầu
2.3.3 Phân tích cặn diclometan bằng TLC
Hòa tan một lượng nhỏ cặn DCM trong methanol, sau đó sử dụng capilla để hút chất và chấm lên bản mỏng Tiến hành triển khai sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi n-hexan/acetone theo các tỉ lệ 9:1 và 4:1.
Để nhận biết các vệt chất, trước tiên cần phát hiện chúng dưới ánh sáng thường Sau đó, soi bản mỏng dưới đèn tử ngoại UV với bước sóng 254 nm và 365 nm Cuối cùng, phun bản mỏng bằng dung dịch etanol/H2SO4 2% và hơ nóng trên bếp điện.
2.3.4 Phân lập các chất trong cặn DCM
Một phần cao chiết diclometan (90g) được phân tách bằng cột sắc ký silica gel (Merck, kích thước 63-100 um) thông qua phương pháp nhồi ướt Cột sắc ký được nhồi với 1000ml silica gel ngâm trong n-hexan, trong khi mẫu được tẩm với 180ml silica gel Để ổn định cột sắc ký, cho silica gel lên cột bằng phương pháp nhồi ướt với dung môi n-hexan 100%, sau đó thực hiện quá trình ổn định trong ba giờ để đảm bảo silica gel được nén chặt trong cột.
Các phân đoạn diclomethan được hòa tan trong methanol tối thiểu và tẩm với silica gel Sau khi dung môi bay hơi hoàn toàn, hỗn hợp được nghiền thành bột mịn để đảm bảo các chất hấp phụ phân bố đều trên silica gel Cuối cùng, bột silica gel đã tẩm dịch chiết được đưa lên cột sắc ký.
Chạy cột sắc ký bắt đầu khi dung môi trong cột hạ xuống khoảng 4cm so với bề mặt silica gel đã nén Sau đó, mẫu đã tẩm được đưa lên cột Quá trình rửa giải dung môi diễn ra bằng cách tăng dần độ phân cực, bắt đầu với 100% n-hexan, tiếp theo là hỗn hợp n-hexan/acetone với tỷ lệ methanol tăng dần (100:1, 70:1, 50:1, 20:1, 10:1 ) và kết thúc bằng việc dội cột với methanol.
Khảo sát các phân đoạn rửa giải bằng cách sử dụng bản mỏng TLC giúp kiểm tra và gộp các phân đoạn tương đồng Sau đó, dung môi được loại bỏ dưới áp suất giảm, từ đó thu được kết quả cần thiết.
8 phân đoạn: DI (các bình nón 1-20), DII (21-40), DIII (41-57), DIV (58-76), DV (77-89), DVI (90-116), DVII (117-130), DVIII (131-150)
Tiến hành rửa chất và phân tách bằng sắc ký cột thường (CC) với hệ dung môi n-hexan/diclometan theo các tỷ lệ 5:1, 3:1, 1,5:1 và 1:1,5 Từ phân đoạn DI (2,98 g), thu được chất MC47-55 dưới dạng bột vô định hình màu trắng.
Phân đoạn DII (6,57 g) được rửa và kết tinh lại thu được chất MCD2 ở dạng bột vô định hình màu trắng
Phân đoạn DIII (6,57 g) được rửa và kết tinh lại thu được chất DIII1 (1,02 g) ở dạng bột vô định hình màu trắng
Phân đoạn DV (4,02 g) được rửa và kết tinh lại thu được chất MCD1 ở dạng bột vô định hình màu vàng nâu
