TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TRẦN DUY PHƯƠNG ĐÁNH GIÁ SỰ KHÁNG THUỐC KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN GÂY BỆNH TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) NUÔI Ở VÙNG NƯỚC LỢ TỈNH TRÀ VINH - BẾN TRE LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com LỜI CẢM TẠ Xin bài tỏ long biết ơn sâu sắc và chân thành đến Cô Từ Thanh Dung đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, đóng gớp nhiều ý kiến quý báu và tạo điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp. Thầy cô và các anh chị bộ môn Sinh Học và Bệnh Học Thủy Sản-Khoa Thủy Sản-trường Đại Học Cần Thơ đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình thực hiện đề tài. Thầy cô và các bạn khoa Nông Nghiệp – Thủy Sản, trường Đại Học Trà Vinh đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình thực hiện đề tài. Tập thể lớp bệnh học thủy sản K31 đã giúp đỡ tận tình. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com i MỤC LỤC Trang Mục lục i Danh sách bảng iii Danh sách hình iv PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ 1 PHẦN II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3 2.1. Tình hình dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản 3 2.2. Các bệnh thường xuất hiện trên cá tra 3 2.3. Đặc điểm của vi khuẩn Edwardsiella và Aeromonas 4 2.4. Các nghiên cứu về sự kháng thuốc của vi khuẩn 5 2.5. Thuốc kháng sinh dùng trong nuôi trồng thủy sản. 7 2.6. Các nhóm kháng sinh thường sử dụng trong nuôi trồng thủy sản 9 PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 3.1. Vật liệu nghiên cứu 11 3.1.1 Đối tượng 11 3.1.2 Dụng cụ thí nghiệm 11 3.2. Hóa chất và môi trường 11 3.2.1 Hóa chất 11 3.2.2 Môi trường 11 3.3. Phương pháp nghiên cứu 11 3.3.1 Phương pháp điều tra 11 3.3.2 Phương pháp thu mẫu 12 3.3.3 Phương pháp định danh vi khuẩn 12 3.3.4 Phương pháp lập kháng sinh đồ 12 3.3.5 Phương pháp xác định MIC 13 PHẦN IV: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 15 4.1 Kết quả điều tra 15 4.1.1 Thông tin chung 15 4.1.2 Thông tin về kỹ thuật nuôi: 16 4.1.3 Tình hình bệnh và sử dụng thuốc-hóa chất 17 4.2 Kết quả phân lập và định danh vi khuẩn 19 4.2.1 Kết quả phân lập và chỉ tiêu sinh hóa 19 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com ii 4.2.2 Kết quả định danh vi khuẩn E. ictaluri và Aeromonas sp bằng bộ kit API 20E 21 4.3 Kết quả kháng sinh đồ 21 4.3.1 Kết quả làm kháng sinh đồ Aeromonas sp 23 4.3.2 Kết quả làm kháng sinh đồ E. ictaluri 25 4.4 Kết quả giá trị MIC 26 4.4.1 Giá trị MIC của vi khuẩn Aeromonas sp 27 4.4.2 Giá trị MIC của vi khuẩn E. ictaluri 27 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 29 5.1 Kết luận 29 5.2 Đề xuất 29 PHẦN VI: TÀI LIỆU THAM KHẢO 30 PHỤ LỤC 34 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com iii DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1 Diện tích mặt nước trung bình của các hộ nuôi 16 Bảng 4.2 Kết quả kiểm tra các đặc điểm hình thái, sinh hóa của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas sp 19 Bảng 4.3. Giá trị MIC của vi khuẩn Aeromonas sp 27 Bảng 4.4. Giá trị MIC của vi khuẩn E. ictaluri 28 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com iv DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Các con đường trao đổi sự kháng thuốc của vi khuẩn giữa động vật và con người (Prescott ., 2000). 8 Bảng 4.1 Bản đồ địa chính tỉnh Bến Tre và Trà Vinh 15 Hình 4.2 Các loại kháng sinh thường được sử dụng ở Trà Vinh và Bến Tre 18 Hình 4.3 Cá tra bị bệnh mủ gan. 20 Hình 4.4 Cá tra bị bệnh xuất huyết. 20 Hình 4.5 Khuẩn lạc Aeromonas spp phát triển trên môi trường TSA. 20 Hình 4.6 Khuẩn lạc E. ictaluri phát triển trên môi trường TSA 20 Hình 4.7 Vi khuẩn E. ictaluri gram âm, que ngắn 21 Hình 4.8 Vi khuẩn Aeromonas sp gram âm, que ngắn 21 Hình 4.9 Kết quả định danh Aeromonas spp bằng bộ kit API 20E 22 Hình 4.10 Kết quả kháng sinh đồ chủng Aeromonas sp 22 Hình 4.11 Tỷ lệ phần trăm kháng thuốc kháng sinh của các chủng vi khuẩn Aeromonas sp 23 Hình 4.12 Tỷ lệ phần trăm kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 25 Hình 4.13 Kết quả MIC của Aeromonas sp ở nồng độ 2 µg/ml 28 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com TÓM TẮT Mục tiêu của nghiên cứu là đánh giá sự kháng thuốc của hai loại vi khuẩn Aeromonas spp và Edwardsiella ictaluri bệnh trên cá tra (pangasianodon hypophthamus) nuôi ở vùng nước lợ tỉnh Trà Vinh và Bến Tre. Kết quả khảo sát ban đầu cho thấy 100% số hộ nuôi được phỏng vấn đều sử dụng thuốc kháng sinh để phòng và trị bệnh. Kết quả phân lập, kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản và định danh bằng bộ kit API 20E xác định được 20 chủng vi khuẩn gây bệnh trên cá tra trong đó có 12 chủng E. ictaluri và 8 chủng Aeromonas spp. Để đạt được mục tiêu đề ra, phương pháp lập kháng sinh đồ với 7 loại thuốc kháng sinh được thực hiện trên 20 chủng vi khuẩn đã tìm được. Kết quả cho thấy đa số chủng E. ictaluri đã kháng với florfenicol (50%), chloramphenicol (58%) và tetracycline (42%), nhưng với ampicillin và cefazoline đều nhạy với 100% số vi khuẩn E. ictaluri phân lập được. Kết quả không tìm thấy vi khuẩn Aeromonas spp kháng với florfenicol và chloramphenicol, trong khi đó có tới 50% vi khuẩn Aeromonas spp kháng với streptomycine và 100% kháng với cefazoline. Phương pháp pha loãng thuốc kháng sinh trên môi trường lỏng dựa theo tài liệu Clinical and Laboratory Standards Institure (CLSI), (2006b) được sử dụng làm MIC trên ba loại kháng sinh chloramphenicol, oxytetracycline và streptomycine. Kết quả đã tìm thấy E. ictaluri kháng với chloramphenicol ở mức cao (6/8 chủng). PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 1 PHẦN I ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1. Giới thiệu Thủy sản được xem là một trong những ngành kinh tế quan trọng của Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL). Những năm gần đây đã phát triển rất nhanh, góp phần tích cực vào việc nâng cao nguồn thu nhập của cộng đồng và tăng kim ngạch xuất khẩu. Trong vòng 10 năm từ 1995 đến 2005, diện tích nuôi trồng thủy sản vùng ĐBSCL đã tăng hơn 2,37 lần và sản lượng tăng vọt hơn 3,68 lần (Lê Tuấn Anh, 2008). Cùng với sự phát triển khá nhanh về sản lượng, diện tích nuôi và mô hình nuôi thủy sản, nghề nuôi cá tra có tốc độ phát triển cao nhất. Theo thống kê của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn cho thấy sự phát triển khá nhanh về diện tích nuôi cá tra. Sáu tháng đầu năm 2007 tổng diện tích nuôi gần 5.000 ha và đến sáu tháng đầu năm 2008, diện tích đã tăng lên đạt gần 6.000 ha, và sản lượng cá cũng tăng theo rất nhanh từ 1 triệu tấn của năm 2007 có thể tăng lên 1,2 triệu tấn trong năm 2008. Ngoài những tỉnh có truyền thống nuôi cá tra như Đồng Tháp, An Giang, gần đây những tỉnh như Sóc Trăng, Trà Vinh và Bến Tre cũng đầu tư phát triển. Năm 2007, ngành thủy sản Bến Tre tập trung nuôi các đối tương: tôm sú, tôm càng xanh, nghêu và cá da trơn. Tổng diện tích nuôi thủy sản năm 2007 là 43.000 ha. Trong đó, diện tích nuôi cá da trơn 230 ha, với năng suất 35.000 tấn. (http://www.fistenet.gov.vn, cập nhật ngày 28/11/2008). Nuôi trồng thủy sản đang phát triển mạnh trên nhiều khía cạnh về diện tích nuôi, mức độ thâm canh, loại hình nuôi, đầu tư cơ sở hạ tầng và chế biến sau thu hoạch. Việc sử dụng thuốc, hóa chất đóng góp không nhỏ cho sự phát triển của ngành trong việc cải tạo, duy trì chất lượng môi trường nuôi và trong các trường hợp bệnh bộc phát cần đến sự can thiệp của thuốc-hóa chất. Tuy nhiên, việc sử dụng và quản lý thuốc, hóa chất trong nuôi trồng thủy sản còn rất nhiều hạn chế do trình độ của người nuôi và người cung cấp. Điều đó dẫn đến việc sử dụng không đúng các loại thuốc kháng sinh. Theo điều tra của Mai Văn Tài (2004) có tới 138 loại kháng sinh đã được sử dụng trong các loại hình nuôi và sản xuất giống thủy sản ở Việt Nam. Khi việc sử dụng kháng sinh quá mức, không được kiểm soát để trị bệnh cho cá, tôm thì một điều tất yếu sẽ xảy ra đó là vấn đề kháng thuốc của các chủng vi khuẩn gây bệnh đồng thời gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người. Và như vậy thì việc phòng và xử lý bệnh cho động vật thủy sản củng như con người sau này sẽ gặp rất nhiều khó khăn. Vấn đề kháng thuốc kháng sinh của các chủng vi khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản từ lâu cũng đã được nhiều tác giả nghiên cứu và đã xác được nhiều nhóm vi khuẩn phân lập được từ các ao nuôi cá da trơn đã kháng với nhiều loại kháng sinh như Oxytetracycline, Tetracycline, Ampiciline, …(Depaola et al, 1995; Matyar et al., 2004; Mohamed Nawaz et al., 2006). Ở PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 2 Việt Nam sự kháng thuốc kháng sinh của các dòng vi khuẩn phân lập từ các ao nuôi thủy sản ở ĐBSCL cũng đã được nghiên cứu và cũng tìm thấy được 169 dòng vi khuẩn kháng với 6 loại kháng sinh thường dùng để trị bệnh cho động vật thủy sản (Nguyễn Thanh Phương và ctv., 2005). Gần đây, Từ Thanh Dung và ctv (2008) nghiên cứu sự kháng thuốc của 64 chủng Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá tra đã tìm ra đa số kháng với streptomycin (83%), oxytetracyline (81%)… Trong thời gian gần đây thì cá tra cũng đã được nhiều người dân ở các tỉnh Trà Vinh, Bến Tre, Sóc Trăng đưa về nuôi ở những vùng nước lợ, hiện nay việc kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh trên cá tra nuôi ở vùng nước ngọt khá phổ biến vậy còn cá tra nuôi ở vùng nước lợ thì sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh sẽ như thế nào? Do đó, vấn đề hết sức cấp thiết hiện nay là nghiên cứu sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh trên cá tra nuôi ở vùng nước lợ xảy ra như thế nào để góp phần giảm thiểu thiệt hại về kinh tế, tăng năng suất và sản lượng cá tra do sự kháng thuốc của vi khuẩn gây ra. Vì vậy mà đề tài “Đánh giá sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi ở vùng nước lợ tỉnh Trà Vinh và Bến Tre” được thực hiện. 1.2 Mục tiêu đề tài Đánh giá sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh mủ gan, xuất huyết trên cá tra nuôi ở vùng nước lợ tỉnh Trà Vinh và Bến Tre đồng thời tìm những loại thuốc đặc hiệu để tạm thời điều trị 2 loại bệnh nguy hiểm này khi cần thiết nhằm làm giảm thiệt hại cho người nuôi. 1.2.1 Nội dung thực hiện: Điều tra tình hình sử dụng kháng sinh của các hộ nuôi cá tra ở vùng nước lợ hai tỉnh Trà Vinh và Bến Tre. Phân lập, định danh và lập kháng sinh đồ của 20 chủng vi khuẩn gây bệnh (E.ictaluri và Aeromonas spp). Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chủng vi khuẩn gây bệnh trên. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com [...]... khỏng Sinh Hỡnh 4.12 T l phn trm khỏng khỏng sinh ca cỏc chng vi khun E ictaluri Qua kt qu khỏng sinh cho thy, trỏi li vi kt qu ca chng Aeromonas spp l 100% khỏng vi cefazoline (CEZ) v ampiciline (AM) vi vic khụng to vũng vụ trựng cũn i vi vi khun E ictaluri phõn lp c Tr Vinh v Bn Tre trong nghiờn cu ny thỡ tt c u nhy vi cefazoline v ampiciline vi vũng vụ trựng rt ln (3 0-4 0 mm) T kt qu iu tra thỡ... phõn lp Tr Vinh v Bn Tre Hin tng a khỏng ca Aeromanas hydrophyla cng ó c cp bi Mcnicol et al (1980) l ó tỡm thy 57% s vi khun khỏng vi hai loi khỏng sinh streptomycin-tetracycline Trong nghiờn cu ny cú 5/8 chng Aeromonas spp (62,5%) lp khỏng sinh ó khỏng vi ba loi khỏng sinh, trong ú cú 50% s chng khỏng vi 3 loi khỏng sinh AM+CEZ+SM v 12,5% khỏng vi AM+CEZ+TE, t l a khỏng ca cỏc chng vi khun gõy... khỏng vi chloramphenicol v 45,5% s vi khun khỏng vi oxytetracycline v Crumlish et al (2006) i vi vi khun Aeromonas hydrophyla phõn lp BSCL ó tỡm thy 66,7% s vi khun khỏng vi oxytetracycline Nhng do gii hn ca ti ch lm MIC trờn 4 chng vi khun Aeromonas spp phõn lp c Tr Vinh v Bn Tre nờn khụng tỡm thy khỏng vi oxytetracycline, iu ny cng cú th lý gii l do nụng dõn ni õy khụng s dng nhiu oxytetracycline... thp v dit khun nng cao Nú ph thuc vo mn cm ca vi khun i vi thuc õy l nhúm khỏng sinh cú ph hot rt rng Tỏc dng c i vi nhúm vi khun Gram (-) v Gram (+) nhng vi khun Gram (+) mn cm vi thuc hn l Gram (-) , virus cú kớch tht ln, ký sinh trựng (Bựi Th Tho, 2003; Bựi Quang T v ctv., 2005) Nhúm ny gm cỏc loi khỏng sinh tetracyclin (oxytetracycline, clortetracyclin, dimeclocyclin, methylencyclin) doxycyclin,... trial version http://www.fineprint.com a im thu mu v iu tra c chn theo vựng cú nuụi thõm canh cỏ tra cao Tr Vinh v Bn Tre S liu iu tra c x lý bng phn mn Excel 3.3.2 Phng phỏp thu mu Chn im thu mu: ao nuụi cỏ tra tht thõm canh vựng nc l hai tnh Tr Vinh v Bn Tre Mi ln thu 5 con cỏ tra Nu ao bnh thỡ thu 3-4 con cỏ bnh v 1-2 con cỏ khe ng thi vi vic thu mu cỏ phõn tớch thỡ cng cn ghi nhn thụng tin thờm... nh danh Aeromonas hydrophyla dũng chun thỡ chng Aeromonas spp cn kim tra l phự hp 4.3 Kt qu lm khỏng sinh Kt qu kim tra khỏng sinh ca 8 dũng vi khun Aeromonas spp (4 dũng ca tnh Tr Vinh, 4 ca tnh Bn Tre) v 12 dũng vi khun E ictaluri (6 dũng ca tnh Tr Vinh, 6 dũng ca tnh Bn Tre) vi 8 loi thuc khỏng sinh: florfenicol (FFC) (30 àg); tetracycline (TE) (30 àg);; cefazoline (CEZ) (30 àg); chloramphenicol... dũng vi khun thuc ging Aeromonas ó khỏng vi Tetracycline Qua kt qu cho thy s khỏng thuc ca vi khun ó tng lờn v s lng chng vi khun khỏng v loi khỏng sinh b khỏng Waltman and Shotts (1986) ó kim tra s khỏng thuc trờn 118 chng vi khun E ictaluri phõn lp c M vi 37 loi khỏng sinh Kt qu nghiờn cu cho thy, a s cỏc vi khun Gram õm nhy vi hu ht cỏc loi thuc ó thớ nghim Tuy nhiờn, hn 90% s chng vi khun khỏng vi. .. c kim tra s nhy cm t nhiờn i vi 71 loi khỏng sinh ca 102 dũng vi khun Edwarsiella (trong ú cú 41 chng E ictaluri) cho rng tt c cỏc dũng Edwarsiella u nhy cm t nhiờn vi nhúm khỏng sinh tetracycline, -lactamin, quinolone, chloramphenicol, nitrofurazion ng thi tt c cỏc chng u khỏng t nhiờn vi nhúm khỏng sinh macrolid v khỏng sinh oxonilic acid (Stock et al., 2001) i vi bnh m gan trờn cỏ tra nuụi Vit Nam... (2008) 16,7 % chng E ictaluri Tr Vinh l khỏng vi chloramphenicol Qua kt qu iu tra thỡ s nụng dõn õy s dng florfenicol iu tr bnh cho cỏ l khỏ cao (61,29%) nờn ó dn n hin tng khỏng ca E ictaluri i vi loi khỏng sinh ny Tng t vi vi khun Aeromonas spp , E ictaluri cng ó khỏng vi streptomycin, mc dự nhng nghiờn cu trc õy cho rng vi khun E ictaluri hon ton nhy vi loi khỏng sinh ny Waltman & Shotts (1986);... thy sn v kt qu iu tra cng khụng thy nụng dõn Tr Vinh v Bn Tre s dng nhng hin tng khỏng thuc ca vi khun i vi loi khỏng sinh ny li xy ra cú th l do streptomycin c s dng rt nhiu cha bnh cho ngi v gen khỏng thuc ca vi khun trờn ngi ó truyn qua vi khun gõy bnh trờn ng vt thy sn Hin tng a khỏng ca E ictaluri cng tỡm c trong nghiờn cu, cú 7/12 chng vi khun (58,3%) khỏng vi hai loi khỏng sinh tr lờn Tỡnh . ĐÁNH GIÁ SỰ KHÁNG THUỐC KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN GÂY BỆNH TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) NUÔI Ở VÙNG NƯỚC LỢ TỈNH TRÀ VINH - BẾN TRE. của vi khuẩn gây bệnh trên cá tra nuôi ở vùng nước ngọt khá phổ biến vậy còn cá tra nuôi ở vùng nước lợ thì sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh sẽ như