TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TRẦN VIẾT TOÀN PHÁT TRIỂN QUY TRÌNH mPCR PHÁT HIỆN MBV ( Monodon baculovirus), WSSV (White spot syndrome virus) VÀ GEN BETA-ACTIN TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGHÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TRẦN VIẾT TOÀN PHÁT TRIỂN QUY TRÌNH mPCR PHÁT HIỆN MBV ( Monodon baculovirus), WSSV (White spot syndrome virus) VÀ GEN BETA-ACTIN TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGHÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN BÙI THỊ BÍCH HẰNG 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com i LỜI CẢM TẠ Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với cô Bùi Thị Bích Hằng đã tận tâm hướng dẫn, chỉ bảo, cung cấp tài liệu cũng như những kinh nghiệm giúp tôi hoàn thành được đề tài. Tôi xin chân thành cám ơn toàn thể quý thầy cô, anh chị Bộ môn Sinh Học và Bệnh Thủy Sản – Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Cần Thơ đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành tốt đề tài luận văn tốt nghiệp. Chân thành cám ơn các bạn lớp Bệnh học thủy sản K31 đã động viên và ủng hộ tôi thực hiện được đề tài này. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com ii TÓM TẮT Đề tài được thực hiện nhằm phát triển và ứng dụng quy trình mPCR phát hiện đồng thời MBV và WSSV trên tôm sú (Penaeus monodon). Sau khi thực hiện quy trình mPCR của (Karlo et al., 2006) với mẫu dương tính với MBV cho kết quả ở vị trí 361bp. Sau đó tiếp tục phát triển quy trình mPCR phát hiện đồng thời MBV và gen β-actin cho kết quả hiện hai vạch ở vị trí 361bp (MBV) và 216 (β-actin). Trên cơ sở kết quả đạt được, thực hiện quy trình mPCR phát hiện MBV và WSSV kết quả cho thấy hiện vạch 1441bp (WSSV) ở bước 1, hiện đồng thời hai vạch 941bp (WSSV) và 361bp (MBV) ở bước 2. Thực hiện tiếp quy trình phát hiện MBV, WSSV và gen β-actin nhưng kết quả ở hai bước chỉ hiện vạch của WSSV (1441bp, 941bp). PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com iii MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ i TÓM TẮT ii MỤC LỤC iii DANH SÁCH BẢNG v DANH SÁCH HÌNH vii CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU 1 CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2 2.1 Tình hình chung về tôm 3 2.1.1. Tình hình nuôi tôm trên thới giới 3 2.1.2. Tình hình ở Việt Nam 4 2.2. Tổng quang về tình hình dịch bệnh trên tôm 5 2.2.1. Trên thới giới 5 2.2.2. Ở Việt Nam 7 2.3. Bệnh Monodon Baculovirus (MBV) 8 2.3.1 Tác nhân gây bệnh 8 2.3.2 Vật chủ cảm nhiễm 8 2.3.3 Dấu hiệu bệnh lý 8 2.3.4 Kiểu lan truyền 9 2.3.5 Phương pháp chuẩn đoán 9 2.3.6 Các biện pháp kiểm soát bệnh 10 2.4. Bệnh đốm trắng WSSV 11 2.4.1 Tác nhân gây bệnh 11 2.4.2 Vật chủ cảm nhiễm 11 2.4.3 Dấu hiệu bệnh lý 12 2.4.4 Kiểu lan truyền 12 2.4.5 Phương pháp chuẩn đoán 13 2.4.6 Các biện pháp kiểm soát bệnh 14 2.5.Sơ lược về gen β-actin 14 2.6. Kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR) 14 2.6.1 Một số nhân tố chính ảnh hưởng đến phản ứng PCR 16 2.6.2 Ứng dụng của phương pháp PCR Thủy sản 17 CHƯƠNG III: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 3.1. Thời gian và địa điễm nghiên cứu 19 3.2. Dụng cụ và hóa chất 19 3.3. Phương pháp nghiên cứu 20 3.3.1. Vật liệu nghiên cứu 20 3.3.2. Ly trích DNA 20 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com iv 3.3.3. Đo hàm lượng DNA 21 3.3.4. Quy trình PCR phát hiện MBV (Karlo et al.,2006) 21 3.3.5. Phương pháp mPCR phát hiện MBV và gen β – actin 22 3.3.6. Phương pháp mPCR phát hiện MBV và WSSV 23 3.3.7. Phương pháp mPCR phát hiện MBV, WSSV và gen β – actin 25 CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 4.1. Thực hiện quy trình PCR phát hiện MBV (Karlo et al.,2006) 27 4.2. Thực hiện quy trình mPCR phát hiện MBV và gen β – actin 29 4.3. Thực hiện quy trình mPCR phát hiện MBV và WSSV 31 4.4. Thực hiện quy trình mPCR phát hiệnMBV,WSSVvà β–actin 34 4.5.Ứng dụng quy trình mPCR phát hiện MBV và β –actin 36 4.6.Ứng dụng quy trình mPCR phát hiện MBV và WSSV 39 CHƯƠNG V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 40 5.1. Kết luận 40 5.2.Đề xuất 41 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com v DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1: Sản lượng tôm nuôi trên thế giới qua một số năm (nghìn tấn) (Bộ Thủy Sản số 4 năm 2003) 3 Bảng 2.2: Tình hình nuôi tôm sú ở VN qua một số năm (Bộ Thủy Sản số 4 năm 2003) 5 Bảng 3.3 Trình tự mồi sử dụng trong qui trình PCR phát hiện MBV (Belcher and Young, 1998) , β-actin (Oanh, 2007), WSSV (OIE, 2006) 20 Bảng 3.4. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình PCR phát hiện MBV 21 Bảng 3.5. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV và β – actin 22 Bảng 3.6. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV, WSSV (bước 1) 23 Bảng 3.7. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV, WSSV (bước 2) 24 Bảng 3.8. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV, WSSV và β – actin (bước 1) 25 Bảng 3.9. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV, WSSV và β – actin (bước 2) 25 Bảng 4.10. Hàm lượng ADN của mẫu tôm sú 27 Bảng 4.11. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình PCR phát hiện MBV 28 Bảng 4.12. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV và β – actin 30 Bảng 4.13. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV, WSSV (bước 1) 31 Bảng 4.14. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV, WSSV (bước 2) 31 Bảng 4.15. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV, WSSV (bước 2) đã được điều chỉnh. 33 Bảng 4.16. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV, WSSV và β – actin (bước 1) . 35 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com vi Bảng 4 .17. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV, WSSV và β – actin (bước 2) . 35 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com vii DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1. Sản lượng tôm sú thế giới năm 2001 (Bộ Thủy Sản số 4 năm 2003) 4 Hình 2.2. Sản lượng tôm nuôi tính theo khu vực ( Nguồn tổng cục thống kê, 2008) 5 Hình 2.3: Tôm sú nhiễm bệnh MBV chậm lớn, màu xanh xẫm (Bùi Quang Tề, 2004) . 9 Hình 2.4: Tiêu bản ép mô gan tụy của hậu ấu trùng tôm P. monodon bị nhiễm MBV nhuôm malachite green (700X). (Bondad-Reantaso, M.G et al., 2001)…… 10 Hình 2.5 Gan tụy tôm sú bị nhiễm MBV, nhuộm H&E (Bùi Quang Tề, 2004) 10 Hình 2.6. Tôm sú bị bệnh đốm trắng WSSV, có các đốm trắng dưới vỏ (Bùi Quang Tề, 2004) 12 Hình 2.7. Tôm sú bị nhiễm đốm trắng, nhân tế bào biểu bị dạ dày trương to có thể vùi màu hồng, mẫu nhuộm H&E (Bùi Quang Tề, 2004) 13 Hình 4.8. Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV 27 Hình 4.9. Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV. 29 Hình 4.10. Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV và β – actin 30 Hình 4.11. Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV và WSSV 32 Hình 4.12. Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV và WSSV sao khi chuẩn hóa 34 Hình 4.13. Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV, WSSV và β – actin 36 Hình 4.14. Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV và β – actin 37 Hình 4.15. Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV và β – actin 38 Hình 4.16. Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV và WSSV 39 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com - 1 - CHƯƠNG I GIỚI THIỆU Việt Nam có diện tích mặt nước lớn, kể cả nước ngọt, lợ và mặn, đây là một lợi thế cho việc phát triển nuôi trồng thủy sản và cũng là một trong những lý do dẫn tới sự thành công của ngành trong thời gian qua. Việt Nam đã trở thành nước nuôi trồng thủy sản lớn thứ 3 và là một trong 10 nước xuất khẩu thủy sản lớn nhất thế giới. Theo bộ thủy sản 2006, sản lượng thủy sản nuôi trồng của Việt Nam đạt 1,67 triệu tấn với giá trị xuất khẩu đạt 1,7 tỷ USD, tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản toàn ngành đạt 3,35 tỷ USD. Đồng bằng Sông Cửu Long có diện tích tự nhiên khoảng 39.747 km 2 , chiếm 12% diện tích cả nước. Trên thực tế, nuôi trồng thủy sản (NTTS) ở ĐBSCL đã trở thành một nghề truyền thống và không ngừng thay đổi. Theo tính toán, tổng diện tích có khả năng NTTS ở ĐBSCL hơn 1.200.000 ha, bằng gần 60% của cả nước. Trong đó, diện tích có khả năng NTTS vùng triều khoảng 750.300 ha, chiếm trên 26% tổng diện tích đất tự nhiên của 8 tỉnh ven biển của vùng và chiếm 74% tổng diện tích có khả năng NTTS trên vùng triều toàn quốc. Năm 2006, sản lượng NTTS vùng ĐBSCL đạt khoảng 1.200.000 tấn, bằng trên 70% sản lượng NTTS toàn quốc. Trong đó Tôm sú (Penaeus monodon) là đối tượng thuỷ sản có giá trị thương phẩm cao là đối tượng nuôi quan trọng ở Việt Nam cũng như một số nước đang phát triển ở Châu Á như Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, Philippines, Việt Nam và Nam Mỹ (Ecuador). Nghề nuôi tôm không chỉ góp phần lớn làm tăng kim ngạch xuất khẩu thủy sản cho các nước nêu trên mà còn có tác động tích cực đến quá trình phát triển kinh tế xã hội, cải thiện đời sống cho người nuôi thủy sản. Tuy nhiên, khi nghề nuôi tôm được thâm canh hóa nhất là nuôi với mật độ cao thì phải đương đầu với tình trạng dịch bệnh bùng nổ ngày càng thường xuyên và nghiêm trọng do sự suy thoái về môi trường và sự lây lan mầm bệnh. Đặt biệt là bệnh do virus trên tôm sú như: bệnh đốm trắng (white spot syndrome virus – WSSV), bệnh MBV (monodon baculovirus), bệnh đầu vàng (yellow head virus – YHV),…đã và đang gây thiệt hại nặng nề cho người nuôi. Do đó, việc phát hiện phát hiện sớm bệnh để giảm thiệt hại cho người nuôi, đồng thời nâng cao chất lượng và sản lượng tôm nuôi là vấn đề quan tâm hàng đầu của ngành thủy sản và của người nuôi tôm. Có nhiều phương pháp chẩn đoán bệnh như: phương pháp chẩn đoán truyền thống bằng cách quan sát dấu hiệu bệnh hay phương pháp mô bệnh học nhưng nó lại không cho phép phát hiện sớm và chính xác tác nhân gây bệnh. Nhiều phương pháp phân tử như lai in situ, western blot, PCR, RT-PCR được phát PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com [...]... Reaction) phát hiện đồng thời MBV (M onodon baculovirus), WSSV (White spot syndrome virus) và gen beta – actin của tôm sú (Penaeus monodon) ” được thực hiện Mục tiêu của đề tài Phát triển và ứng dụng quy trình mPCR phát hiện đồng thời MBV, WSSV trên tôm sú (Penaeus monodon) và kiểm soát kết quả âm tính giả Nội dung đề tài Thực hiện quy trình PCR phát hiện MBV (Karlo et al., 2006) Thực hiện quy trình mPCR phát. .. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV, WSSV và β – actin (bước 2) Hóa chất/dung dịch Nước Dung dịch đệm 10X MgCl2 (2 5mM) dNTP (1 0mM) Taq DNA polymerase (5 U/ μl) Mồi MBV- 361 F (1 0μM) Mồi MBV- 361 R (1 0μM) Mồi WSSV- 146 F 2(1 00μM) Mồi WSSV- 146 R 2(1 00μM) Mồi β – actin F (1 0μM) Mồi β – actin R (1 0μM) Sản phẩm PCR bước 1 DNA khuôn MBV Tổng Nồng độ 1X 1,5 mM 0,02... Lourmat (Pháp) Căn cứ vào thang ADN 1kb để đọc kết quả Mẫu hiện lên vạch 361 bp là mẫu dương tính với MBV Mẫu đối chứng âm sẽ không hiện vạch 3.3.5 Phương pháp mPCR phát hiện MBV và gen β – actin Bảng 3.5 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV và β – actin Hóa chất/dung dịch Nước Dung dịch đệm 10X MgCl2 (2 5mM) dNTP (1 0mM) Taq DNA polymerase (5 U/ μl) Mồi MBV- 361... Điện di (Tương tự như phương pháp chạy điện di phát hiện MBV) - 22 - PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Đọc kết quả Mẫu hiện lên vạch 361 bp là mẫu dương tính với MBV Mẫu hiện lên vạch 216 bp là gen β – actin 3.3.6 Phương pháp mPCR phát hiện MBV, WSSV Bảng 3.6 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV, WSSV (bước... phải đối mặt với tình trạng tôm chết hàng loạt một cách bất thường như vậy Hiện tỉnh Cà Mau cũng đã có trên 38.800 ha tôm sú nuôi bị chết với các triệu chứng như: đốm đỏ, đầu vàng, đốm trắng (http://www.thiennhien.net/news/160/ARTICLE/5611/200805-21.html) 2.3 Bệnh Monodon Baculovirus (MBV) Bệnh MBV được phát hiện đầu tiên bởi Lightner và Redman (1 981) trên tôm sú (Penaeus monodon) tại Đài Loan Năm 1989... lượng tôm nuôi tính theo khu vực (Nguồn: tổng cục thống kê, 2008 ) Các loài tôm nuôi chính ở Việt Nam gồm tôm sú (P monodon) , tôm he (P merguiensis), tôm nương (P orientalis), tôm đất/rảo (metapenaeus ensis), trong đó tôm sú là loài nuôi chủ đạo, đóng góp sản lượng cao nhất Việt Nam tồn tại 3 hình thức nuôi tôm là quãng canh (cải tiến), bán thâm canh và nuôi thâm canh Bảng 2.2: Tình hình nuôi tôm sú ở... di (Tương tự như phương pháp chạy điện di phát hiện MBV) Đọc kết quả Mẫu hiện lên vạch 361 bp là mẫu dương tính với MBV Mẫu hiện lên vạch 941 bp là mẫu dương tính với WSSV - 24 - PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 3.3.7 Phương pháp mPCR phát hiện MBV, WSSV và gen β – actin Bảng 3.8 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát. .. tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV, WSSV và β – actin (bước 1) Hóa chất/dung dịch Nước Dung dịch đệm 10X MgCl2 (2 5mM) dNTP (1 0mM) Taq DNA polymerase (5 U/ μl) Mồi MBV- 361 F (1 0μM) Mồi MBV- 361 R (1 0μM) Mồi WSSV- 146 F 1(1 00μM) Mồi WSSV- 146 R 1(1 00μM) Mồi β – actin F (1 0μM) Mồi β – actin R (1 0μM) DNA khuôn WSSV DNA khuôn MBV Tổng Nồng độ 1X 1,5 mM 0,02 mM 0,04 U/μl 0,4 µM 0,4... trial version http://www.fineprint.com Bảng 3.7 Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy trình mPCR phát hiện MBV, WSSV (bước 2) Hóa chất/dung dịch Nước Dung dịch đệm 10X MgCl2 (2 5mM) dNTP (1 0mM) Taq DNA polymerase (5 U/ μl) Mồi MBV- 361 F (1 0μM) Mồi MBV- 361 R (1 0μM) Mồi WSSV- 146 F 2(1 00μM) Mồi WSSV- 146 R 2(1 00μM) Sản phẩm PCR bước 1 Tổng Nồng độ 1X 1,5 mM 0,02 mM 0,04 U/μl 0,4 µM 0,4... Trung Quốc hiện là nhà xuất khẩu lớn nhất (FAO, 2004) Các loài tôm được nuôi nhiều nhất là tôm sú (P monodon) , tôm thẻ Trung quốc (P chinensis) và tôm chân trắng (P vannamei) Riêng 3 loài tôm này chiếm trên 86% sản lượng tôm nuôi của thế giới Nếu tính về sản lượng thì tôm sú chỉ xếp thứ 20 trong số các loài thuỷ sản nuôi nhưng về giá trị thì chúng đứng đầu với 4.046 tỷ USD trong năm 2000 (Bộ Thủy Sản . PHÁT TRIỂN QUY TRÌNH mPCR PHÁT HIỆN MBV ( Monodon baculovirus), WSSV (White spot syndrome virus) VÀ GEN BETA-ACTIN TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) . PHÁT TRIỂN QUY TRÌNH mPCR PHÁT HIỆN MBV ( Monodon baculovirus), WSSV (White spot syndrome virus) VÀ GEN BETA-ACTIN TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon)