VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu này sử dụng ba dòng ngô thuần mang gen chịu hạn ZmDREB2A, được ký hiệu là D3, D14 và D21, ở thế hệ T6 Các sự kiện chuyển gen này được tạo ra bằng phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium.
Vector pCAMBIA1300 mang gen chịu hạn ZmDREB2A đã được chuyển vào phôi non của ba dòng ngô có khả năng tái sinh cao: C436, C7N và V152 Các sự kiện chuyển gen này đã được đánh giá bằng các kỹ thuật phân tử, cho thấy sự hiện diện và biểu hiện ổn định của gen chuyển trong các dòng ngô qua các thế hệ.
Giống ngô 12 THL được phát triển thông qua thí nghiệm lai giữa ba dòng ngô chuyển gen và ba dòng ngô nền, với hai cây thử nghiệm là các giống ngô thuần ưu tú NT6745 và H45.
Bảng 3.1 Danh sách các THL đỉnh tham gia thí nghiệm
TT Ký hiệu THL Dòng mẹ Dòng bố Ghi chú
1 D3xNT D3 NT6745 THL chuyển gen
2 D14xNT D14 NT6745 THL chuyển gen
3 D21xNT D21 NT6745 THL chuyển gen
4 C436xNT C436 NT6745 THL nền (không chuyển gen)
5 C7NxNT C7N NT6745 THL nền (không chuyển gen)
6 V152xNT V152 NT6745 THL nền (không chuyển gen)
10 C436xH C436 H245 THL nền (không chuyển gen)
11 C7NxH C7N H245 THL nền (không chuyển gen)
12 V152xH V152 H245 THL nền (không chuyển gen)
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Bài viết đánh giá khả năng chịu hạn và một số chỉ tiêu hóa sinh của các dòng cây mang gen ZmDREB2A so với dòng nền tương ứng Thí nghiệm được thực hiện trong điều kiện nhà lưới, với việc gây hạn nhân tạo trong giai đoạn cây con, nhằm xác định hiệu quả của gen trong việc cải thiện khả năng chống chịu khô hạn.
Nội dung 2: Đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng mang gen
ZmDREB2A và dòng nền tương ứng thông qua thí nghiệm gây hạn nhân tạo giai đoạn trước trỗ trong điều kiện nhà lưới
Nội dung 3: Đánh giá khả năng chịu hạn của các giống lúa chuyển gen ZmDREB2A và giống lúa nền tương ứng đã được thực hiện thông qua thí nghiệm gây hạn nhân tạo trong vụ Hè Thu 2019 tại Đan Phượng, Hà Nội Kết quả thí nghiệm cung cấp thông tin quan trọng về khả năng thích ứng của các giống lúa này với điều kiện hạn hán, góp phần vào nghiên cứu và phát triển giống lúa chịu hạn trong tương lai.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thí nghiệm 1 được thực hiện nhằm đánh giá khả năng chịu hạn và các chỉ tiêu hóa sinh của các dòng cây mang gen ZmDREB2A so với dòng nền tương ứng Thí nghiệm này được tiến hành thông qua việc gây hạn nhân tạo trong giai đoạn cây con, trong điều kiện nhà lưới.
Thí nghiệm đánh giá khả năng chịu hạn của cây con được thực hiện từ tháng 3 đến tháng 4 năm 2019, trong điều kiện nhà lưới, với 3 lần nhắc và 2 công thức khác nhau.
+ Công thức 1: Tưới nước đầy đủ
Khi cây con đạt 4-5 lá, tiến hành thí nghiệm chịu hạn nhân tạo bằng cách ngừng tưới nước trong 14 ngày Sau đó, phục hồi cây bằng cách tưới nước đầy đủ trong 7 ngày.
Các dòng ngô được gieo trong chậu chứa giá thể xỉ than đã được tưới nước bão hòa, mỗi chậu gieo một dòng với 10 hạt Sau khi tưới dung dịch dinh dưỡng để đảm bảo cây sinh trưởng đồng đều, tỉa bỏ các cây không đồng đều, chỉ giữ lại 5 cây/chậu/dòng Khi cây đạt giai đoạn 4-5 lá, tiến hành thí nghiệm chịu hạn nhân tạo bằng cách không tưới nước trong 14 ngày Đánh giá đặc điểm hình thái và mức độ héo lá của các dòng ngô, so sánh với các dòng ngô không chuyển gen Các chỉ tiêu theo dõi sẽ được ghi nhận trong quá trình nghiên cứu.
- Đánh giá mức độ héo lá được theo dõi: đánh giá mức độ héo của lá sau 5 ngày, 10 ngày và 14 ngày sau gây hạn
Đánh giá khả năng phục hồi và tỷ lệ sống sót của các dòng ngô trong điều kiện hạn 14 ngày cho thấy sự khác biệt rõ rệt giữa các giống Sau 7 ngày tưới nước phục hồi, nhiều dòng ngô đã thể hiện khả năng hồi phục tốt, với tỷ lệ sống sót cao hơn Nghiên cứu này cung cấp thông tin quan trọng về khả năng thích ứng của ngô đối với điều kiện khô hạn, góp phần vào việc chọn giống phù hợp cho vùng chịu hạn.
Tỷ lệ cây sống (%) = (Số cây sống/ Tổng số cây xử lý)x100
- Các chỉ tiêu theo dõi liên quan đến khả năng chịu hạn của các dòng được đánh giá theo phương pháp của Camacho & Caraballo (1994)
Thể tích rễ (RV) được xác định bằng cách cho rễ vào ống đong và đổ nước cho đến khi ngập Sau đó, ghi lại thể tích nước (V(nước)) sau khi vớt rễ ra Công thức tính thể tích rễ là RV = V(tổng) - V(nước), trong đó V(tổng) là thể tích tổng sau khi cho rễ vào.
+ Chiều dài rễ dài nhất (LRL)(cm): đo từ đốt mang rễ đầu tiên đến rễ dài nhất;
+ Chiều cao cây (PH)(cm): đo từ đốt đầu tiên mang rễ đến lá dài nhất;
Khối lượng rễ tươi (RFW), khối lượng thân tươi (SFW), khối lượng rễ khô (RDW), khối lượng thân khô (SDW), và tỷ lệ rễ khô/thân khô, cùng với tổng sinh khối khô (TMD) được xác định bằng cách sử dụng cân điện tử có độ chính xác 0,01g.
* Phương pháp đánh giá một số chỉ tiêu hóa sinh:
Quy trình phân tích hàm lượng Chlorophyll trong lá bắt đầu bằng việc hút 10ml ethanol 96% vào ống falcon Tiếp theo, cắt một phần lá và định lượng khối lượng hoặc diện tích của phần lá đó trước khi cho vào ống falcon chứa ethanol Sau đó, cất giữ ống falcon chưa mẫu ở nơi tối trong khoảng 24-48 giờ Cuối cùng, đem dịch thu được đo bằng máy quang phổ ở bước sóng 665 nm để xác định hàm lượng Chlorophyll.
649 Lượng chlorophyll trong mẫu lá đc tính theo công thức: Chl a = 13.70 x A665 – 5.76 x A649 (àg/ml); Chl b = 25.8 x A649 – 7.60 x A665 (àg/ml);
Quy trình phân tích đạm tổng số theo phương pháp Kjeldahl (1883) được cải tiến bao gồm ba bước chính: đầu tiên, công phá mẫu để chuyển đổi đạm từ dạng liên kết sang dạng amoni sunfate; tiếp theo là chưng cất; và cuối cùng là chuẩn độ, trong đó hàm lượng đạm được tính dựa trên số ion amonia có trong dung dịch nhận.
Phương pháp phân tích NSC theo Ohnichi & Horie (1999) bắt đầu bằng cách cân 0.5 g mẫu khô đã nghiền nhỏ cho vào ống falcon 50ml, sau đó thêm 30ml nước cất và đun ở 100 độ C trong 60 phút Sau khi mẫu nguội, thêm vào mỗi ống 20ml dung dịch Sodium phosphate-phosphoric acid buffer và lắc ở 200 vòng/phút tại nhiệt độ 40 độ C trong 24 giờ để NSC phân hủy ra dung dịch Sau đó, lọc mẫu bằng giấy lọc và làm khô phần cặn thu được ở 135 độ C trong 4 giờ Cuối cùng, cân lượng mẫu còn lại và tính lượng NSC theo công thức: NSC (%) = (KL mẫu/KL mẫu sau sấy)/KL mẫu x 100.
Phương pháp phân tích proline tự do trong cây bắt đầu bằng việc nghiền 0,5g mẫu lá trong nito lỏng, sau đó tiếp tục nghiền với 10ml axit sulfosalicylic 3% Sau khi lọc qua giấy lọc để loại bỏ cặn, hút 2ml dung dịch mẫu để phản ứng với 2ml axit axetic glacial và 2ml axit ninhydrin tại 100°C trong 1 giờ Sau khi phản ứng kết thúc, hỗn hợp được làm lạnh và thêm 4ml toluene, sau đó trộn đều bằng máy lắc vortex trong 15-20 giây Cuối cùng, hút pha lỏng phía trên có màu hồng nhạt và đo ở bước sóng 520nm để tính lượng proline trong mẫu dựa trên dãy proline chuẩn.
Thí nghiệm 2 nhằm đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng cây mang gen ZmDREB2A so với dòng nền tương ứng Nghiên cứu được thực hiện thông qua thí nghiệm gây hạn nhân tạo trong giai đoạn trước trỗ, tại điều kiện nhà lưới.
Thí nghiệm được thực hiện từ tháng 2 đến tháng 5 năm 2019, trong điều kiện nhà lưới tại Viện Nghiên cứu Ngô
Phương pháp đánh giá khả năng chịu hạn của các cây chuyển gen giai đoạn trước trỗ (CIMMYT, 2004; Cains & cs., 2013)
Các dòng ngô được gieo trong xô chứa giá thể trong điều kiện nhà lưới Sau khi cây ngô đạt 3 lá, tiến hành tỉa bỏ các cây không đồng đều, chỉ giữ lại 1 cây/xô/dòng, với mỗi dòng có 5 xô và áp dụng hai công thức xử lý hạn và tưới nước đầy đủ Các xô thí nghiệm được bón phân và tưới nước đều để cây sinh trưởng bình thường cho đến trước giai đoạn trỗ, sau đó ngừng tưới để gây hạn nhân tạo cho các dòng ngô trong công thức xử lý hạn, trong khi các dòng ngô không xử lý hạn vẫn được tưới nước đầy đủ Thời gian xử lý hạn kéo dài 14 ngày, sau đó tưới nước trở lại để cây phát triển bình thường cho đến khi thu hoạch Các chỉ tiêu theo dõi trong quá trình thí nghiệm được ghi nhận đầy đủ.
- Ngày trỗ cờ: Ngày có trên 75% số cây có hoa nở ở 1/3 trục chính
- Ngày phun râu: Ngày có trên 75% số cây có râu nhú dài từ 2 đến 3cm
- Ngày chín: Ngày có trên 75% cây có lá bi khô hoặc chân hạt có chấm đen
Đánh giá độ cuộn của lá ngô được thực hiện theo thang điểm từ 1 đến 5 Điểm 1 cho lá không cuộn, điểm 2 cho mép lá mới cuộn, điểm 3 cho mép lá cuộn hình chữ V, điểm 4 cho mép lá cuộn vào trong, và điểm 5 cho lá cuộn tròn.
- Số lá thật: cắt đánh dấu lá thứ 5 và lá thứ 10 để tiện cho việc đếm tổng số lá cuối cùng
- Chiều cao cây: đo từ mặt xô thí nghiệm đến đốt phân nhánh cờ đầu tiên
- Chiều dài cờ: đo từ đốt phân nhánh cờ đầu tiên đến đỉnh của trục chính
- Số nhành cờ: đếm số nhánh cờ cấp 1
Các yếu tố cấu thành năng suất bao gồm chiều dài bắp, đường kính bắp, số hàng hạt, số hạt trên hàng, tỷ lệ khối lượng hạt so với bắp, khối lượng 1000 hạt và năng suất của các dòng Những yếu tố này đóng vai trò quan trọng trong việc xác định hiệu quả sản xuất nông nghiệp.
Năng suất (tạ/ha) (quy ra năng suất hạt ở độ ẩm 14%)
NSTT P.ô x KE × (100 - A 0 ) × 100 S.ô × (100 -14 0 ) trong đó: P.ô: khối lượng bắp tươi/ô (kg)
KE: tỷ lệ hạt tươi/bắp tươi (%)
A o : độ ẩm hạt khi thu hoạch (%); S.ô: diện tích ô thí nghiệm (m 2 )
PHÂN TÍCH SỐ LIỆU
Các số liệu về các chỉ tiêu nông sinh học và khả năng chịu hạn của các dòng/THL ngô được thu thập và xử lý bằng phần mềm Excel 2016 và IRRISTAT 5.0.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN VÀ MỘT SỐ CHỈ TIÊU HÓA SINH CỦA CÁC DÒNG MANG GEN ZMDREB2A VÀ DÒNG NỀN TƯƠNG ỨNG THÔNG QUA THÍ NGHIỆM GÂY HẠN NHÂN TẠO GIAI ĐOẠN CÂY CON
4.1.1 Kết quả đánh giá khả năng chịu hạn dòng mang gen z mDREB2A giai đoạn cây con
Thí nghiệm đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng ngô chuyển gen ZmDREB2A và dòng nền không chuyển gen được thực hiện trong điều kiện nhà lưới Khi cây con đạt giai đoạn 4-5 lá, chúng được gây hạn bằng cách ngừng tưới nước liên tục trong 14 ngày, sau đó phục hồi bằng cách tưới nước đầy đủ trong 7 ngày Các dòng ngô sẽ được theo dõi và đánh giá độ héo của lá tại các thời điểm 5, 10 và 14 ngày gây hạn, đồng thời đánh giá khả năng phục hồi, tỷ lệ sống sót sau hạn và khả năng chịu hạn thông qua các chỉ tiêu như tỷ lệ rễ khô/thân khô, thể tích rễ, trọng lượng thân và rễ khô, cũng như chiều dài thân, lá và rễ.
4.1.1.1 Đánh giá mức độ héo lá của các dòng ngô trong điều kiện hạn nhân tạo
Trước khi thực hiện thí nghiệm gây hạn, các dòng ngô cho thấy sự sinh trưởng đồng đều, không có sự khác biệt về hình thái giữa các dòng chuyển gen và dòng nền không chuyển gen Kết quả này chỉ ra rằng, trong điều kiện bình thường với đủ nước tưới và phân bón, các dòng ngô chuyển gen và dòng nền không chuyển gen đều phát triển tương tự.
Sau 5 ngày gây hạn, các dòng ngô bắt đầu có hiện tượng héo lá, thể hiện đồng đều ở các dòng nền không chuyển gen, nhiều cây ở dòng chuyển gen D3 và D21 hầu như chưa có biểu hiện héo lá Sau 10 ngày gây hạn, các dòng chuyển gen và không chuyển gen đều có những biểu hiện rõ rệt tác động của stress hạn như: lá héo nhiều và xoăn lại, mép lá và đỉnh lá bắt đầu vàng, các lá dưới bị ảnh hưởng nhiều nhất Sau 14 ngày gây hạn, lá trên của hầu hết các dòng ngô bị cuộn tròn, các lá dưới biểu hiện khô vàng, bắt đầu xuất hiện nhiều cây chết, đặc biệt là ở các dòng không chuyển gen Các dòng chuyển gen cũng xuất hiện các cây héo nặng và cây chết không có khả năng phục hồi
4.1.1.2 Khả năng phục hồi và tỷ lệ cây sống của các dòng ngô
Sau 14 ngày gây hạn, chúng tôi tiến hành tưới nước phục hồi, quan sát khả năng phục hồi của các dòng ngô thí nghiệm Kết quả cho thấy, dòng chuyển gen D21 có khả năng phục hồi khá nhanh, quan sát sau 1 ngày tưới nước cây có biểu hiện tươi trở lại, tiếp đến là 2 dòng chuyển gen D3 và D14 (sau 2 ngày tưới), các dòng không chuyển gen phục hồi sau 3 - 4 ngày tưới nước đầy đủ
Khi cây ngô trải qua thời kỳ hạn hán, hoạt động của tế bào và khả năng sống của cây sẽ bị ảnh hưởng nghiêm trọng Để đánh giá một giống ngô chịu hạn tốt, không chỉ cần cây sống sót sau khi bị hạn mà còn phải phục hồi và sinh trưởng bình thường Nếu cây sống sót nhưng bị tổn thương nặng nề, chúng có thể không phát triển bình thường hoặc thậm chí chết sau thời gian phục hồi Do đó, tỷ lệ cây sống sót sau phục hồi là một chỉ tiêu rất quan trọng trong việc đánh giá giống ngô chịu hạn.
Bảng 4.1 Tỷ lệ cây sống của các dòng ngô thí nghiệm trong điều kiện 14 ngày gây hạn nhân tạo và sau 7 ngày phục hồi ở giai đoạn cây con
TT Tên sự kiện/dòng nền Tỷ lệ cây sống (%)
Hình 4.1 Biểu đồ tỷ lệ cây sống của các dòng ngô thí nghiệm chịu hạn giai đoạn cây con
Tỷ lệ cây sống của các dòng ngô thí nghiệm cho thấy dòng nền C436, C7N và V152 có tỷ lệ cây sống sau phục hồi thấp hơn so với các dòng chuyển gen Cụ thể, dòng chuyển gen D14 có tỷ lệ cây sống thấp hơn so với hai dòng D3 và D21, trong đó D21 đạt 76,7% và D3 đạt 71,7%, cao hơn nhiều so với dòng nền V152 (35,0%) và C436 (33,3%) Kết quả này cho thấy sự khác biệt về khả năng chịu hạn giữa các nguồn vật liệu, cùng với sự tương tác khác nhau giữa gen chuyển và nền di truyền.
4.1.1.3 Khả năng chịu hạn của các dòng ngô qua một số chỉ tiêu theo dõi
Kết quả theo dõi các chỉ tiêu như chiều thân lá, chiều dài rễ, khối lượng thân tươi, khối lượng thân khô, khối lượng rễ tươi, khối lượng rễ khô, thể tích rễ và tỷ lệ rễ khô/thân khô của 6 dòng ngô trong thí nghiệm được trình bày chi tiết trong các bảng 4.2, 4.3, 4.4 và 4.5.
Chiều dài thân lá và chiều dài rễ của các dòng chuyển gen và đối chứng tương đương nhau khi tưới nước đầy đủ Tuy nhiên, khi áp dụng công thức gây hạn CT2, cả chiều dài thân lá và chiều dài rễ đều giảm mạnh so với CT1, với chiều dài thân lá giảm từ 23,5% đến 34,2% và chiều dài rễ giảm từ 16,7% đến 42,5%.
Bảng 4.2 Chiều dài thân lá, dài rễ và tỷ lệ suy giảm của các dòng ngô trong điều kiện hạn nhân tạo
Tỷ lệ giảm so với không hạn (%)
Tỷ lệ giảm so với không hạn
Chú thích: CT1- công thức tưới nước đầy đủ; CT2- công thức gây hạn
Dữ liệu từ bảng 4.2 cho thấy, trong điều kiện hạn, dòng chuyển gen D3 và D21 có chiều dài thân lá và chiều dài rễ vượt trội so với dòng đối chứng không chuyển gen với độ tin cậy 95% Cụ thể, chiều dài thân lá của dòng chuyển gen D3 đạt 53,3 cm, trong khi dòng nền C436 chỉ đạt 47,2 cm, chênh lệch 6,1 cm (lớn hơn chỉ số LSD0.05 là 4,05) Tương tự, dòng chuyển gen D21 có chiều dài thân lá là 45,5 cm so với dòng nền V152.
Chiều dài rễ của các dòng chuyển gen D3 và D21 lần lượt đạt 26,5 cm và 27,4 cm, dài hơn so với dòng nền C436 (19,2 cm) và V152 (19,1 cm) Dòng chuyển gen D14 cũng cho thấy chiều dài thân lá và rễ lớn hơn dòng C7N, với các số liệu 50,4 cm; 48,8 cm và 24,4 cm; 21,6 cm Tuy nhiên, sự chênh lệch này không có ý nghĩa thống kê ở mức độ tin cậy 95%.
Khối lượng thân tươi và rễ tươi của các dòng chuyển gen và dòng nền đối chứng không có sự chênh lệch có ý nghĩa trong điều kiện tưới nước đầy đủ Tuy nhiên, sau 14 ngày gây hạn, các dòng ngô cho thấy sự giảm đáng kể về khối lượng, với khối lượng thân tươi giảm từ 70,3% đến 77,9% và khối lượng rễ tươi giảm từ 62,4% đến 78,1%.
Trong điều kiện hạn hán, dòng nền V152 cho thấy sự giảm mạnh về khối lượng thân và rễ tươi so với dòng chuyển gen D21 Cụ thể, khối lượng thân tươi của V152 chỉ đạt 2,27g (giảm 77,9%), trong khi D21 đạt 3,06g (giảm 71,7%) Tương tự, khối lượng rễ tươi của V152 là 2,11g (giảm 78,1%), còn D21 là 2,72g (giảm 71,7%) Các dòng chuyển gen D3 và đối chứng không chuyển gen cũng cho thấy sự giảm tương tự với khối lượng thân tươi giảm 70,3% và khối lượng rễ tươi giảm 62,4% so với dòng nền Cuối cùng, dòng chuyển gen D14 và dòng nền C7N có tỷ lệ giảm khối lượng thân và rễ tươi tương đương, với khối lượng thân tươi giảm 74,8% và khối lượng rễ tươi giảm lần lượt 70,4% và 70,9%.
Các nhà khoa học đánh giá khả năng chịu hạn của cây ngô ở giai đoạn cây con thông qua một số chỉ tiêu quan trọng như số lá trên cây (LA), thể tích rễ (RV), chiều dài rễ dài nhất (LRL), chiều cao cây (PH), khối lượng rễ tươi (RFW), khối lượng rễ khô (RDW), khối lượng thân khô (SDW), tỷ lệ giữa khối lượng rễ khô và thân khô (RDW/SDW) và tổng sinh khối khô (TMD) (Camacho & Caraballo, 1994; Rezaeieh & Eivazi, 2013).
Theo nghiên cứu của Camacho & Caraballo (1994), tốc độ tăng trưởng và kích thước bộ rễ, cũng như tổng lượng chất khô trong điều kiện hạn, là những chỉ tiêu quan trọng để chọn giống cây chịu hạn trong giai đoạn sinh trưởng Nghiên cứu của Zaidi và cộng sự (2000) cũng cho thấy rằng giống cây có bộ rễ phát triển tốt trong giai đoạn cây con sẽ có khả năng tận dụng nước từ sâu hơn, từ đó phát triển tốt hơn và có khả năng chịu hạn cao hơn khi gặp điều kiện thiếu nước.
Bảng 4.3 Khối lượng thân lá, rễ tươi và tỷ lệ suy giảm của các dòng ngô trong điều kiện hạn nhân tạo
Tỷ lệ giảm so với không hạn (%)
Tỷ lệ giảm so với không hạn
Chú thích: CT1- công thức tưới nước đầy đủ; CT2- công thức gây hạn
Khối lượng thân khô và rễ khô: Kết quả bảng 4.4 cho thấy, ở công thức
Trong nghiên cứu về các dòng ngô chuyển gen và không chuyển gen, kết quả cho thấy ở công thức CT1 (tưới nước đầy đủ) không có sự chênh lệch đáng kể về khối lượng thân và rễ khô Tuy nhiên, ở công thức CT2 (hạn 14 ngày), dòng chuyển gen D3 và D21 có sự chênh lệch rõ rệt so với dòng nền không chuyển gen C436 và V152, với dòng D3 có khối lượng thân khô đạt 0,51g, cao hơn dòng C436 0,08g, và dòng D21 cao hơn dòng nền 0,12g, vượt qua chỉ số LSD0.05 = 0,06, cho thấy sự chênh lệch này có ý nghĩa ở độ tin cậy 95% Dòng D14 cũng cho thấy khối lượng thân và rễ khô cao hơn dòng nền không chuyển gen (0,48g và 0,24g), nhưng sự khác biệt này chưa đạt ý nghĩa thống kê ở mức 95%.
KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÁC DÒNG
Giai đoạn trước trỗ và sau trỗ 2 tuần là thời điểm nhạy cảm nhất với nước đối với cây ngô, ảnh hưởng tiêu cực đến năng suất Nghiên cứu cho thấy hạn hán trong giai đoạn này có thể làm giảm năng suất tới 25% Hạn trước trỗ không chỉ làm giảm diện tích lá mà còn giảm tốc độ quang hợp, kích thước bắp và khả năng kết hạt Điều này dẫn đến giảm khối lượng hạt do số lượng tế bào nội nhũ và kích thước hạt tinh bột giảm, từ đó làm giảm năng suất hạt.
4.2.1 Kết quả chiều cao của các dòng tham gia thí nghiệm trước khi xử lý hạn nhân tạo
Kết quả phân tích thống kê cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa các dòng chuyển gen và dòng nền trong cả điều kiện xử lý hạn và không xử lý hạn với độ tin cậy 95% Chiều cao của các dòng được đo trong điều kiện thí nghiệm nhà lưới cho kết quả cụ thể.
Công thức tưới nước đầy đủ cho các dòng cây cho thấy chiều cao thân lá của dòng nền C436 và dòng chuyển gen D3 lần lượt là 100.2 cm và 101.6 cm Tương tự, dòng nền C7N và dòng D14 có chiều cao thân lá đạt 103.4 cm và 105.8 cm Ngoài ra, chiều cao thân lá của dòng nền V152 và D21 lần lượt là 102.8 cm và 102 cm.
Dòng nền C436 và D3 có chiều cao thân lá lần lượt là 100 cm và 100.54 cm, trong khi dòng nền C7N và D14 đạt chiều cao 108 cm và 103.62 cm Ngoài ra, dòng nền V152 và dòng chuyển gen D21 cũng có chiều cao thân lá lần lượt là 101 cm và 100.54 cm.
Bảng 4.10 Chiều dài thân lá của các dòng ngô trước khi gây hạn nhân tạo
TT Dòng Chiều dài thân lá (cm)
Chú thích: CT1- công thức tưới nước đầy đủ; CT2- công thức gây hạn
Dữ liệu về chiều cao thân lá của các dòng ngô cho thấy, dòng ngô chuyển gen ZmDREB2A và dòng nền không có sự khác biệt về sinh trưởng trong điều kiện chăm bón đầy đủ, từ giai đoạn gieo cho đến trước khi xử lý hạn trước trỗ.
4.2.2 Kết quả đánh giá các chỉ tiêu sau gây hạn nhân tạo và sau phục hồi
Trong giai đoạn gây hạn nhân tạo, các dòng ngô đang chuẩn bị trỗ, với cây ngô đang xoáy nõn và hình thành cờ ngô, điều này quyết định tiềm năng năng suất sau này Trong thời điểm này, cây ngô tiếp tục phát triển chiều dài thân và lóng kéo dài mạnh mẽ Hạn xảy ra trong giai đoạn này có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển chiều cao cây, bộ lá, và đặc biệt là thời điểm tung phấn và phun râu.
Cây ngô có cả hoa đực và hoa cái trên cùng một cây nhưng lại cách xa nhau, khiến chúng nhạy cảm hơn với tình trạng hạn hán so với các loại cây trồng khác Khi cây ngô gặp stress hạn, quá trình sinh trưởng bị chậm lại, kéo dài thời gian chuyển từ giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng sang sinh trưởng sinh thực, làm gia tăng khoảng cách giữa thời điểm trỗ cờ và phun râu Điều này dẫn đến hiệu quả thụ tinh giảm, từ đó giảm năng suất thu hoạch Nghiên cứu cho thấy, năng suất cây ngô giảm mạnh nhất khi hạn hán xảy ra trong giai đoạn cây tung phấn và phun râu, thậm chí có thể gây ra tình trạng bắp không có hạt.
Trong quá trình xử lý hạn nhân tạo, sự sinh trưởng của các dòng ngô không có sự khác biệt giữa dòng chuyển gen và dòng nền khi được tưới nước đầy đủ Sau 5 ngày xử lý hạn, các dòng ngô bắt đầu có sự chậm lại trong sinh trưởng, lá ngô chuyển màu từ xanh đậm sang xanh nhạt và mép lá cuộn lại Đến ngày thứ 14 của quá trình xử lý, việc đánh giá độ cuộn của lá ngô đã được thực hiện, cho kết quả như được trình bày trong bảng 4.11.
Sau 14 ngày xử lý hạn, tất cả các dòng chuyển gen ZmDREB2A và dòng ngô nền đều cho thấy hiện tượng cuộn tròn lá, với mức đánh giá đạt 5 Trong khi đó, các dòng ngô nền xuất hiện tình trạng cháy lá ở tầng lá dưới, thì các dòng chuyển gen chỉ bị cháy ở phần đỉnh mép lá của tầng dưới.
Theo nghiên cứu của Banzinger (2000), hạn hán ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự phát triển của cây, bắt đầu từ lá, tiếp theo là râu, thân, rễ, và cuối cùng là kích thước hạt Đặc biệt, trong giai đoạn trước khi trỗ lá, hạn hán gây ra hiện tượng già hóa, làm giảm mức độ che phủ đất và diện tích bề mặt hấp thu ánh sáng mặt trời.
Bảng 4.11 Mức độ cuộn của lá và tổng số lá của các dòng ngô tham gia thí nghiệm
Dòng Công thức thí nghiệm Độ cuộn lá ngô
Chú thích: CT1- công thức tưới nước đầy đủ; CT2- công thức gây hạn
Thời gian sinh trưởng và khoảng cách tung phấp – phun râu
Các dòng giống ngô có thời gian tung phấp - phun râu (TP-PR) đồng nhất sẽ có khả năng chịu hạn tốt hơn Tính trạng này được các nhà khoa học toàn cầu chú ý, vì vật liệu chịu hạn tốt sẽ có TP-PR nhỏ hơn và biểu hiện ngay khi cây gặp tình trạng hạn hán (Bolanos & cs., 1993).
Kết quả từ bảng 4.12 cho thấy việc xử lý hạn trước trỗ có tác động rõ rệt đến sự sinh trưởng và phát triển của cây ngô Cả ba nguồn dòng ngô đều ghi nhận thời gian tung phấn và phun râu kéo dài hơn so với phương pháp tưới nước đầy đủ Điều này có thể được giải thích bởi việc lá ngô ở tầng dưới bị cháy do điều kiện hạn, dẫn đến quá trình quang hợp giảm và thời gian tích lũy chất khô trong hạt bị rút ngắn, làm cho thời gian chín sinh lý của cây ngô trở nên ngắn lại.
Khi so sánh giữa các dòng chuyển gen ZmDREB và dòng nền trong điều kiện hạn trước trỗ, các dòng ngô chuyển gen cho thấy khả năng sinh trưởng phát triển tốt hơn Thời gian tung phấn của các dòng chuyển gen kéo dài hơn so với điều kiện tưới nước đầy đủ, nhưng vẫn sớm hơn các dòng nền Khoảng cách tung phấn phun râu giữa các dòng khác nhau, cụ thể sự kiện D14 có khoảng cách 4 ngày, dòng nền C7N là 6 ngày; dòng D3 là 5 ngày và dòng C436 cũng 6 ngày; dòng D21 có khoảng cách 3 ngày trong khi dòng nền V152 là 5 ngày Thời gian sinh trưởng từ gieo đến chín sinh lý của các dòng nền ngắn hơn so với các dòng chuyển gen, với dòng nền C7N chín sinh lý sau 124 ngày, trong khi sự kiện D14 là 125 ngày Dòng C436 có thời gian chín sinh lý 113 ngày so với dòng D3 là 115 ngày, và dòng V152 là 117 ngày trong khi sự kiện D21 mất 123 ngày.
Bảng 4.12 Thời gian sinh trưởng và khoảng cách tung phấp phun râu của các dòng ngô tham gia thí nghiệm gây hạn nhân tạo giai đoạn trước trỗ (ngày)
Dòng Công thức thí nghiệm TP PR ASI CSL
Chú thích: TP: Tung phấn; PR: Phun râu; ASI: Khoảng cách TP-PR; CSL: Chín sinh lý; CT1- công thức tưới nước đầy đủ; CT2- công thức gây hạn
Trong các tính trạng hình thái, chỉ số ASI (Anthesis-Silking Interval) được coi là quan trọng nhất và đã được nghiên cứu kỹ lưỡng (Hall & cs., 1982; Wesgate & Bussetti, 1990; Bolanos & Edmeades, 1993) Nghiên cứu cho thấy ASI có mối tương quan nghịch với năng suất hạt trong điều kiện hạn Việc chọn lọc năng suất dựa trên ASI trong môi trường hạn chế mang lại kết quả khả quan nhất và có khả năng di truyền (Bolanos, 1993).
Chiều cao cây, chiều cao đóng bắp
Nước là yếu tố thiết yếu cho mọi hoạt động sống của tế bào; khi thiếu nước, quá trình trao đổi chất, phân chia và giãn tế bào bị ảnh hưởng, dẫn đến sự phát triển chậm chạp của cây Điều này làm hạn chế sự sinh trưởng của cây so với điều kiện bình thường Kết quả về chiều cao cây và chiều cao đóng bắp của các dòng ngô được trình bày trong bảng 4.13, với số liệu phân tích thống kê cho thấy sự khác biệt rõ rệt.
ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÁC THL ĐỈNH MANG SỰ KIỆN CHUYỂN GEN ZMDREB2A VÀ THL NỀN TƯƠNG ỨNG THÔNG QUA THÍ NGHIỆM GÂY HẠN NHÂN TẠO NGOÀI ĐỒNG RUỘNG
SỰ KIỆN CHUYỂN GEN ZMDREB2A VÀ THL NỀN TƯƠNG ỨNG THÔNG QUA THÍ NGHIỆM GÂY HẠN NHÂN TẠO NGOÀI ĐỒNG RUỘNG
Chúng tôi tiến hành đánh giá khả năng di truyền về tính chịu hạn của các dòng ngô chuyển gen ZmDREB2A bằng cách sử dụng 3 dòng ngô chuyển gen D3, D14 và D21, cùng với 3 dòng ngô nền C436, C7N và V152 Thí nghiệm lai đỉnh với 2 dòng ngô thuần ưu tú NT6745 và H245 đã tạo ra 12 tổ hợp lai, bao gồm 6 tổ hợp mang dòng chuyển gen và 6 tổ hợp đối chứng Khả năng chịu hạn của các tổ hợp lai được đánh giá thông qua thí nghiệm gây hạn nhân tạo trong điều kiện kiểm soát vào vụ Hè Thu 2019.
4.3.1 Đặc điểm hình thái và thời gian sinh trưởng của các THL trong điều kiện hạn
Chiều cao cây và chiều cao đóng bắp
Chiều cao cây và chiều cao đóng bắp là những đặc điểm hình thái quan trọng của cây ngô, ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển và khả năng chống đổ, đồng thời phụ thuộc vào đặc tính di truyền của giống Tuy nhiên, các yếu tố như thời tiết, đất đai, mùa vụ, mật độ, phân bón và chăm sóc cũng có tác động đáng kể đến tính trạng này Kết quả theo dõi chiều cao cây và chiều cao đóng bắp của các tổ hợp lai trong vụ Hè Thu 2019 đã được tổng hợp và so sánh chi tiết trong bảng 4.17.
Bảng 4.17 Đặc điểm hình thái và thời gian sinh trưởng của các tổ hợp lai trong điều kiện hạn
Ghi chú: CCC: Chiều cao cây; CCB: Chiều cao đóng bắp; ASI: Khoảng cách thời gian tung phấn phun râu
Trong điều kiện hạn, chiều cao của tất cả các tổ hợp lai cây ngô giảm so với điều kiện tưới đủ, cho thấy hạn ảnh hưởng tiêu cực đến sinh trưởng của cây Các tổ hợp lai từ các dòng chuyển gen D3 và D21 có chiều cao cao hơn so với các tổ hợp lai nền, trong khi tổ hợp lai chuyển gen D14 có sự khác biệt nhưng không đáng kể so với tổ hợp nền Chiều cao cây dao động từ 180,9 – 206,2 cm, và chiều cao đóng bắp dao động từ 90,2 – 112,3 cm, cho thấy sự biến đổi trong khả năng sinh trưởng của các tổ hợp lai.
Chênh lệch thời gian tung phấn phun râu (ASI)
Chênh lệch giữa thời gian tung phấn phun râu (ASI) là yếu tố quan trọng trong chương trình chọn tạo giống ngô chịu hạn Nghiên cứu cho thấy ASI có mối tương quan chặt chẽ với năng suất cây ngô trong điều kiện hạn, với hệ số tương quan kiểu gen là 0,65 và kiểu hình là 0,53 (Bolanos).
1993) Nếu hạn xảy ra vào giai đoạn tung phấn phun râu, năng suất ngô giảm nhiều nhất (Zaidi, 2002)
Giai đoạn tung phấn và phun râu (8-12 ngày) là thời điểm quyết định năng suất cây ngô, ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình thụ phấn và thụ tinh, quyết định số hạt trên mỗi bắp Đây là yếu tố có mối tương quan chặt chẽ với năng suất, với tương quan gen là 0,86 và kiểu hình là 0,99 (Bolanos, 1993) Trong giai đoạn này, các chất dinh dưỡng từ thân lá sẽ tập trung về cơ quan sinh sản, trong khi các chất hữu cơ bắt đầu được tổng hợp và tích lũy vào hạt.
Kết quả đánh giá 12 tổ hợp lai trong điều kiện hạn cho thấy, các tổ hợp lai từ dòng chuyển gen có thời gian tung phấn phun râu trung bình ngắn hơn (4,3-5,3 ngày) so với các tổ hợp lai từ dòng nền (5,3-6,7 ngày), với sự chênh lệch từ 1-2 ngày Tuy nhiên, sự biến động giữa các tổ hợp lai trong điều kiện hạn khá lớn, dao động từ 3-7 ngày Thí nghiệm đã chứng minh mức độ bất thuận do thiếu nước trên các nguồn vật liệu nghiên cứu, phù hợp với nhận định của Zaidi (2005) Kết quả này cho thấy các tổ hợp lai từ dòng chuyển gen có khả năng chịu hạn tốt hơn so với các tổ hợp lai từ dòng nền.
Thời gian sinh trưởng của các tổ hợp lai
Sinh trưởng và phát triển là hai quá trình sinh lý quan trọng của cây trồng, trong đó sinh trưởng liên quan đến việc tạo ra các yếu tố cấu trúc mới, dẫn đến sự gia tăng kích thước của cây Phát triển, ngược lại, là quá trình biến đổi chất trong việc hình thành các yếu tố cấu trúc mới, giúp cây trải qua chu kỳ sống của mình Hai quá trình này có mối quan hệ chặt chẽ, với sinh trưởng đóng vai trò là nền tảng về lượng cho sự phát triển của cây.
Nghiên cứu giai đoạn sinh trưởng của các tổ hợp lai giúp xác định thời gian hoàn thành từng giai đoạn, từ đó có thể áp dụng các biện pháp kỹ thuật như cải thiện đất đai, chọn thời vụ gieo trồng hợp lý, tối ưu hóa quá trình chăm sóc và điều chỉnh chế độ tưới tiêu Những biện pháp này không chỉ nâng cao hiệu quả kinh tế mà còn góp phần tiết kiệm nguồn nước.
Kết quả đánh giá thời gian sinh trưởng từ gieo đến chín sinh lý của 12 tổ hợp lai trong vụ Hè Thu 2019 cho thấy thời gian chín sinh lý dao động từ 106 đến 112 ngày Thời gian sinh trưởng của các tổ hợp lai từ dòng chuyển gen và dòng nền tương đương, không có sự khác biệt có ý nghĩa ở mức tin cậy 95%.
4.3.2 Tốc độ già hoá bộ lá của các tổ hợp lai trong điều kiện hạn Độ già hóa bộ lá (LSE - Leaf senescence) phản ánh khả năng tránh hạn hoặc chịu hạn của cây trồng, có tương quan với năng suất và thường được sử dụng để đánh giá khả năng chịu hạn Trong thí nghiệm chịu hạn, tính trạng này là chỉ tiêu quan trọng đặc biệt là ở giai đoạn hình thành hạt ngô với biểu hiện mô lá bị khô vàng từ lá gốc lên lá bắp (M Zaman-Allah & cs., 2016)
Kết quả đánh giá tình trạng độ già hoá bộ lá (LSE) ở ba thời điểm: trước trỗ 7-10 ngày (LSE_1), khi ngô tung phấn - phun râu đạt hơn 50% (LSE_2), và sau tung phấn 15 ngày (LSE_3) cho thấy độ già hóa bộ lá của các tổ hợp lai từ dòng chuyển gen thấp hơn so với dòng nền Đặc biệt, hai tuần sau tung phấn, mức độ hóa già của các tổ hợp lai từ dòng chuyển gen dao động từ 4,3 đến 5,7, tương ứng với 43-57% diện tích lá bị chết Theo dõi cho thấy chỉ số hóa già tăng dần từ giai đoạn trước trỗ đến hai tuần sau trỗ, chỉ ra rằng việc gây hạn đã xảy ra đúng vào giai đoạn tung phấn phun râu.
Bảng 4.18 Tốc độ già hoá bộ lá của các tổ hợp lai trong điều kiện hạn
STT THL LSE_1 LSE_2 LSE_3
Ghi chú về độ già hoá của cây: LSE_1 đề cập đến độ già hoá trước trỗ, LSE_2 liên quan đến độ già hoá của bộ lá tại thời điểm tung phấn và phun râu, trong khi LSE_3 tập trung vào độ già hoá của bộ lá sau thụ phấn 15 ngày.
Một số tính trạng gián tiếp có mối tương quan chặt chẽ với năng suất và độ di truyền cao bao gồm số bắp trên cây, số hạt trên cây, khoảng cách giữa thời điểm tung phấn và phun râu, cũng như tổng số hạt trên cây Các chỉ tiêu có độ tương quan vừa phải bao gồm độ bó tán lá, số nhánh cờ, chiều cao cây, tỷ lệ cây con chết, tốc độ lão hóa của lá và độ héo của lá.
4.3.3 Tỷ lệ đổ rễ, gãy thân và tỷ lệ bắp/cây
Trong điều kiện hạn, cây ngô tập trung dinh dưỡng vào việc hình thành bắp và hạt, dẫn đến tỷ lệ đổ rễ và gãy thân tăng cao Theo bảng 4.19, các tổ hợp lai từ dòng chuyển gen có tỷ lệ đổ rễ và gãy thân thấp hơn so với tổ hợp lai từ dòng nền, đặc biệt là các tổ hợp lai D3 x NT và D21 x.
NT có khả năng chống đổ và gẫy thân là tốt nhất trong điều kiện hạn
Trong điều kiện hạn, tỷ lệ số bắp trên cây là chỉ tiêu quan trọng để chọn nguồn vật liệu chịu hạn tốt, với tương quan gen là 0,9 và kiểu hình là 0,77 (Bolanos, 1993) Kết quả cho thấy tất cả các tổ hợp lai đều không đạt tỷ lệ bắp/cây 100%, cho thấy hạn đã ảnh hưởng đến quá trình thụ phấn, thụ tinh, hình thành bắp và phát triển hạt Thí nghiệm đã xác nhận mức độ gây hạn phù hợp và đúng giai đoạn tung phấn Trong số các tổ hợp lai, D3 x NT và D3 x H có tỷ lệ bắp trên cây lần lượt là 95% và 96%, cho thấy khả năng chịu hạn tốt nhất.
Bảng 4.19 Tỷ lệ đổ rễ, gãy thân và tỷ lệ bắp/cây của các tổ hợp lai trong điều kiện hạn vụ Hè Thu 2019
TT THL Tỷ lệ đổ rễ Tỷ lệ gãy thân Tỷ lệ bắp/cây
4.3.4 Năng suất của các tổ hợp lai trong điều kiện hạn
