Tính c ấ p thi ế t c ủa để tài
Bệnh lở mồm long móng (LMLM) hay còn gọi là Foot and Mouth disease, là một bệnh truyền nhiễm cấp tính, dễ lây lan ở các loài động vật guốc chẵn như trâu, bò, lợn và dê.
Bệnh LMLM đã xuất hiện ở Việt Nam hơn 100 năm qua và thường phát tán thành đại dịch, gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi và ảnh hưởng đến kinh tế xã hội của nhiều quốc gia trên toàn thế giới Để khống chế bệnh truyền nhiễm này, việc tạo miễn dịch cho quần thể mẫn cảm thông qua việc sử dụng vắc xin là phương pháp hiệu quả nhất.
Từ năm 1898, bệnh LMLM đã xuất hiện với ba týp vi rút lưu hành là O, A và Asia 1, gây thiệt hại kinh tế lớn và khiến nhà nước phải chi ngân sách lớn cho công tác phòng, khống chế dịch bệnh Giải pháp sử dụng vắc xin được coi là tối ưu trong việc phòng chống bệnh này Tuy nhiên, Việt Nam vẫn chưa sản xuất thành công vắc xin LMLM ở mức độ thương mại để phục vụ công tác phòng, chống dịch (theo quyết định số 174/QĐ-BNN-TY), dẫn đến việc phụ thuộc hoàn toàn vào nguồn vắc xin nhập khẩu, gây khó khăn trong việc chủ động về số lượng và chủng loại vắc xin.
Dự án “Công nghệ sản xuất vắc xin Lở mồm long móng cho gia súc” mã số SPQG.05B.01, do Bộ Khoa học và Công nghệ giao cho Công ty Cổ phần Phát triển Công nghệ Nông thôn (RTD) từ năm 2013, nhằm nghiên cứu và phát triển giống vi rút LMLM týp O, A và Asia1 để sản xuất vắc xin nội địa Từ 2014-2018, RTD đã thu thập 108 mẫu vi rút LMLM, chọn lọc thành công bộ giống O, A, Asia 1 và hoàn thiện hồ sơ giống týp O gửi Trung tâm kiểm nghiệm thuốc trung ương Hiện tại, RTD đang thực hiện giai đoạn 2 (2018-2020) với mục tiêu hoàn thiện chủng vi rút LMLM và sản xuất vắc xin đơn giá, đa giá trên quy mô thương mại.
Dự án cấp Nhà nước về nghiên cứu và chế tạo vắc xin vô hoạt nhũ dầu, keo phèn phòng bệnh lở mồm long móng đa týp O + A cho gia súc tiếp tục kế thừa kết quả nghiên cứu trước đó Chúng tôi đang hoàn thiện các đặc tính của giống phân lập nhằm sản xuất vắc xin thông qua đề tài nghiên cứu đặc tính sinh miễn dịch của chủng vi rút O/FMD/Avac3.
M ụ c tiêu nghiên c ứ u
Giám định đặc tính di truyền của chủng O/FMD/Avac3 và đánh giá đáp ứng miễn dịch của lợn tiêm vắc xin LMLM chủng O3 là rất quan trọng Nghiên cứu cũng xem xét ảnh hưởng của chất bổ trợ đến khả năng đáp ứng miễn dịch Thêm vào đó, việc đánh giá mức tương đồng kháng nguyên của chủng vi rút O3 với các chủng vi rút thuộc topotype ME-SA và các topotype O lưu hành tại Việt Nam cũng cần được thực hiện để hiểu rõ hơn về sự lây lan và hiệu quả của vắc xin.
Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thự c ti ễ n c ủa đề tài
Ý nghĩa khoa họ c
Nghiên cứu đã xác định và đánh giá đặc tính sinh miễn dịch của giống vi rút LMLM, từ đó phát triển quy trình sản xuất vắc xin LMLM vô hoạt cho lợn Kinh nghiệm và kiến thức thu được trong quá trình này sẽ là nền tảng cho việc lựa chọn giống vắc xin và các nghiên cứu sản xuất vắc xin vi rút vô hoạt, đặc biệt là cho bệnh LMLM.
Ý nghĩa thự c ti ễ n
Giống O3 đã được nghiên cứu và sản xuất thành công vắc xin LMLM vô hoạt, đạt tiêu chuẩn gây đáp ứng miễn dịch cho lợn Vắc xin này có sự tương đồng cao với các chủng virus LMLM đang lưu hành ngoài thực địa, hứa hẹn mang lại khả năng bảo hộ cao và góp phần quan trọng vào công tác phòng chống dịch bệnh LMLM tại Việt Nam.
PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
L ị ch s ử b ệ nh l ở m ồ m long móng
Tình hình b ệ nh l ở m ồ m long móng trên th ế gi ớ i
2.1.1.1 Diễn biến bệnh lở mồm long móng trên thế giới
Bệnh lở mồm long móng (LMLM) đã tồn tại hàng trăm năm ở châu Âu, được mô tả lần đầu bởi nhà sư Ý Girolamo Fracastoro vào năm 1514 Bệnh này có tính chất dịch lớn, lây lan nhanh chóng và mạnh mẽ, ảnh hưởng đến nhiều quốc gia Mặc dù tỷ lệ gia súc mắc bệnh rất cao và ít gây chết ở gia súc trưởng thành, nhưng LMLM gây thiệt hại kinh tế lớn cho các loại gia súc chăn nuôi cao sản như bò sữa, bò thịt và lợn hướng nạc Tổ chức thú y thế giới (OIE) đã xếp bệnh LMLM vào danh mục các bệnh phải công bố dịch.
(Loeffler & Frosch, 1897) lần đầu tiên phân lập được vi rút LMLM Năm
Năm 1898, các nhà khoa học đã chứng minh tính chất qua lọc của vi rút gây bệnh, từ đó xác nhận tính chất truyền nhiễm của bệnh Vallée và Carré (1922) đã phân loại vi rút thành hai týp: Vallée O và Vallée A Sau đó, Waldmann và Trautwein (1926) xác định ba týp vi rút Waldmann A, B và C, trong đó Waldmann A và B tương tự như Vallée O và A, còn Waldmann C là một týp vi rút khác biệt.
O, Vallée A và Waldmann C sau đó được rút ngắn thành O, A và C, sau đó các týp SAT1, SAT2 và SAT 3 được phát hiện từ các mẫu bệnh phẩm gửi đến từ châu Phi, týp Asia 1 từ Ấn Độ, Miến Điện và Hồng Kông (Văn Đăng Kỳ, 2011) Dịch LMLM phát ra ở nhiều nơi trên thế giới: châu Mỹ được ghi nhận gần như cùng lúc vào năm 1870 tại Hoa Kỳ, Argentina và Uruguay, và một vài năm sau đó ở Paraguay Bùng phát liên quan đến gia súc nhập khẩu từ châu Âu Ở
LMLM đã được phát hiện ở nhiều quốc gia Nam Mỹ, bao gồm Brazil vào năm 1895, Peru và Bolivia vào năm 1910, Chile vào năm 1920, và ở Venezuela, Colombia, Ecuador vào những năm 1950 Tại vùng Caribbean, LMLM xuất hiện ở Jamaica vào năm 1922, Aruba và Martinique vào năm 1953, và Curaçao vào năm 1957 Tuy nhiên, LMLM chưa từng được ghi nhận ở Trung Mỹ hay Panama (Naranjo & Cosivi, 2013) Ở châu Phi, dịch bệnh xảy ra tại Bắc và Nam Phi, và vào những năm 2000, có tới năm mươi chín quốc gia chính thức báo cáo về dịch bệnh này.
Bệnh LMLM xuất hiện chủ yếu ở châu Âu, đặc biệt là tại Hy Lạp, và lan rộng đến nhiều quốc gia châu Á như Nga, Mông Cổ, Bangladesh, Campuchia, Trung Quốc, Nhật Bản, Lào, Nepal, Pakistan, Philippines, Hàn Quốc, Đài Loan, Thái Lan, Việt Nam, Iran, Iraq, và Thổ Nhĩ Kỳ Ngoài ra, bệnh cũng được ghi nhận ở khu vực Caucasia, bao gồm Georgia, Azerbaijan và Armenia, cũng như ở Kazakhstan và Kyrgyzstan.
Turkmenistan and Tajikistan are located in Central Asia, while in Africa, countries such as Egypt, Kenya, Mauritania, South Africa, Tanzania, Uganda, Malawi, Namibia, Zambia, and Zimbabwe are prominent In South America, Brazil, Colombia, Uruguay, Bolivia, Peru, Ecuador, and Venezuela are notable nations (Leforban & Gerbier, 2002).
Từ năm 2001, bệnh LMLM đã lan rộng ở nhiều khu vực, xuất hiện tại một số quốc gia Tây Âu như Anh, Hà Lan, Pháp và Ireland, cũng như ở Nam Mỹ, bao gồm Argentina, Uruguay, Brazil và Colombia Tại châu Á, bệnh này đã phát triển tại Iran, Afghanistan, Georgia, Azerbaijan, Mông Cổ, Kuwait, Bahrain, Yemen, Qatar, các tiểu vương quốc Ả Rập thống nhất, Ô-man, Bhutan, Nepal, Malaysia, Philippines, Thái Lan và Đài Loan Tình hình LMLM ở châu Phi chưa rõ ràng, nhưng có thể hầu hết các quốc gia ở Tây, Đông và Nam Phi đều bị ảnh hưởng Theo OIE, từ tháng 5 năm 2002, Hàn Quốc đã xác nhận sự bùng phát dịch LMLM lợn (Kesy, 2002).
Theo OIE năm 2005, không có dịch LMLM xảy ra ở các nước thuộc vùng an toàn dịch Gần đây, các quốc gia Nam Mỹ đã đạt được những tiến bộ đáng kể trong việc kiểm soát bệnh LMLM, cải thiện các chỉ số sản xuất động vật và thiết lập cơ sở vệ sinh để duy trì thị trường xuất khẩu sản phẩm động vật, chủ yếu là thịt gia súc và thịt lợn Nhiều quốc gia trên thế giới như Australia, New Zealand, các nước thuộc quần đảo Thái Bình Dương, các nước EU và các nước Bắc Trung Mỹ đã thanh toán thành công bệnh dịch LMLM.
Mỹ và các quốc gia khác đều phải thực hiện chương trình quốc gia tiêm phòng lâu dài, kiểm dịch và các biện pháp khác theo quy định của Tổ chức Thú y Thế giới.
Năm 2010, có 5 ổ dịch LMLM xảy ra ở Campuchia, 3 ổ dịch ở Thái Lan, và
18 ổ dịch ở Trung Quốc Tại Hàn Quốc và Nhật Bản, cũng năm 2010, hai quốc gia này đã công bố dịch LMLM tái bùng phát (Knowles & cs., 2012)
Trong những năm gần đây, 2017 đến đầu năm 2019, các nước có dịch LMLM năm 2018 được phân bố như trong hình 2.1
Hình 2.1 Bản đồ phân bố dịch LMLM của các nước thành viên OIE
2.1.1.2 Phân bố của vi rút LMLM trên thế giới
Từ năm 2000 đến 2005, dịch bệnh đã bùng phát tại nhiều quốc gia châu Á và châu Phi, với týp O vẫn là phổ biến nhất Các týp A, SAT 1 và SAT 2 có sự biến đổi đáng kể trong trình tự nucleotide so với các chủng huyết thanh trước đó Tại Đông Nam Á, dịch LMLM do vi rút týp O thuộc topotype ME – SA và Cathay khá phổ biến, trong khi týp A được phát hiện ở Malaysia, Thái Lan, Lào và Việt Nam (Valarcher & cs., 2005).
Theo báo cáo của OIE giai đoạn 1990 – 2002, sự phân bố các týp và subtype vi rút LMLM cho thấy týp O là phổ biến nhất tại Châu Phi, tiếp theo là týp A, Asia 1 và thỉnh thoảng là týp C Tại Đông Bắc Phi, dịch LMLM do týp O chủ yếu lưu hành ở các nước như Algeria, Tunisia, Guinea, Burundi, Kenya, Tanzania và Zimbabwe Trong khi đó, týp A xuất hiện ở Tây, Trung và Đông Phi, các týp SAT1 và SAT2 phân bố rộng rãi khắp châu Phi, còn SAT3 chỉ giới hạn ở Nam Phi và Trung Đông.
Trong giai đoạn 2005-2011, các týp virus LMLM chủ yếu xuất hiện tại châu Á là O, A và Asia 1, với các quốc gia bị ảnh hưởng bao gồm Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Hồng Kông, Campuchia, Malaysia và Việt Nam Týp A được ghi nhận ở Bangladesh và Iran, trong khi týp Asia 1 cũng xuất hiện tại Iran và Malaysia Đặc biệt, týp C chỉ giới hạn ở một khu vực của Ấn Độ Theo báo cáo của OIE năm 2017, dịch LMLM vẫn tiếp tục diễn ra tại châu Á với các týp O, A và Asia 1 đang lưu hành.
Tại Đông Phi, các týp virus xuất hiện bao gồm O, A, SAT 1-2-3; Tây Phi ghi nhận các týp O, A, SAT1; trong khi đó, Nam Phi có sự hiện diện của các týp SAT1-2-3 Ở Nam Mỹ, có một số ổ dịch lẻ tẻ với týp lưu hành A và O.
Tình hình b ệ nh l ở m ồ m long móng ở Vi ệ t Nam
2.1.2.1 Diễn biến bệnh LMLM ở Việt Nam
Bệnh LMLM lần đầu được phát hiện ở Nha Trang vào năm 1898, sau đó lan rộng ra các tỉnh Nam bộ vào năm 1920 Từ năm 1937 đến 1940, bệnh xuất hiện tại Quảng Ngãi, và vào năm 1952, nó đã bùng phát tại tỉnh Thừa Thiên Huế Đến năm 1953-1954, bệnh tiếp tục lây lan sang các tỉnh Nam Trung bộ, Bắc Trung bộ (Khu 4), Khu 3, khu tả ngạn sông Hồng, cũng như các vùng trung và thượng du Bắc bộ, Tây Bắc (Điện Biên) và Việt Bắc (Văn Đăng Kỳ, 2011).
Từ năm 1954 đến 1975, bệnh LMLM bùng phát tại các tỉnh phía Nam, đặc biệt là ở những tỉnh giáp biên giới Campuchia Trong giai đoạn 1975-1976, dịch bệnh này đã xuất hiện trên trâu bò ở 14 tỉnh thành, bao gồm 6 tỉnh miền Trung, 4 tỉnh Đông Nam Bộ, 2 tỉnh đồng bằng sông Cửu Long và 2 tỉnh Tây Nguyên.
Theo thống kê của Cục thú y, từ năm 1976 đến 1983, cả nước ghi nhận 98 ổ dịch LMLM Vào cuối thập kỷ 80, các tỉnh phía Nam như An Giang, Tây Ninh, Sông Bé, và Đồng Tháp thường xuyên đối mặt với dịch bệnh này Năm 1989, Đồng Nai ghi nhận sự bùng phát dịch, tiếp theo là Thuận Hải và Sông Bé vào năm 1990.
Vào năm 1992, dịch LMLM xuất hiện tại các tỉnh Quảng Bình, Quảng Trị và Hà Tĩnh, sau đó nhanh chóng lan rộng ra toàn quốc Đến năm 1993, dịch đã ảnh hưởng đến 122 xã thuộc 18 huyện tại các tỉnh như Quảng Ninh, Hải Phòng, Hà Tĩnh, Quảng Bình và Thừa Thiên Huế Năm 1995 đánh dấu thời kỳ đỉnh điểm của dịch khi nó bùng phát ở 107 huyện của 26 tỉnh trên cả nước.
Vào năm 1996 và 1997, dịch bệnh đã bùng phát nghiêm trọng tại một số tỉnh ven biển miền Trung và Tây Nguyên Đến năm 1998 và đầu năm 1999, dịch bệnh xuất hiện tại Bình Thuận, khiến 2.449 con bò mắc bệnh ở 20 xã thuộc 3 huyện Đầu năm 1999, nguồn bệnh từ Trung Quốc đã xâm nhập vào Việt Nam qua hoạt động buôn bán gia súc, dẫn đến dịch bệnh bùng phát tại huyện Trà Lĩnh, tỉnh Cao Bằng, sau đó nhanh chóng lây lan ra các địa phương khác như Bắc Ninh, Bắc Giang, Hà Nội, Vĩnh Phúc, Thừa Thiên Huế, Đà Nẵng, và Quảng Nam Tính đến cuối năm 1999, đã có 55 tỉnh thành phố ghi nhận gia súc mắc bệnh, với tổng số trâu bò mắc bệnh lên tới 120.989 con và 31.801 con lợn mắc bệnh (Cục Thú Y, 2000).
Cục Thú y đã thống kê số tỉnh, số lượng động vật mắc bệnh và tổng hợp tình hình dịch bệnh LMLM từ 2001 đến 2005 như bảng sau:
Bảng 2.1 Tình hình bệnh LMLM giai đoạn 2001 - 2005
Năm Số tỉnh Tổng số trâu bò mắc bệnh
Tổng số lợn mắc bệnh
Giai đoạn 2006-2010 đánh dấu thời kỳ thực hiện Chương trình quốc gia phòng chống và thanh toán bệnh LMLM Năm 2006, dịch LMLM bùng phát mạnh mẽ, lây lan rộng rãi tại 1.410 xã, phường thuộc 286 huyện, quận của 47 tỉnh, thành phố, ảnh hưởng đến trâu bò Đồng thời, có 516 xã, phường thuộc 191 quận, huyện của 54 tỉnh, thành phố cũng ghi nhận dịch LMLM trên lợn.
2010, dịch đã xảy ra ở 136 xã thuộc 58 huyện của 21 tỉnh với tổng số 7.111 con trâu bò mắc bệnh, số tiêu hủy là 84 con
Từ năm 2011 đến 2014, dịch bệnh đã tác động nghiêm trọng đến ngành chăn nuôi tại Việt Nam Năm 2011, dịch xuất hiện tại 239 xã của 35 tỉnh, với 140.979 gia súc mắc bệnh và 39.228 con bị tiêu hủy Sang năm 2012, dịch đã giảm đáng kể, chỉ ghi nhận 3.317 gia súc mắc bệnh tại 30 huyện của 12 tỉnh Từ năm 2013 đến 2015, dịch bệnh tiếp tục giảm về quy mô, năm 2013 có 5.648 gia súc mắc bệnh tại 145 xã, 44 huyện và 9 tỉnh/thành phố, và năm 2014, con số này giảm xuống còn 2.978 gia súc tại 81 ổ dịch thuộc 31 huyện của 13 tỉnh/thành phố.
Giai đoạn năm 2015 – 2017: tình hình dịch bệnh LMLM được Cục thú y thống kê theo bảng 2.2 (Cục Thú Y, 2018)
Bảng 2.2 Tình hình dịch LMLM từ năm 2015 – 2017
2.1.2.2 Sự phân bố týp vi rút LMLM lưu hành ở Việt Nam
Giai đoạn 2004 - 2005, dịch LMLM do vi rút týp O topotype ME – SA và Cathay lan rộng tại Đông Nam Á, với týp A được phát hiện ở Malaysia, Thái Lan, Lào và Việt Nam Cuối năm 2004, Cục Thú y đã cảnh báo về sự bùng phát phức tạp của dịch LMLM týp A trên diện rộng.
Số liệu thống kê týp vi rút LMLM ở 65 ổ dịch cho biết có 3 týp virut O, A và Asia 1 đang lưu hành tại khu vực Duyên Hải Miền Trung từ giai đoạn 2003-
Từ năm 2010, týp O đã trở thành loại virus phổ biến nhất, xuất hiện liên tục trong suốt 8 năm, trong khi số ổ dịch do týp A và Asia 1 ít gặp hơn (Tạ Hoàng Long & cs., 2011) Tình hình dịch LMLM diễn ra với ba đặc điểm chính nổi bật.
- Sự xuất hiện của týp mới;
Hiện tượng nhiễm đa týp đã được ghi nhận tại ổ dịch ở Khánh Hòa vào năm 2005 và nay tái diễn tại Quảng Trị, nơi có sự xuất hiện của týp Asia 1.
Vào ngày 23 tháng 5 năm 2007, vi rút LMLM týp O đang lưu hành và tại Thừa Thiên Huế, týp A đã xuất hiện trong bối cảnh có sự hiện diện của týp O Điều này cho thấy diễn biến dịch bệnh ngày càng phức tạp.
Sự lưu hành đồng thời của nhiều týp virus tại một địa phương ngày càng trở nên phổ biến Chỉ sau 8 năm kể từ khi týp A xuất hiện, nó đã lan ra 10 tỉnh, trong khi týp Asia 1 cũng đã phát triển ra ít nhất 4 tỉnh chỉ sau 6 năm.
Bệnh LMLM tại Việt Nam có tính chất phức tạp do hiện tượng mang trùng, khi virus có thể tồn tại ở bò mà không có triệu chứng Điều này dẫn đến nguy cơ virus bị phân tán và lây lan khi gia súc được vận chuyển đến các địa phương khác (Nguyễn Thu Thủy & cs., 2014).
Gần đây, týp O/ME-SA/Ind-2001, một loại vi rút từ tiểu lục địa Ấn Độ, đã gây ra nhiều đợt bùng phát ở Bắc Phi, Trung Đông, Đông Nam Á, Viễn Đông và các đảo không có FMD của Mauritius từ năm 2013 đến 2017 Týp vi rút này lần đầu tiên xuất hiện ở Đông Nam Á, gây dịch ở Lào và Việt Nam vào năm 2015, sau đó là Myanmar vào năm 2016 Dòng O/ME-SA/Ind-2001 đã tiến hóa thành hai phân týp mới là Ind-2001d và Ind-2001e, cả hai đều gây dịch bệnh ở khu vực Đông Nam Á Týp O/ME-SA/Ind-2001e được phát hiện ở Myanmar vào năm 2017 và sau đó đã lan rộng sang Thái Lan, Việt Nam và Malaysia.
Týp O/CHY, thích nghi với lợn, được cho là đã xuất hiện do sự di chuyển của lợn qua biên giới Trung Quốc vào miền bắc Việt Nam vào năm 1997 Loại vi khuẩn này sau đó đã được phát hiện ở Thái Lan vào năm 2012 và tại Việt Nam trong giai đoạn 2015-2017.
Vi rút LMLM
Hình thái, c ấ u trúc vi rút LMLM
Hình 2.2 Tổ chức bộ gen và cấu trúc của vi rút LMLM
Vi rút LMLM thuộc họ Picornaviridae chi Aphthovirus Hạt vi rút qua kính hiển vi điện tử có hình dạng gần như hình cầu và đường kính khoảng 25- 30nm
Virus này có bộ gen RNA sợi đơn dương dài khoảng 8400 nucleotide, được bao quanh bởi vỏ protein (capsid) gồm 60 bản sao capsomers Mỗi capsomer được cấu thành từ bốn polypeptide cấu trúc: VP1, VP2, VP3 và VP4, trong đó VP1, VP2 và VP3 nằm trên bề mặt vi rút, còn VP4 nằm bên trong VP1 không chỉ là kháng nguyên chính của vi rút mà còn giúp vi rút bám vào tế bào cảm thụ và kích thích vật chủ sản xuất kháng thể trung hòa Sự khác biệt trong bộ gen dẫn đến sự hình thành các biến chủng, đặc biệt thông qua sự đa dạng của phân tử VP1.
S ức đề kháng c ủ a vi rút
Vi rút LMLM là vi rút không có vỏ bọc, với lớp ngoài cùng là lipit, giúp nó có khả năng kháng cao với các dung môi hữu cơ như cồn và ete Tuy nhiên, vi rút này lại rất nhạy cảm với ánh sáng mặt trời, formaldehyde, axit và kiềm Chẳng hạn, dung dịch NaOH 0,5-1% có thể tiêu diệt vi rút nhanh chóng chỉ trong 5 phút.
Sức đề kháng của vi rút phụ thuộc vào chất chứa, với khả năng tồn tại mạnh mẽ trên các chất khô và protein Vi rút có thể sống từ 5 đến 10 ngày trong phân, nước tiểu, máu, và nước bọt của trâu bò ở nhiệt độ 18°C Nhiệt độ lạnh giúp bảo tồn vi rút lâu hơn, với khả năng tồn tại lên đến 425 ngày trong tủ lạnh và 52 tháng trên thịt ướp đông lạnh sau khi sấy khô (Kiều Mạnh Hùng, 2012).
Vi rút có khả năng tồn tại tốt trong khoảng pH từ 7 đến 7,7, nhưng nhanh chóng bị vô hiệu hóa khi pH vượt quá 9 hoặc dưới 6 Đặc biệt, vi rút hoàn toàn mất hoạt tính trong môi trường có pH thấp hơn 2 hoặc cao hơn 11 (Mason & cs., 2003).
Độ c l ự c và loài v ậ t c ả m th ụ
Độc lực của vi rút LMLM thể hiện khả năng gây bệnh lâm sàng, với tất cả các chủng đều được xem là cường độc mà không có chủng nhược độc Gia súc nhiễm vi rút này có thể biểu hiện triệu chứng bệnh ở nhiều mức độ khác nhau, từ nghiêm trọng đến thể ẩn Mặc dù các chủng vi rút có cùng đặc tính kháng nguyên, nhưng khả năng gây bệnh có thể thay đổi tùy thuộc vào thời gian và địa điểm, chỉ ảnh hưởng đến lợn, bò hoặc cả hai loài Đặc biệt, chủng Cathay chỉ gây bệnh cho lợn.
Trong tự nhiên, các động vật móng guốc chẵn như trâu, bò, lợn, dê và cừu đều mắc bệnh, với trâu và bò có tỷ lệ mắc cao nhất Động vật non thường nhạy cảm hơn so với động vật trưởng thành Các loài dã thú, gậm nhấm và nhai lại hoang dã cũng là nguồn bệnh quan trọng Ngược lại, động vật một móng như ngựa và chim không bị nhiễm bệnh Vấn đề động vật mang trùng là rất quan trọng trong dịch tễ học bệnh LMLM, với tình trạng này được xác định khi vi rút được phân lập sau 28 ngày nhiễm bệnh Thời gian mang trùng khác nhau tùy thuộc vào loài và có thể kéo dài lên tới 3,5 năm ở bò và 5 năm ở trâu tại châu Phi, với thời gian này cũng phụ thuộc vào chủng và serotype huyết thanh của vi rút LMLM.
Các tiểu gia súc đóng vai trò quan trọng trong việc mang trùng Cừu có khả năng mang trùng ở vùng hầu lên tới 5 tháng, đồng thời duy trì sự nhân virus ở mức độ thấp.
Một số đặc tính của vi rút LMLM
Tính đa dạng về kháng nguyên
Mầm bệnh của bệnh LMLM là một loại vi rút RNA, có khả năng biến đổi cao, dẫn đến sự xuất hiện của các týp kháng nguyên mới ngay cả trong cùng một serotype Việc phân loại vi rút dựa vào đặc tính huyết thanh học (serotype) và chủ yếu dựa vào kiểu gen xác định giữa các trình tự VP1, với sự khác biệt khoảng 30-50% giữa các serotype (Knowles & Samuel, 2003) Hiện nay, có 7 týp vi rút LMLM và hơn 80 phân týp (subtype) đã được xác nhận.
Các subtype của vi rút LMLM có đặc thù theo khu vực, được gọi là topotype, và hệ gen của vi rút này luôn biến đổi Trong cùng một serotype ở các vùng địa lý khác nhau, quá trình tiến hóa dẫn đến sự khác biệt về trình tự nucleotid và axit amin, tạo thành các topotype khác nhau (Carrillo & cs., 2005) Sự biến đổi trong đặc tính kháng nguyên gây khó khăn trong việc kiểm soát bệnh LMLM, vì tiêm phòng với một subtype không đảm bảo bảo vệ chống lại subtype khác, và có thể không hoàn toàn bảo vệ với các phân nhóm khác trong cùng một subtype vi rút Do đó, OIE khuyến cáo sản xuất vắc xin từ chủng vi rút thực địa, được nhiều quốc gia áp dụng để đảm bảo tính tương đồng giữa vắc xin và vi rút lưu hành (Paton & cs., 2005).
Đặc tính biến dị và tiến hóa
Do đặc điểm của ARN vi rút sợi đơn dương, các vi rút này có tính biến dị mạnh mẽ, đặc biệt là tại vùng VP1, dẫn đến sự xuất hiện của nhiều biến chủng (Lea & cs., 1994) Các vi rút LMLM týp O được phân loại thành nhiều týp phụ và chia thành các dòng hay topotype khác nhau, bao gồm Cathay, Đông Phi (EA-1, EA-2, EA-3, EA-4) (Samuel & Knowles, 2001), Tây Phi (WA) và Indonesia-1 (ISA-1).
Khu vực Trung Đông - Nam Á (ME-SA), PanAsia và Đông Nam Á (SEA) đang trải qua sự gia tăng nhanh chóng và đa dạng về di truyền Phân tích trình tự VP1 cho phép xác định nguồn gốc và phân loại các chủng LMLM lưu hành tại từng địa phương thành các dòng (lineage) riêng biệt.
(Samuel & Knowles, 2001) Ở Việt Nam từ giai đoạn năm 2016 cho đến nay đang lưu hành các dòng vi rút týp O: CHY, ME-SA/PanAsia, ME-SA/Ind-2001d,
ME-SA/Ind - 2001e, SEA/Mya - 98
Hình 2.3 Cây phả hệ gen VP1 của chủng LMLM týp O lưu hành tại Việt Nam
Nguồn: Lê Văn Phan & cs (2016)
Các vi rút LMLM týp A là loại vi rút đa dạng nhất về kháng nguyên và di truyền, với 32 týp phụ được xác định ở châu Âu và châu Á từ những năm 1970, khiến việc kiểm soát bằng tiêm phòng trở nên khó khăn Vi rút LMLM týp A ở Saudi Arabia và Iran khác biệt so với ổ dịch năm 1984 ở Tây Đức Tại Ấn Độ, từ năm 1987 đến 1996, vi rút này được phân loại thành 21 nhóm thuộc 4 genotype chính (I, IV, VI và VII) trong tổng số 10 genotype đã được phân loại Trình tự VP1 của 16 vi rút LMLM týp A từ Argentina (1961-1992) cho thấy sự đa dạng lớn và khác biệt với chủng vắc xin Nam Mỹ A24/Cruzeiro/Brazil/55 cũng như các vi rút týp A khác trên toàn cầu Hiện nay, vi rút LMLM týp A có thể được chia thành 3 genotype chính theo khu vực địa lý: Euro-SA, Asia và Africa.
Các chủng vi rút LMLM týp A phổ biến ở Đông Nam Á và Việt Nam thuộc genotype IX, nhưng các mẫu vi rút phân lập tại Hà Nội và Hà Tĩnh năm 2013 cho thấy sự khác biệt đáng kể về trình tự gen VP1 so với các đợt dịch trước đó, điều này có thể do quá trình tự đột biến hoặc xâm nhập từ các biến chủng mới Trong khi đó, vi rút LMLM týp C lần đầu được phát hiện ở châu Âu và Nam Mỹ, được chia thành 5 týp phụ từ C1 đến C5 Phân tích trình tự VP1 cho thấy tất cả các subtype của týp C có thể được xếp vào một topotype duy nhất là Euro-SA, nhưng cũng có thể phân loại thành 8 topotype khác nhau như Euro/SA, Angola, Philippines, ME-SA, Sri Lanka, EA và Tadjikistan.
Vi rút LMLM týp Asia 1 có tính kháng nguyên ít đa dạng hơn so với các týp O, A và C, với chỉ 3 subtype được xác định từ những năm 1960 Nghiên cứu cho thấy trình tự VP1 của vi rút này ít thay đổi hơn so với các serotype khác, và các vi rút týp Asia 1 ở Ấn Độ (1985-1999) được chia thành 4 genotype (I - IV) Năm 2005, nhiều đợt bùng phát dịch LMLM do týp Asia 1 xảy ra rộng rãi ở Pakistan, Iran, Tajikistan, Ấn Độ và Trung Quốc, với phân tích gen cho thấy các dòng vi rút có mối quan hệ di truyền chặt chẽ, chỉ có 2-5% sự khác biệt nucleotide Dịch bệnh ở Myanmar có liên quan đến chủng vi rút ở Trung Quốc năm 2005, trong khi vụ dịch năm 2006 liên quan chặt chẽ đến các vụ dịch ở Việt Nam Đến năm 2017, dịch bệnh ở bang Rakhine, Myanmar được xác định do dòng G-VIII từ Bangladesh gây ra Hiện tại, vi rút LMLM týp Asia 1 được phân thành 8 nhóm topotype (I-VIII).
Nuôi cấy vi rút LMLM và gây nhiễm vi rút trên động vật
Nghiên cứu của Loeffer & Frosch (1897) về vi rút LMLM cho thấy vi rút này có thể được nuôi cấy trên tổ chức da sống như da thai lợn, thai bò hoặc tiêm vào phúc xoang chuột non, cũng như trên các động vật thí nghiệm như thỏ, chuột lang và chuột nhắt trưởng thành Tổ chức thích hợp nhất để nuôi cấy vi rút LMLM là thượng bì lưỡi bò trưởng thành, được lấy ngay sau khi mổ bò và bảo quản ở nhiệt độ 2-3°C, sử dụng trong vòng 8 ngày Độc lực của vi rút vẫn cao đối với bò và động vật thí nghiệm sau nhiều lần tiếp đời, do đó phương pháp này thường được áp dụng để chế vắc xin vô hoạt.
Trong phòng thí nghiệm, vi rút FMD được cấy vào tế bào nuôi cấy hoặc truyền vào chuột con chưa cai sữa Các hệ thống tế bào nuôi cấy mẫn cảm bao gồm tế bào sơ cấp từ tuyến ức bò và thận heo, bê, cừu non Nhiều dòng tế bào đã được thiết lập, như BHK-21 (tế bào thận chuột hamster non) và IBRS-2 (tế bào thận lợn), tuy nhiên, IBRS-2 thường kém hiệu quả hơn BHK-21 trong việc phát hiện hàm lượng vi rút thấp.
Đặc tính sinh miễn dịch
Tính sinh miễn dịch là khả năng của kháng nguyên trong việc kích thích cơ thể tạo ra đáp ứng miễn dịch Mức độ mạnh yếu của đáp ứng miễn dịch phụ thuộc vào tính kháng nguyên của kháng nguyên đó.
-Tính lạ của kháng nguyên: Những chất càng lạ đối với cơ thể càng có tính kháng nguyên mạnh
- Cấu trúc kháng nguyên: Kháng nguyên càng có cấu trúc phân tử phức tạp, phân tử lượng càng lớn, tính kháng nguyên càng cao
Phương thức xâm nhập kháng nguyên vào cơ thể động vật cần được thực hiện qua đường đưa thích hợp và với liều lượng phù hợp để kích thích khả năng đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ.
Tính sinh miễn dịch phụ thuộc vào khả năng đáp ứng miễn dịch của cơ thể; mặc dù cùng một kháng nguyên, nhưng đáp ứng miễn dịch có thể khác nhau ở từng cá thể.
Miễn dịch được phân loại thành hai loại chính: miễn dịch dịch thể và miễn dịch qua trung gian tế bào, dựa trên thành phần và cơ chế phản ứng giữa kháng nguyên và kháng thể Khi vi rút LMLM xâm nhập vào cơ thể động vật, chúng không chỉ nhân lên và phá hủy tế bào vật chủ mà còn kích thích quá trình sinh miễn dịch Đáp ứng miễn dịch của cơ thể có thể diễn ra dưới dạng miễn dịch tế bào hoặc miễn dịch dịch thể.
Miễn dịch trung gian tế bào đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ và phục hồi động vật nhiễm LMLM, với tế bào T là nhân tố chủ chốt trong việc loại bỏ mầm bệnh và hạn chế tổn thương do virus Khi nhận diện kháng nguyên, tế bào T được kích hoạt và tiết ra cytokine, giúp thông báo và kích thích các tế bào miễn dịch khác tham gia vào phản ứng miễn dịch Đáp ứng miễn dịch tế bào thường chỉ diễn ra khi động vật nhiễm virus sống hoặc vắc xin nhược độc Tuy nhiên, vắc xin LMLM thường ở dạng vô hoạt, chỉ kích thích tế bào CD4+ mà không kích hoạt tế bào CD8+ Dù vậy, việc tiêm chủng vẫn ảnh hưởng đến các tế bào miễn dịch, mặc dù không phải lúc nào cũng mang lại phản ứng tích cực Các cytokine là yếu tố quyết định hiệu quả của đáp ứng miễn dịch, và nghiên cứu cho thấy vắc xin LMLM tái tổ hợp có thể tăng cường cả đáp ứng miễn dịch dịch thể và tế bào, tạo ra phản ứng mạnh hơn so với nhóm chuột chỉ tiêm kháng nguyên.
Vắc xin LMLM vector tái tổ hợp đã chứng minh khả năng kích thích cả đáp ứng miễn dịch dịch thể và tế bào, với sự gia tăng đáng kể của kháng thể IgG trong vòng 14 ngày sau tiêm chủng và tiếp tục tăng sau liều nhắc lại (Zhao & cs., 2010; Mahdy & cs., 2019) Đáp ứng miễn dịch tế bào cũng được ghi nhận với sự gia tăng cytokine CD4+ và CD8+ sau 9 ngày, cho thấy tiềm năng phát triển vắc xin trong tương lai Các nhà khoa học hiện đang nghiên cứu kết hợp chất bổ trợ nhũ dầu + saponin, cho thấy sự gia tăng đáp ứng miễn dịch liên quan đến tế bào TCD8+ (Cokcaliskan & cs., 2016).
Quá trình đáp ứng miễn dịch dịch thể kháng vi rút LMLM chủ yếu phụ thuộc vào tế bào T và nhóm tế bào CD4 +, giúp tế bào B sản sinh kháng thể sớm Kháng thể trung hòa đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cơ thể khỏi vi rút LMLM, và có mối tương quan chặt chẽ với khả năng bảo hộ Tuy nhiên, kháng thể trung hòa không phải lúc nào cũng đủ để ngăn chặn sự lây nhiễm bệnh LMLM Một số động vật tiêm vắc xin có thể có ít hoặc không có kháng thể trung hòa nhưng vẫn cho thấy sức đề kháng với bệnh Hơn nữa, kháng thể được phát hiện qua phương pháp ELISA không luôn tương quan với hiệu giá kháng thể trung hòa và miễn dịch bảo hộ Gia súc nhiễm vi rút LMLM thường sản sinh kháng thể IgM sau 3-5 ngày và đạt mức cao nhất sau 5-10 ngày, trong khi kháng thể IgG1 và IgG2 xuất hiện từ ngày thứ 4 và đạt đỉnh vào ngày 15-20 Lợn tiêm vắc xin LMLM trong trường hợp khẩn cấp có thể có miễn dịch bảo hộ sớm chỉ sau 3-5 ngày.
Gia súc mắc bệnh thường có đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ và kéo dài hơn so với đáp ứng từ vắc xin Sau khi hồi phục, thời gian miễn dịch có thể kéo dài từ 6 tháng đến vài năm, nhưng cũng có thể chỉ vài tuần Miễn dịch có thể được truyền cho con qua sữa đầu và kéo dài khoảng 3 tháng Đối với bò, kháng thể đặc hiệu tồn tại cao trong khoảng 4-6 tháng, hiếm khi vượt quá 6 tháng; trong khi đó, đối với lợn, thời gian miễn dịch ngắn hơn và sẽ giảm dần, khiến cho con vật trở nên mẫn cảm với bệnh.
Hiểu biết chung về vắc xin
Khái quát về vắc xin
Vắc xin là chế phẩm sinh học chứa kháng nguyên, giúp kích thích cơ thể tạo ra đáp ứng miễn dịch, nhằm mục đích phòng bệnh hoặc các mục đích khác (Nguyễn Bá Hiên, 2010).
Nguyên lý hoạt động của vắc xin là khi được tiêm vào cơ thể, vắc xin sẽ kích thích hệ thống miễn dịch sản xuất kháng thể đặc hiệu nhằm chống lại các kháng nguyên của tác nhân gây bệnh Nhờ đó, cơ thể sẽ đạt được trạng thái miễn dịch chủ động nhân tạo, giúp bảo vệ chống lại sự xâm nhập của các yếu tố gây bệnh tương ứng.
Thành phần của vắc xin
Vắc xin thông thường bao gồm hai thành phần chính là kháng nguyên (nguyên dịch) và chất bổ trợ
Kháng nguyên là chất lạ, chủ yếu là protein, khi vào cơ thể sẽ kích thích sản sinh kháng thể đặc hiệu để trung hòa chúng Nghiên cứu hiện nay cho thấy, khi cơ thể tiếp nhận kháng nguyên, không chỉ tạo ra kháng thể (đáp ứng miễn dịch dịch thể) mà còn hình thành tế bào mẫn cảm có khả năng phản ứng với kháng nguyên (miễn dịch tế bào) Do đó, kháng nguyên được định nghĩa là những chất kích thích cơ thể sản sinh kháng thể và tế bào mẫn cảm, giúp bảo vệ chống lại sự xâm nhập và gây bệnh của mầm bệnh.
Chất bổ trợ là các hợp chất hóa học được thêm vào vắc xin nhằm tăng cường hiệu quả và độ dài của đáp ứng miễn dịch Chúng được trộn với kháng nguyên để kích thích hoặc điều chỉnh một cách không đặc hiệu phản ứng miễn dịch đối với kháng nguyên đó.
Tác dụng của chất bổ trợ:
- Hấp thu và lưu giữ kháng nguyên trong cơ thể lâu hơn, không bài thải nhanh kháng nguyên
- Tạo kích thích đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của cơ thể
- Giảm kích thích phản ứng của độc tố (nếu có) trong vắc xin đối với cơ thể
Chất bổ trợ được phân loại thành ba nhóm chính dựa trên bản chất và thành phần cấu tạo, bao gồm chất vô cơ, chất hữu cơ và vi sinh vật, được sử dụng trong chế tạo vắc xin hiện nay.
Chất bổ trợ vô cơ, bao gồm các hợp chất nhôm như nhôm phốt phát (AlPO4), nhôm hydroxit (Al(OH)3) và vắc xin kết tủa phèn, là những chất được sử dụng phổ biến trong vắc xin cho người và thú y Các chất này giúp hấp phụ kháng nguyên trên bề mặt, từ đó tăng cường đáp ứng miễn dịch và giải phóng kháng nguyên từ từ vào hệ bạch huyết, kéo dài thời gian kích thích miễn dịch Đối với các mầm bệnh sản sinh độc tố, chất bổ trợ cũng hấp thu và giải phóng từ từ sau khi đã được vô hoạt, nhằm hạn chế phản ứng cục bộ và toàn thân Trong lĩnh vực thú y, KAl(SO4)2.12H2O, hay còn gọi là keo phèn, thường được sử dụng trong các vắc xin vi khuẩn vô hoạt.
Chất bổ trợ hữu cơ bao gồm dầu thực vật như dầu hướng dương, dầu lạc, dầu oliu, mỡ động vật, và sản phẩm dầu khoáng Lịch sử sử dụng nhũ tương dầu làm tá dược trong vắc xin bắt đầu từ năm 1916 Khi kết hợp với kháng nguyên, các chất bổ trợ hữu cơ tạo thành nhũ tương nước trong dầu, trong đó kháng nguyên được hòa tan trong dung dịch dầu Để khắc phục nhược điểm của vắc xin nhũ nước trong dầu như hiện tượng phân lớp và cảm giác rít kim khi tiêm, các nhà nghiên cứu đã phát triển vắc xin dạng nhũ tương kép: nước trong dầu trong nước.
Chất bổ trợ dầu trong vắc xin có tác dụng tương tự như chất bổ trợ vô cơ, giúp giải phóng kháng nguyên từ từ vào cơ thể thông qua các phức hợp nhũ kháng nguyên - dầu - nước Điều này kích thích sản sinh kháng thể và tế bào miễn dịch đặc hiệu kéo dài Các hạt nhũ cũng di chuyển từ vị trí tiêm vào các hạch lympho hoặc các cơ quan miễn dịch, kích thích miễn dịch không đặc hiệu Nhờ đó, liều vắc xin có thể giảm, nhưng hiệu lực miễn dịch lại tăng cao và thời gian miễn dịch được kéo dài.
Chất bổ trợ vi sinh vật thường bao gồm xác của các loài vi khuẩn như Mycobacterium tuberculosis và Salmonella typhimurium Ngoài ra, nội độc tố từ vi khuẩn lipopolysaccharid cũng được sử dụng trong các ứng dụng này.
Độ ổn định của kháng nguyên LMLM
Vi rút lở mồm long móng có cấu trúc bao gồm bốn loại hạt: hạt vi rút 146S với một phân tử ARN sợi đơn và 60 bản sao của bốn polypeptide VP1, VP2, VP3 và VP4; các hạt rỗng 75S không chứa RNA, bao gồm 60 bản sao của VP1, VP3 và VP0; tiểu đơn vị 12S với năm bản sao của VP1, VP2 và VP3 nhưng không có VP4; và liên quan đến kháng nguyên (VIA) có hệ số sa lắng 3.5S trong gradient sucrose.
Cơ thể sản xuất kháng thể trung hòa chủ yếu từ các hạt 146S, trong khi hạt 12S được hình thành khi hạt 146S bị phân hủy bởi axit yếu hoặc khi được làm nóng ở nhiệt độ 56°C.
Kháng nguyên 12S được coi là kháng nguyên tiền điện tử, do đó, kháng thể trung hòa trong huyết thanh từ các hạt 12S thấp và không có ý nghĩa Ngược lại, các hạt vi rút 75S ổn định khi bất hoạt bằng AEI và có thể tồn tại ít nhất 2 năm ở 4°C Hạt 75S có khả năng tạo ra kháng thể trung hòa, tuy nhiên, lượng kháng thể này thấp hơn so với hạt 146S Nồng độ kháng nguyên (tính bằng àg/ml) là phương pháp gián tiếp để xác định thời gian miễn dịch và khả năng đáp ứng miễn dịch của cơ thể Hạt 146S là thành phần miễn dịch chính của vi rút LMLM, và bất kỳ yếu tố nào ảnh hưởng đến hạt 146S đều có thể làm giảm hiệu lực của vắc xin Theo nghiên cứu của M.M Harmsen và cộng sự năm 2015, sự ổn định của 146S có thể kéo dài 3 tháng khi bổ sung đường và BSA trong vắc xin nhũ dầu Để xác định hàm lượng 146S, nhiều phương pháp được sử dụng, trong đó phương pháp sucrose gradient cho kết quả nhanh nhưng yêu cầu thiết bị đắt tiền và không phân biệt được hạt 146S nguyên vẹn với hạt đã bị cắt bởi trypsin Năm 1984, Ouldridge và cộng sự đã giới thiệu phương pháp ELISA để định lượng hàm lượng 146S trong thu hoạch vi rút vắc xin mà không phát hiện kháng nguyên 12S Tuy nhiên, một số nghiên cứu cho thấy phương pháp này định lượng 146S giống như 12S, do đó không phù hợp để xác định hàm lượng toàn bộ vi rút Nghiên cứu thử nghiệm ELISA sử dụng kháng thể kép (DAS) đã được mô tả mối tương quan với phương pháp sucrose gradient.
2.4.4 Các phương pháp đánh giá đáp ứng miễn dịch của động vật khi tiêm vắc xin LMLM
Để đánh giá hiệu quả vắc xin cho động vật, người ta sử dụng nhiều phương pháp, bao gồm đánh giá trực tiếp khả năng kháng vi rút và gián tiếp thông qua hiệu giá kháng thể sau tiêm chủng Liều PD50 (liều bảo hộ 50%) được xác định qua việc tiêm vắc xin cho động vật thí nghiệm và thử thách bằng vi rút công cường độc Hiện nay, liều PD50 cho bê được ước tính bằng cách tiêm cho bê từ 6 tháng tuổi trở lên, chưa tiêm vắc xin LMLM và không có kháng thể LMLM Các bê này sẽ được tiêm các liều vắc xin khác nhau và sau 3 tuần sẽ được thử thách với vi rút, từ đó tính toán liều PD50 dựa trên số lượng động vật được bảo vệ Vắc xin thông thường cần chứa ít nhất 3 PD50, trong khi một số trường hợp có thể yêu cầu tới 6 PD50 Đối với lợn, liều PD50 cũng được tính toán tương tự, với hàm lượng 146S yêu cầu để đạt 1 PD50 là 2,2 µg/serotype/liều, mặc dù khả năng bảo hộ có thể quan sát được ở nồng độ kháng nguyên thấp hơn.
Các xét nghiệm gián tiếp đánh giá hiệu giá kháng thể sau tiêm vắc xin, sử dụng các phương pháp như phản ứng trung hòa vi rút trên môi trường tế bào (VNT) và ELISA Kết quả từ các mẫu huyết thanh giúp xây dựng mối tương quan với hiệu lực của vắc xin trên gia súc Tuy nhiên, việc đánh giá hiệu quả phòng bệnh chỉ dựa vào giá trị tương đồng kháng nguyên không hoàn toàn chính xác, vì giá trị r1 thấp không nhất thiết tương ứng với khả năng bảo hộ kém Ví dụ, vắc xin LMLM với hiệu lực > 6PD50 vẫn có thể bảo hộ trước vi rút dị chủng dù có giá trị r1 thấp Ngược lại, hai chủng vi rút O1 Manisa và O1 Campos có giá trị r1 cao, nhưng tỷ lệ bảo hộ khác nhau khi tiêm vắc xin với nồng độ kháng nguyên khác nhau Nghiên cứu của Boehringer Ingelheim khuyến nghị sử dụng "chỉ số tin cậy" để đánh giá hiệu quả vắc xin, kết hợp giữa giá trị r1 và hiệu giá trung hòa vi rút dị chủng.
Bảng 2.3 Chỉ số tin cậy trong đánh giá hiệu quả vắc xin
TT Chỉ tiêu đánh giá Khảnăng bảo hộ
1 Giá trịr1 ≥ 0,3 & HGKT* trung hòa ≥ 1,42 Có khảnăng bảo hộ cao
2 Giá trị r1 < 0,3 & HGKT trung hòa ≥ 1,42 Có thể bảo hộ
3 Giá trị r1 ≥ 0,3 & HGKT trung hòa < 1,42 Khó dự đoán
4 Giá trị r1 < 0,3 & HGKT trung hòa < 1,42 Không thể bảo hộ
* log 10 hiệu giá kháng thể trung hòa (HGKT)
Tình hình phát tri ể n v ắ c xin lmlm trên th ế gi ớ i
V ắ c xin LMLM vô ho ạ t
Vắc xin sống là phương pháp phổ biến để ngăn ngừa nhiều bệnh do virus, trong khi nghiên cứu phát triển vắc xin LMLM sống nhược độc đang được thực hiện Tuy nhiên, hiện tại, tất cả các vắc xin LMLM được sử dụng toàn cầu đều là vắc xin vô hoạt.
Vào năm 1927, các nhà nghiên cứu đã bắt đầu phát triển vắc xin nhược độc sau khi thành công trong việc làm suy yếu vi rút Đến năm 1950, Frenkel và cộng sự đã nuôi cấy vi rút LMLM trên tế bào biểu mô lưỡi sơ cấp và sử dụng formaldehyde để vô hoạt, nhưng phương pháp này gặp nhiều hạn chế như khả năng nuôi cấy thấp và quá trình vô hoạt không hoàn toàn Đến thập niên 60, các nhà khoa học đã chuyển sang sử dụng tế bào BHK dạng treo và ethylene imines thay cho formaldehyde trong quá trình nuôi cấy và vô hoạt vi rút (Rodriguez & Gay, 2011) Hiện nay, tế bào BHK vẫn được sử dụng rộng rãi để nuôi cấy vi rút, trong khi phương pháp của Frenkel đã trở thành nền tảng cho sản xuất vắc xin trong nhiều năm sau.
Ngày nay, hầu hết các vắc xin LMLM thương mại được sản xuất từ kháng nguyên tinh sạch vô hoạt, bao gồm các protein cấu trúc và chất bổ trợ nhũ dầu Nhiều công thức vắc xin đã được chứng minh hiệu quả trong việc phòng và kiểm soát dịch bệnh LMLM tại Nam Mỹ, châu Âu và châu Phi Đối với vắc xin sử dụng trong trường hợp khẩn cấp, do tính không ổn định của công thức, vắc xin thường được lưu trữ ở dạng đông lạnh và tập trung thành ngân hàng vắc xin ở các quốc gia sạch bệnh, như ngân hàng vắc xin LMLM Bắc Mỹ bao gồm Mỹ, Canada và Mexico Công thức vắc xin đông lạnh kháng nguyên có ít nhất 6PD50, bảo vệ trong 4-7 ngày tiêm cho gia súc, lợn và cừu, đồng thời bảo vệ toàn bộ các subtype trong một serotype (Golde & cs., 2005).
Vắc xin nhũ dầu thường chứa ít nhất 3PD50, giúp giảm triệu chứng lâm sàng và sự nhân rộng của virus, nhưng không ngăn chặn hoàn toàn quá trình lây nhiễm (lên đến 50%) từ các chủng thực địa Miễn dịch từ vắc xin này chỉ kéo dài khoảng 6 tháng, do đó cần tiêm nhắc lại Phản ứng miễn dịch có thể khác nhau tùy thuộc vào từng loài gia súc; ví dụ, dê có đáp ứng miễn dịch muộn hơn bò Ngưỡng bảo hộ cũng khác nhau giữa các loài như cừu, dê và trâu, và hiện chưa có tiêu chuẩn cụ thể Tuy nhiên, khả năng bảo hộ trên bê được xem như đạt trên các loài khác Hiệu quả sử dụng vắc xin nhũ dầu trên dê được đánh giá là vượt trội hơn so với vắc xin keo phèn (Oie, 2018).
Vắc xin sử dụng Al(OH)3 – saponin có quy trình sản xuất đơn giản và kháng nguyên bám chặt vào các hạt gel Al(OH)3 Tuy nhiên, vắc xin này cũng gặp phải một số nhược điểm như khả năng gây sưng cục tại vị trí tiêm, hiệu quả không cao và thời gian miễn dịch ngắn hơn so với vắc xin nhũ dầu Dù vậy, vắc xin vô hoạt keo phèn vẫn được sản xuất và sử dụng rộng rãi cho đa số động vật nhai lại trên toàn thế giới (Doel, 2003; Valtulini & cs., 2005).
M ộ t s ố th ử nghi ệ m v ắ c xin m ớ i
Hướng nghiên cứu phát triển vắc xin LMLM hiện nay không chỉ tập trung vào vắc xin vô hoạt truyền thống mà còn mở rộng sang các loại vắc xin thế hệ mới như vắc xin tiểu phần, vắc xin nhược độc và vắc xin vector tái tổ hợp Mặc dù các loại vắc xin này có ưu điểm như khả năng phân biệt kháng thể do nhiễm tự nhiên và tiêm vắc xin, cùng với độ dài miễn dịch kéo dài, nhưng vẫn gặp phải nhược điểm như hiệu quả thấp và nguy cơ tái tổ hợp hoặc cường độc trở lại Tính đến thời điểm hiện tại, vắc xin vô hoạt vẫn là loại duy nhất được sử dụng để phòng bệnh LMLM trên toàn cầu.
Các v ắ c xin LMLM hi ệ n hành
Hiện nay, trên thế giới có nhiều loại vắc xin được sản xuất bởi các công ty như Merial, Intervet và Pfizer, sử dụng công nghệ tương tự Quy trình sản xuất bao gồm nuôi vi rút LMLM trên tế bào BHK21 dạng treo, sau đó làm vô hoạt vi rút bằng BEI Tiếp theo, kháng nguyên vi rút được cô đặc và làm sạch trước khi kết hợp với chất bổ trợ nhũ dầu kép hoặc keo phèn cùng với Saponin.
Vắc xin có bổ trợ keo phèn mang lại đáp ứng miễn dịch nhanh và mạnh, trong khi vắc xin nhũ dầu kép cung cấp đáp ứng chậm hơn nhưng kéo dài Vắc xin LMLM có thể chứa một hoặc nhiều serotype, bao gồm O, A và Asia 1 Cục Thú y khuyến cáo sử dụng vắc xin LMLM với kháng nguyên có tương đồng (r1 ≥ 0,3) với các dòng vi rút LMLM tại Việt Nam Đối với vắc xin LMLM đơn giá típ O, có thể chứa một hoặc nhiều trong số năm thành phần kháng nguyên tương đồng với các dòng vi rút týp O lưu hành Một số vắc xin LMLM được cấp phép tại Việt Nam bao gồm vắc xin đơn giá típ O do công ty TNHH MTV Avac Việt Nam sản xuất và vắc xin nhập khẩu từ Merial do Navetco và Vetvaco phối trộn Ngoài ra, còn có vắc xin nhập khẩu từ Nga, Trung Quốc và Argentina.
PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG
VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Th ờ i gian nghiên c ứ u
- Đềtài được tiến hành từtháng 8/2019 đến tháng 7/2020
Địa điể m nghiên c ứ u
- Nghiên cứu được thực hiện tại công ty TNHH MTV Avac Việt Nam
Nguyên vật liệu, đối tượng sử dụng trong nghiên cứu
Chủng giống vi sinh, động vật thử nghiệm
Vắc xin vô hoạt phòng bệnh lở mồm long móng được sản xuất từ chủng vi rút O/FMD/Avac3, là kết quả của nghiên cứu chọn lọc chủng vi rút LMLM, theo báo cáo của công ty RTD (Công văn số 30.10/2016/BC-RTD).
- Chủng giống vi rút lựa chọn thuộc nhóm O/ME –SA/Panasia: O manisa, O/VN/ HN1/2013, O/VN/HT1/2015; nhóm O Cathay: O/VIT/9/2008; nhóm O
/SEA-Mya98: O/VIT/5/2010; nhóm O/ME-SA/Ind2001: O/pig/Daklak/15 Thông tin một số chủng dùng làm phản ứng trung hoà chéo trong bảng 3.1
Bảng 3.1 Nguồn gốc các vi rút được chọn đểđánh giá chọn giống
STT Tên chủng giống Địa phương Năm phân lập Động vật Topotype
1 O manisa Vi rút được chọn có thành phẩn kháng nguyên tương đồng với chủng vi rút LMLM lưu hành ở Việt Nam
2 O/ VN/HN1/2013 Sơn Tây- Hà Nội 2013 Lợn ME –
3 O/VN/HT1/2015 Kỳ Anh- Hà Tĩnh 2015 Bê ME-
4 O/FMD/Avac3 Bảo Lộc –Lâm Đồng 2015 Bò ME –
5 O/pig/Daklak/15 Đắk Lắk Không có thông tin Lợn ME-
6 O/VIT/9/2008 Tp Hồ Chí Minh 2008 Lợn Cathay
7 O/VIT/5/2010 Hà Tĩnh 2010 Lợn SEA- Mya98
- Động vật thí nghiệm: lợn 4 - 5 tuần tuổi chưa tiêm vắc xin LMLM và không có kháng thể kháng virus LMLM
- Tế bào BHK21 (Baby Hamster Kidney) dạng bám đáy.
Hóa chất
- Hóa chất và sính phẩm nuôi cấy tế bào: DMEM (Dulbecco's Modified
Eagle Medium), FBS (Fetal Bovine serum), TV 1x (Trypsin versene), PBS (Phosphate Buffered Saline), Penicillin/ Streptomycin
- Hóa chất dùng để vô hoạt, nhũ hóa: BEI (Binary Ethylenimine),
Na2S2O3 (Sodium thiosulfate), ISA 201 VG, keo phèn nhôm Al(OH)3 , Saponin
- Môi trường kiểm tra vô trùng:TSB (Trypticase Soybean), TSA
(trypticase soy agar), SD (sabouraud dextrose agar), XLD (Xylose Lysine Deoxycholate), FTM (fruid thioglycolate), thạch máu
The Liquid Phase Blocking ELISA (LPBE) for detecting FMDV antibodies, provided by Pirbright, UK, utilizes a range of essential chemicals Key components include coating buffer, Tween 20, skim milk, OPD (o-Phenylenediamine), TMB (Tetramethyl benzidine), citric acid, H2SO4, rabbit antiserum, guinea pig antiserum, rabbit anti-Guinea Pig IgG (H+L) secondary antibody, HRP, positive control serum, and negative control serum.
Trang thiết bị, dụng cụ
- Phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp 3, nhà thử nghiệm động vật
- Phòng nuôi cấy tế bào, vi rút và các thiết bị an toàn sinh học khác: tủ ấm
CO2, tủ lạnh 2 – 8 0 C, tủ âm 80 0 C, cân phân tích, máy đo pH, máy đọc ELISA, máy lắc, pipet điện, máy tạo nhũ, máy lọc tiếp tuyến
- Dụng cụ: đầu tớp cỏc loại (10 àl, 50 àl, 100 àl, 200 àl, 1000 àl), đĩa ELISA, chai tế bào các loại: T25, T75, chai 10 tầng.
Nội dung nghiên cứu
Giám định đặc tính di truyền của vi rút vắc xin
- Phân tích tương đồng trình tự gen và xây dựng cây phả hệ
Khả năng sản sinh đáp ứng miễn dịch của vắc xin LMLM chủng O3
- Đáp ứng miễn dịch của lợn khi tiêm một mũi vắc xin
- Đáp ứng miễn dịch của lợn khi tiêm hai mũi vắc xin
Ảnh hưởng của chất bổ trợ tới đáp ứng miễn dịch
- Đáp ứng miễn dịch của lợn khi tiêm vắc xin LMLM vô hoạt keo phèn
- So sánh đáp ứng miễn dịch ở lợn tiêm vắc xin nhũ dầu và keo phèn bằng phản ứng trung hòa và phản ứng LPB- ELISA
Khả năng bảo hộ chéo đối với chủng vi rút thực địa
- Mức tương đồng kháng nguyên với chủng vi rút thuộc topotype ME-SA
- Mức tương đồng kháng nguyên với các topotype O lưu hành ở Việt Nam
Độ dài mi ễ n d ị ch t ạ o ra b ở i v ắ c xin LMLM ch ủ ng O3
- Xác định độ dài miễn dịch bằng phản ứng trung hòa
- Xác định độ dài miễn dịch bằng phản ứng LPB- ELISA
Phương pháp nghiên cứ u
Phương pháp nuôi cấ y t ế bào và gây nhi ễ m vi rút
Tế bào dòng được nuôi cấy trên môi trường DMEM, bổ sung 10% huyết thanh bào thai bò (FBS) như sau:
Khi tế bào BHK21 phát triển đầy đủ trên đáy chai nuôi cấy sau khoảng 48 giờ, tiến hành tách tế bào bằng Trypsin 1x Khi tế bào co lại và bong ra, bổ sung DMEM 1x để trung hòa trypsin, sau đó chuyển tế bào vào ống ly tâm và thu cặn tế bào Cuối cùng, phục hồi tế bào bằng dung dịch DMEM 1x, đếm số lượng tế bào và tính toán nồng độ tế bào trong chai.
Chuẩn độ vi rút và trung hòa tế bào theo quy trình dùng đĩa 96 giếng và
Trong quy trình sản xuất kháng nguyên, mỗi giếng chứa 50.000 tế bào Phương pháp gây nhiễm tế bào được thực hiện bằng cách sử dụng virus để chuẩn bị kháng nguyên trên chai 10 tầng Để thực hiện điều này, cần gây nhiễm 20 ml giống virus vào chai.
10 tầng, ủ 60 phút/ 37 0 C/thêm môi trường duy trì DMEM, nuôi cấy trong tủ ấm
37 0 C có 5% C02 Theo dõi bệnh tích tế bào Sau khi bệnh tích đạt trên 80% thì thu hoạch huyễn dịch Thường thu hoạch kháng nguyên từ 18 – 24 giờ sau gây nhiễm.
Phương pháp chuẩn độ vi rút và trung hòa vi rút trên t ế bào
3.5.2.1 Phương pháp chuẩn độ vi rút
Để xác định chỉ số TCID50 (liều gây chết 50% tế bào có hiện tượng bệnh lý tế bào), phương pháp chuẩn độ vi rút trên tế bào dạng treo được áp dụng Công thức tính toán theo phương pháp Spearman và Karber là: Log TCID50 = X0 - d/2 + d x ri/ni.
Nồng độ pha loãng cao nhất (X0) là mức mà tại đó 100% tế bào có bệnh tích xuất hiện, trong khi d đại diện cho khoảng cách pha loãng và ri là tổng số giếng tế bào có bệnh tích từ nồng độ đã xác định.
X0; ni: số giếng tế bào gây nhiễm ở mỗi nồng độ
Vi rút LMLM được pha loãng theo tỉ lệ 10 (từ 10^-1 đến 10^-8) trong môi trường DMEM Trên đĩa 96 giếng, cho 100 µl huyễn dịch vi rút vào các giếng tương ứng, sau đó thêm 100 µl tế bào, lắc nhẹ và ủ đĩa trong 2 ngày Kết quả được đọc bằng cách ghi số giếng có hiện tượng hiệu ứng tế bào (CPE) và tính TCID50 theo công thức.
3.5.2.2 Phương pháp trung hòa vi rút trên nuôi cấy tế bào (VNT)
Theo hướng dẫn của OIE (2018), việc trung hòa vi rút trên nuôi cấy tế bào được thực hiện bằng cách sử dụng dung dịch tế bào BHK21 dạng treo Quá trình này diễn ra trên đĩa nuôi cấy.
96 giếng, nồng độ tế bào là 50000 tế bào/giếng
Vi rút LMLM O/FMD/Avac3 được pha loãng trong dung dịch DMEM với nồng độ trung hòa 100 TCID50/giếng Huyết thanh ở các thời điểm 0, 28 và 56 ngày được xử lý bằng phương pháp diệt bổ thể ở 56 độ C trong 30 phút, sau đó pha loãng theo tỷ lệ 2 từ 1/8 đến 1/512 Mỗi bậc pha loãng được thực hiện lặp lại hai lần (2 giếng) Vi rút được trộn với huyết thanh theo tỷ lệ 1:1 (50 µl: 50 µl), ủ ở 37 độ C trong 60 phút, sau đó thêm 50 µl tế bào đạt nồng độ.
Trong nghiên cứu này, 50.000 tế bào được đưa vào giếng và nuôi ở tủ ấm với nhiệt độ 37 độ C và 5% CO2 Sau 2 ngày, bệnh tích tế bào được theo dõi và kết quả được đọc theo hướng dẫn của OIE Kết quả dương tính (+) cho thấy tế bào trong giếng phản ứng không bị phá hủy, trong khi kết quả âm tính (-) cho thấy tế bào bị phá hủy và bong ra khỏi đáy giếng, để lại khoảng trống Hiệu giá trung hòa 50% được tính bằng phương pháp Spearman-Karber với công thức LogVNT50 = Xo + d/2 - d∑ri/ni.
Trong nghiên cứu này, Xo được định nghĩa là log10 của nghịch đảo độ pha loãng huyết thanh cao nhất, trong khi d là log10 của khoảng cách pha loãng Kết quả được phân loại như sau: âm tính nếu log10 VNT50 ≤ 1,21 (1/16), dương tính nếu log10 VNT50 ≥ 1,65 (1/45), và nghi ngờ nếu log10 VNT50 nằm trong khoảng 1,21 (1/16) đến 1,5 (1/32) Nếu kết quả lặp lại cao hơn 1,21 (1/16), sẽ được xem là dương tính, ngược lại sẽ được coi là âm tính.
Theo TCVN 8685 -10: 2014, vắc xin được coi là đạt tiêu chuẩn khi hiệu giá kháng thể trung hòa virus đạt mức 1/100, đặc biệt khi vắc xin có tính tương đồng kháng nguyên Để đánh giá tính tương đồng này, cần thực hiện phương pháp tính tương quan r1 (Serological relationship: r1 – value), với công thức r1 = Hiệu giá kháng thể của huyết thanh do vắc xin trung hòa với virus chia cho hiệu giá kháng thể của huyết thanh do vắc xin trung hòa với virus vắc xin.
Giá trị r1 ≥ 0,3 được xem như vi rút vắc xin có tương đồng kháng nguyên với vi rút thực địa
Giá trị r1 < 0,3 được xem như vi rút vắc xin không tương đồng kháng nguyên với vi rút thực địa.
Phương pháp cô đặ c, vô ho ạ t, ph ố i tr ộ n v ớ i ch ấ t b ổ tr ợ và ki ể m tra v ắ c
3.5.3.1 Phương pháp vô hoạt vi rút bằng BEI
Vi rút LMLM được thu hoạch từ môi trường nhiễm trên tế bào BHK21, sau đó được lọc, cô đặc và vô hoạt bằng BEI (Binary ethylenimine) theo hướng dẫn của OIE (Oie, 2018).
+ Vô hoạt vi rút tại nồng độ 1mM BEI /ml kháng nguyên trong 24 giờ tại
+ Sau 24 giờ vô hoạt, trung hòa lượng BEI tồn dư bằng dung dịch Na- thiosulphate (Na2S2O3) trong 2 giờ tại 37 0 C
Thu hoạch và kiểm tra vi rút sau quá trình vô hoạt được thực hiện thông qua phương pháp nuôi cấy huyễn dịch vi rút trên môi trường tế bào BHK21.
Kiểm tra vô hoạt vi rút được thực hiện bằng cách nuôi cấy và cấy chuyển huyễn dịch vi rút trên môi trường tế bào BHK21 qua 3 lần liên tiếp Vi rút được coi là vô hoạt đạt yêu cầu nếu sau 3 lần cấy chuyển, không xuất hiện bệnh tích trên chai nuôi cấy tế bào BHK21 sau 3 ngày theo dõi Quá trình này được thực hiện trên chai tế bào T25 với lượng huyễn dịch vi rút gây nhiễm là 1ml.
3.5.3.2 Phương pháp phối trộn kháng nguyên với chất bổ trợ
Phương pháp nhũ hóa bằng nhũ dầu khoáng kép Montanide ISA 201VG (nhũ nước trong dầu trong nước) của hãng Seppic (Pháp)
- Kháng nguyên và nhũ dầu được trộn theo tỷ lệ 1 : 1
- Quá trình nhũ hóa được thực hiện trên máy nhũ hóa vắc xin chuyên dụng với quy trình như sau:
+ Bước 1: Chuẩn bị pha dầu khoáng ISA 201VG đã tiệt trùng: khuấy nhẹ nhàng từ 50 - 100 vòng/phút trong khoảng 10 - 20 phút
Bước 2: Chuẩn bị pha nước kháng nguyên bằng cách chuyển từ từ kháng nguyên vào tank chứa pha dầu với tỷ lệ 1:1 Trong quá trình chuyển kháng nguyên, cần tiếp tục khuấy trộn cho đến khi hoàn tất lượng kháng nguyên cần thiết.
+ Bước 3 Tạo nhũ bằng máy khuấy chuyên dụng tại tốc độ 300 - 400 vòng/phút trong 20 - 30 phút Quan sát thấy huyễn dịch đồng nhất hoàn toàn thì tắt máy khuấy
Phương pháp phối trộn kháng nguyên với chất bổ trợ keo phèn nhôm Al(OH) 3
- Kháng nguyên và chất bổ trợ được trộn theo tỷ lệ 1:1
- Quá trình phối trộn được thực hiện trên tank phối trộn vắc xin chuyên dụng với quy trình như sau:
+ Bước 1: Chuẩn bị keo phèn phèn nhôm Al(OH)3 đã tiệt trùng: khuấy nhẹ nhàng từ 100 – 200 vòng/phút trong khoảng 20 - 30 phút
+ Bước 2: Chuẩn bị kháng nguyên đã làm mát 2 - 8 o C Khuấy trộn 100 –
200 vòng/phút cho hỗn dịch đồng nhất
Bước 3: Chuyển lượng keo phèn nhôm vào tank chứa kháng nguyên theo tỷ lệ 1:1 Trong quá trình chuyển, cần tiếp tục khuấy trộn cho đến khi hoàn tất việc chuyển toàn bộ keo phèn cần thiết.
+ Bước 4: Tiếp tục khuấy trộn với tốc độ 100 - 200 vòng/phút trong 60 -
120 phút Quan sát thấy huyễn dịch đồng nhất hoàn toàn thì tắt máy khuấy Bảo quản ở nhiệt độ 2 – 8 o C
3.5.3.3 Phương pháp kiểm tra sau khi nhũ hóa vắc xin
Kiểm tra tính chất nhũ đơn và nhũ kép có thể thực hiện bằng phương pháp Drop test Để thực hiện, nhỏ 2 ml vắc xin vào cốc nước cất và lặp lại quy trình này ba lần Quan sát sự khuyếch tán của giọt dầu trong nước; với dầu khoáng kép, một phần sẽ nổi lên trên bề mặt tạo thành lớp màu trắng, trong khi phần còn lại sẽ phân tán trong nước.
Để kiểm tra độ ổn định của nhũ, cần thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất Cụ thể, ly tâm 10ml vắc xin ở tốc độ 3500 vòng/phút trong 30 phút để đánh giá mức độ phân pha của mẫu vắc xin nhũ dầu Nếu phần dầu tách ra ở phía trên trong giới hạn cho phép từ 5-10% và có thể phục hồi bằng tay, vắc xin sẽ được chấp nhận.
Kiểm tra hạt nhũ là một bước quan trọng trong quá trình sản xuất vắc xin, yêu cầu làm tiêu bản và soi dưới kính hiển vi với độ phóng đại tối thiểu 400 lần Để đảm bảo chất lượng, hạt nhũ phải có kích thước nhỏ và đồng đều.
Phương pháp lự a ch ọn độ ng v ậ t thí nghi ệ m
- Động vật thí nghiệm: lựa chọn lợn khoẻ mạnh, từ 4 -5 tuần tuổi, chưa được tiêm vắc xin LMLM và không có kháng thể LMLM
Để xác định liệu động vật có tiêm vắc xin LMLM hay không, cũng như có bị nhiễm tự nhiên hay không, phương pháp ELISA được sử dụng Kit ELISA phát hiện kháng thể kháng protein phi cấu trúc từ hãng IDEXX, cụ thể là bộ xét nghiệm kháng thể đa loài cho bệnh lở mồm long móng (FMD) với mã số 06-41379-00.
Lấy lượng giếng phủ kháng nguyên tương ứng với mẫu cần kiểm tra và ghi lại vị trí mẫu Các giếng chưa sử dụng cần được bảo quản trong túi zip chống ẩm ở nhiệt độ 2-8 độ C Thời gian ủ mẫu nên được giữ ở mức ngắn.
Cho 90àl dung dịch pha loóng mẫu vào mỗi giếng
Cho 10àl đối chứng dương (PC) vào hai giếng
Cho 10àl đối chứng õm (NC) vào hai giếng
Cho 10 àl vào cỏc giếng chứa dung dịch pha loóng mẫu
Sử dụng pipet đa kênh trộn đều 10 lần ở tất cả các giếng
Dán tấm dán mặt đĩa và ủ ở 18-26 0 C trong 60 phút (cho phép dao động 5 phút)
Bước 2: Conjugate Đĩa sau khi ủ 18 - 26 0 C trong 60 phút với cách ủ thời gian ngắn và 18-26 0 C trong 30 phút với cách ủ thời gian dài
Gỡ tấm dán mặt đĩa loại bỏ dung dịch trong đĩa ủ
Rửa đĩa 5 lần với dung dịch rửa 1X 300 àl/giếng/lần, chú ý không để đĩa chồng lên nhau giữa các lần rửa Ở lần rửa cuối, nhẹ nhàng đập đĩa vào giấy thấm để loại bỏ hoàn toàn dung dịch rửa trong giếng.
Cho 100àl conjugate vào mỗi giếng
Với quy trình ủ trong thời gian ngắn: Dán tấm dán mặt đĩa và ủ ở 18-26 0 C trong 60 phút (dao động 5 phút)
Với quy trình ủ trong thời gian qua đêm: Dán tấm dán mặt đĩa và ủ ở 18-
26 0 C trong 30 phút (dao động 5 phút)
Bước 3: Cơ chất Đĩa sau khi ủ conjugate gỡ tấm dán mặt đĩa loại bỏ dung dịch trong đĩa
Rửa đĩa 5 lần bằng dung dịch rửa 1X 300 àl/giếng/lần, chú ý tránh để quỏ khụ giữa các lần rửa và các đĩa rửa Ở lần rửa cuối, nhẹ nhàng đập đĩa vào giấy thấm để loại bỏ hoàn toàn dung dịch rửa còn lại trong giếng.
Cho 100àl TMB vào mỗi giếng Ủ ở 18-26 0 C trong 10 phút (dao động 1 phút)
Bước 4: Dừng phản ứng và đọc kết quả
Thêm 100μl dung dịch dừng vào mỗi giếng và đọc kết quả bằng máy đọc ELISA với bước sóng 450nm Lưu ý rằng nên thực hiện việc đọc kết quả trong vòng 2 giờ sau khi dừng phản ứng để đảm bảo độ chính xác.
Bước 5: Tính kết quả Đối chứng: Đối chứng âm (Negative control: NC) Đối chứng dương (Positive Control: PC)
Giá trị hợp lệ khi:
Trong trường hợp kết quả giá trị đối chứng âm và đối chứng dương không hợp lệ thì cần phải làm lại thí nghiệm
Kết luận: Đối với trâu bò, dê, cừu: S/P % < 35 là âm tính, S/P % ≥ 35 là dương tính Đối với lợn: S/P % < 55 là âm tính, S/P % ≥ 55 là dương tính
Phương pháp xác đị nh li ề u gây nhi ễ m và s ố l ầ n tiêm v ắ c xin cho l ợ n
Bước 1: Xây dựng khung liều vi rút O/FMD/Avac3 trước khi vô hoạt: 10 6 ,
Bước 2: Tiến hành vô hoạt từng nồng độ vi rút Phối trộn với chất bổ trợ nhũ dầu
Chuẩn bị động vật thí nghiệm: 35 con lợn 4 -5 tuần tuổi, chưa được tiêm vắc xin LMLM và không có kháng thể LMLM
Bố trí thí nghiệm như sau:
Nhóm Kí hiệu nhóm Số lần tiêm
(2ml/con/lần) Số con
Lợn được tiêm 2 mũi, mũi 2 cách mũi 1 là 28 ngày
Lấy máu thu hoạch huyết thanh vào các thời điểm 0, 14, 21, 28, 35, 42, 49 và 56 ngày sau mũi 1
Xác định hiệu giá kháng thể của lợn sau tiêm của từng nồng độ vi rút So sánh, lựa chọn liều gây nhiễm phù hợp
Theo dõi độ dài miễn dịch của vắc xin trên lợn bằng cách lấy mẫu máu định kỳ hai tuần một lần, kéo dài đến sáu tháng sau khi tiêm mũi thứ hai Việc xác định hiệu giá kháng thể của lợn được thực hiện thông qua phương pháp trung hòa và phương pháp ELISA.
Phương pháp xác đị nh hi ệ u giá kháng th ể c ủ a l ợ n tiêm v ắ c xin keo phèn
Chuẩn bị: 15 lợn 4 -5 tuần tuổi chưa tiêm vắc xin LMLM và không có kháng thể LMLM
Vắc xin LMLM vô hoạt được phối trộn với chất bổ trợ keo phèn
+ Nhóm thí nghiệm (K1): 10 con, Lợn được tiêm 2 mũi, mũi 2 cách mũi 1 là 28 ngày
+ Nhóm đối chứng (K2): 5 con, không tiêm vắc xin
Lấy máu lợn tại các thời điểm 0, 28, 56 ngày
Xác định hiệu giá kháng thể của lợn sau khi tiêm bằng phương pháp VNT và phương pháp LPB- ELISA.
Phương pháp định lượ ng kháng th ể b ằng phương pháp LPB – ELISA (Liquid phase blocking ELISA)
According to TCVN 8400-1:2010, the LPB-ELISA method is conducted using the Liquid Phase Blocking ELISA (LPBE) for the detection of FMDV antibodies, utilizing the test kit from Pirbright, UK.
Sau khi lấy mẫu máu lợn, tất cả các mẫu bệnh phẩm cần được bao gói cẩn thận và bảo quản ở nhiệt độ từ 4°C đến 8°C Việc vận chuyển mẫu đến phòng thí nghiệm nên được thực hiện ngay lập tức để đảm bảo chất lượng và độ chính xác của kết quả xét nghiệm.
- Xử lý mẫu: Mẫu máu khi lấy xong để ở nhiệt độ phòng 2-3 giờ Sau đó, cho mẫu vào tủ 4°C để ra huyết thanh.
- Chuyển mẫu sang ống eppendorf 1.5ml
- Ly tâm mẫu ở 5000 vòng/phút trong 5 phút ở 4°C
- Thu huyết thanh vào ống eppendorf 1.5ml (ghi ngày tháng năm lấy mẫu, nơi lấy mẫu, số thứ tự của phòng thí nghiệm)
- Mẫu huyết thanh được xử lý nhiệt 56 0 C trong 30 phút
- Mẫu huyết thanh để lưu mẫu được quản ở tủ -20°C
Cho 50 àl rabbit antisera 1/1000 vào cỏc giếng tương ứng của đĩa ELISA
Vỗ nhẹ thành đĩa đảm bảo dung dịch phủ kín đáy đĩa, dán tấm dán đĩa
Bước 2: Ủ huyết thanh chẩn đoán với kháng nguyên
Pha loóng mẫu theo cơ số 2 trong đĩa 96 giếng chữ U và cho 50 àl huyết thanh đã pha loãng theo sơ đồ bố trí thí nghiệm (từ 1-5 mẫu) sau:
Pha chế dung dịch ELISA buffer chuẩn là bước quan trọng trong quy trình xét nghiệm Thêm 50µl dung dịch vào mỗi giếng chứa huyết thanh đã được pha loãng, trong khi đối chứng kháng nguyên chỉ cần sử dụng dung dịch ELISA buffer.
Lắc nhẹ đĩa đảm bảo trộn đều kháng nguyên và huyết thanh Ủ ở 2-8 0 C qua đêm
Bước 3: Chuyển hỗn hợp phản ứng kháng nguyên/huyết thanh vào đĩa ELISA
Rửa đĩa ELISA đó phủ Rabbit antiserum 5 lần 200àl cho một giếng/lần bằng PBS pH 7.4 Đập nhẹ trên giấy thấm để thấm khô dung dịch trong đĩa
Hỳt 50àl hỗn hợp khỏng nguyờn và huyết thanh từ đĩa chữ U sang đĩa ELISA theo đúng sơ đồ thí nghiệm trên Ủ lắc 37 0 C trong 1 giờ
Bước 4: Cho kháng thể nhận biết (Guinea Pig antisera)
- Pha loãng kháng thể nhận biết Guinea Pig Antisera serotype O ở hiệu giá 1/1000 trong dung dịch ELISA buffer
Sau khi ủ, hãy loại bỏ dung dịch trong đĩa ELISA Tiến hành rửa đĩa ELISA 200 lần cho mỗi giếng bằng PBS pH 7.4 Cuối cùng, đập nhẹ đĩa lên giấy thấm để thấm khô dung dịch còn lại trong đĩa.
- Cho 50àl guinea pig antisera 1/1000 vào tất cả cỏc giếng
Bước 5: Cho Rabbit anti guinea pig HRP
- Pha loãng rabbit anti-guinea pig-HRP 1/1000 trong dung dịch ELISA buffer
Sau khi ủ, cần loại bỏ dung dịch trong đĩa ELISA Tiến hành rửa đĩa ELISA 200 lần cho mỗi giếng bằng dung dịch PBS pH 7.4 Cuối cùng, đập nhẹ đĩa lên giấy thấm để thấm khô dung dịch còn lại trong đĩa.
- Cho 50àl Rabbit anti guinea pig HRP 1/1000 vào tất cả cỏc giếng
Bước 6: Cho dung dịch cơ chất
Sau khi ủ, loại bỏ dung dịch trong đĩa ELISA và tiến hành rửa đĩa 200 lần cho mỗi giếng bằng PBS pH 7.4 Cuối cùng, đập nhẹ đĩa lên giấy thấm để thấm khô dung dịch còn lại trong đĩa.
- Cho 50àl cơ chất vào tất cả cỏc giếng
- Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng/10 phút
Bước 7: Dừng phản ứng và đọc kết quả
Cho 50µl dung dịch Stop solution vào mỗi giếng và nhẹ nhàng lắc đều để dung dịch tan hoàn toàn Sau đó, đọc kết quả bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 492 nm.
Bước 8: Phân tích kết quả
Các điều kiện chấp nhận đĩa phản ứng
Các giá trị PI của đối chứng được tính như sau:
OD trung bình của Ca
Các đối chứng phải thỏa mãn các điều kiện sau: Khoảng OD và giá trị PI của đối chứng được nhà sản xuất đưa ra Đối chứng UCL LCL
Chú thích: UCL (Upper Control Limits): giới hạn trên của đối chứng
LCL (Low Control Limits): Giới hạn dưới của đối chứng Ca: (control antigen): đối chứng kháng nguyên
Phân tích kết quả của mẫu
Giá trị PI của mẫu được tính như sau:
OD trung bình của Ca
Phương pháp giải trình tự gen VP1
Gen VP1 của vi rút lở mồm long móng mã hóa cho protein vỏ, một thành phần quan trọng quyết định độc lực của vi rút.
Sự biến đổi di truyền của vi rút LMLM chủ yếu tập trung vào gen VP1 Nghiên cứu đã sử dụng cặp mồi đặc hiệu trong phản ứng RT-PCR để khuếch đại gen VP1, nhằm phục vụ cho việc giải mã toàn bộ trình tự gen này Cặp mồi được sử dụng bao gồm VN-VP1F: 5’- AGYGCYGGYAARGAYTTTGA -3’ và VN-VP1R: 5’-
Sản phẩm PCR có kích thước 821 bp đã được giải trình tự gen VP1 bởi công ty 1st BASE (Lê Văn Phan & cs., 2016) Phương pháp xây dựng cây phả hệ được thực hiện bằng phần mềm MEGA.
Xử lý số liệu
- Tính toán cơ bản được thực hiện bằng phần mềm Microsoft Excel
- So sánh các giá trị trung bình bằng phân tích sâu ANOVA một yếu tố (post- hoc One way ANOVA) với phép thử Tukey ’ s
+ Giá trị P> 0,05: Sự sai khác không có ý nghĩa thống kê
+ Giá trị P< 0,05: Sự sai khác có ý nghĩa thống kê
PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Dự án khoa học & công nghệ (KHCN) về sản xuất vắc xin phòng bệnh cho vật nuôi Việt Nam bắt đầu từ năm 2013, với Công ty RTD thực hiện dự án “Công nghệ sản xuất vắc xin phòng bệnh lở mồm long móng cho gia súc” trong giai đoạn 2014 – 2018 Trong giai đoạn này, công ty đã đạt được kết quả ban đầu trong việc chọn giống phân lập từ các địa phương và hoàn thành hồ sơ giống các týp O, A và Asia1 để sản xuất vắc xin Đến giai đoạn 2018-2020, với mục tiêu sản xuất vắc xin đơn giá và đa giá týp O, A, công ty tiến hành nghiên cứu tính sinh miễn dịch của chủng vi rút O/FMD/Avac3 (gọi là chủng O3) với các chất bổ trợ khác nhau và tính tương đồng kháng nguyên với các chủng thực địa khác.
