VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu nghiên cứu
- Mẫu rong câu chỉ vàng Gracilaria tenuistipitata
- Địa điểm thu mẫu: Phù Long – Cát Hải – Hải Phòng
Mẫu được đặt tên khoa học bởi TS Đàm Đức Tiến từ Viện Tài nguyên và Môi trường biển Tiêu bản hiện đang được lưu trữ tại Viện Tài nguyên và Môi trường biển cũng như tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Thiết bị và hóa chất nghiên cứu
- Máy sắc ký GC FINNIGAN Trace GC ultra – Gemany
- Mỏy cụ quay chõn khụng EYELA N-1200ê
- Máy ly tâm MIKRO 220R Hettich- Zentrifugen
- Cõn phõn tớch XT 220ê Precisa
- Thiết bị nấu, lọc agar
- Hệ thống bảo quản mẫu
- Một số thiết bị thiết yếu trong phòng thí nghiệm
- Dung môi sử dụng để xử lý nguyên liệu methanol, ethanol, aceton, chloroform…
- Na2SO4, CH3ONa, NaOH, H2SO4
- Các hóa chất dùng trong phân tích Na2SO4, CH3ONa, NaOH, H2SO4
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp thu và bảo quản mẫu rong câu chỉ vàng
Việc thu mẫu ở vùng triều được thực hiện theo quy phạm tạm thời điều tra tổng hợp biển của Uỷ ban Khoa học và Kĩ thuật Nhà nước ban hành năm 1981 Khảo sát vùng dưới triều được tiến hành dựa trên tài liệu hướng dẫn của Wilkinson & Baker (1997), sử dụng thiết bị lặn SCUBA và máy chụp ảnh dưới nước OLYMPUS kỹ thuật số (sản xuất tại Nhật Bản).
Mẫu bảo quản hoặc làm tiêu bản sau khi thu được ngâm trong dung dịch formol 5% Sau đó, mẫu khô (tiêu bản) được đặt trên giấy Croki và ép trong giấy thấm để đảm bảo độ bền và chất lượng.
Mẫu nghiên cứu hóa-sinh cần được thu thập khoảng 2 kg rong tươi, sau đó rửa sạch bằng nước mặn, tiếp theo là nước ngọt Ngay sau khi rửa, mẫu phải được bảo quản ở nhiệt độ ≤ 4°C Trong thực địa, có thể bảo quản bằng túi lạnh hoặc đá khô; trong phòng thí nghiệm, sử dụng tủ bảo ôn SANAKY và sau đó chuyển vào tủ lạnh sâu ở -20°C.
Mẫu thành phần loài được phân tích tại Phòng Sinh thái và Tài nguyên Thực vật Biển thuộc Viện Tài nguyên và Môi trường Biển Quy trình định loại chủ yếu dựa vào các tiêu chuẩn hình thái và cấu tạo bên trong, sử dụng tiêu bản lát cắt dưới kính hiển vi Leica với độ phóng đại lên đến 1350 lần.
29 rong biển tuân theo nguyên tắc chung phân loại thực vật Tài liệu định loại căn cứ vào các tác giả như: Okamura, Taylor (1960), Segawa (1962), Phạm Hoàng Hộ
(1969), Tseng (1993), Nguyễn Hữu Dinh và nnk., (1993), Tseng và nnk (2000), Yoshida (1998), Tseng and al (2000) [2,6,21]
2.3.2 Phương pháp xác định hàm ẩm
Xác định hàm ẩm của rong theo phương pháp sấy khô [25]:
Thực nghiệm bắt đầu bằng việc sấy cốc cân sạch ở nhiệt độ 105 °C cho đến khi trọng lượng không đổi, sau đó xác định trọng lượng cốc cân mo (g) Tiếp theo, cho 10g rong vào cốc và cân phân tích, ghi nhận tổng khối lượng cốc và mẫu là m1 (g) Cốc sau đó được đặt vào tủ sấy ở 105 °C trong khoảng 4 giờ Sau khi lấy cốc mẫu ra, để nguội trong 15 phút trong bình hút ẩm, cốc mẫu được cân lại Sau đó, cốc được sấy tiếp khoảng 2 giờ và cân lại cho đến khi trọng lượng cốc mẫu không thay đổi giữa các lần sấy, ghi nhận khối lượng m2 (g).
Kết quả tính độ ẩm: (W)
mo: Khối lượng cốc sau khi sấy đến khối lượng không đổi
m1: Khối lượng cốc và mẫu trước khi sấy
m2: Khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy đến khối lượng không đổi
2.3.3 Xác định hàm lượng lipit tổng
Phương pháp của E.G Bligh và W.J Dyer (1959) đã được điều chỉnh và cải tiến để phù hợp với điều kiện Việt Nam tại phòng Hóa sinh hữu cơ thuộc Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên.
Dụng hệ dung môi chiết là CHCl3: CH3OH với tỷ lệ 1/2 (v/v)
Thực nghiệm được tiến hành bằng cách cân 100 gam mẫu rong biển tươi, nghiền nhỏ và chiết xuất bằng 300ml dung môi CHCl3:CH3OH theo tỉ lệ 1:2, siêu âm trong 6 giờ Sau đó, bổ sung 100ml CHCl3 và 100ml nước cất, lắc đều để phân lớp, lấy phần dung dịch ở phía dưới, rửa lại bằng nước cất hai lần và làm khan bằng Na2SO4 Cuối cùng, dịch chiết được cô cất bằng máy quay cất chân không ở 40°C, áp suất 25mmHg để thu được hỗn hợp lipit tổng.
4g) và được tính theo phần trăm so với khối lượng rong ban đầu (phương pháp chiết được lặp lại 3 lần lấy giá trị trung bình) [32]
H (%): hàm lượng lipit tổng có trong rong
M: khối lượng rong ban đầu đem chiết
m : khối lượng lipit tổng thu được
2.3.4 Xác định thành phần và hàm lượng các axit béo có trong dịch lipit tổng
Theo tiêu chuẩn ISO/FDIS 659:1998, các axit béo được metyl hóa và xác định thành phần cũng như hàm lượng thông qua phân tích trên máy sắc kí khí GC Thermo Finnigan Italia S.P.A TRACE GC Ultra series tại Phòng Hóa sinh hữu cơ, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên.
Thực nghiệm bắt đầu bằng cách hòa tan 10mg hỗn hợp Lipit tổng trong 1ml n-hexan trong lọ nhỏ nút kín, sau đó bổ sung 25ml dung dịch CH3ONa 30% và lắc kỹ trong 1 phút Tiếp theo, thêm 20mg Na2SO4 loại sạch, lắc kỹ và ly tâm ở 5000 vòng/phút trong 1 phút Dịch trong, sạch ở pha trên được tách riêng và kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng (TLC) Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 105715), RP18, F254s.
(Merck) Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254nm và 368nm hoặc
31 dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ từ cho đến khi hiện màu
Phân tích axit béo được thực hiện trên máy sắc ký khí GC với cột mao quản Supelco Wax 10 (30m x 0,25mm x 0,25µm) Chương trình nhiệt độ bắt đầu ở 200°C trong 10 phút, sau đó tăng từ 200°C đến 230°C trong 5 phút và giữ ở 230°C trong 10 phút, sử dụng khí mang là He Việc nhận dạng axit béo được thực hiện qua phần mềm chuyên dụng, với việc tính toán chuyển đổi giá trị thời gian lưu tương đương ECL cho cột mao quản chuyên dụng, sử dụng các axit béo chuẩn C16:0 và C18:0 Kết quả được tính theo công thức đã thiết lập.
2.3.5 Phương pháp thu nhận axit arachidonic từ loài rong câu chỉ vàng
Thu nhận axit arachidonic được tiến hành theo các bước sau:
Bước 1: Chiết lipit tổng số
Rong câu thu ở Cát Hải – Hải Phòng (1kg) được rửa sạch, cắt nhỏ và cho vào bình thủy tinh 5 lít, sau đó bổ sung 4 lít dung môi CHCl3/CH3OH theo tỷ lệ 1:2 (V/V) và ngâm chiết trong 48 giờ ở nhiệt độ phòng Sau khi rút toàn bộ dịch, bổ sung thêm 1,3 lít CHCl3 và tiếp tục ngâm trong 24 giờ Hai phân đoạn thu được được gom lại, rửa bằng nước hai lần và làm khan bằng Na2SO4 Cuối cùng, quay cất dung môi để thu được lipit tổng.
Bước 2: Thuỷ phân lipit tổng
Chúng tôi tiến hành thủy phân dầu rong câu chỉ vàng (lipit tổng) để thu được hỗn hợp axit béo tự do, tạo điều kiện cho việc làm giàu axit không no bằng cách tách các axit béo no và không no Quá trình thủy phân sử dụng NaOH và dung môi etanol, với các điều kiện phản ứng gồm thời gian 120 phút, nồng độ cồn 70% và nhiệt độ thích hợp.
75 0 C [3] Sơ đồ quy trình thủy phân được thực hiện như sau:
Sơ đồ 2.1: Quy trình thủy phân lipid tổng
Rửa loại axit vô cơ Nước cất
Cô quay loại dung môi n-hexan
Hỗn hợp axit béo tự do (2,62g)
Bước 3: Làm giàu AA bằng phương pháp tạo muối với LiOH
Hỗn hợp axit béo phản ứng với LiOH trong dung môi axeton, tạo ra muối axit béo Các muối của axit béo no sẽ kết tủa và được lọc, trong khi muối của axit béo không no sẽ tan trong dung môi, với độ tan tăng dần theo số nối đôi của gốc axit béo Qua khảo sát, chúng tôi đã xác định các điều kiện tối ưu cho phản ứng làm giàu axit béo không no (AA) bằng phương pháp tạo muối với LiOH, bao gồm thời gian phản ứng 60 phút, tỉ lệ LiOH/axit béo 2:1, và nhiệt độ phản ứng từ 35°C đến 40°C.
Hòa tan 10ml hỗn hợp axit béo tự do trong acetone và giữ ở 40°C Thêm 5ml dung dịch LiOH bão hòa (4N) cho đến khi đạt pH = 9, sau đó bổ sung 30ml dung dịch acetone và để nguội từ từ Làm lạnh hỗn hợp đến nhiệt độ phòng và giữ trong 1 giờ Lọc dịch acetone bằng giấy lọc, pha loãng phần dịch thu được với 250ml nước, axit hóa bằng HCl đến pH = 3, và chiết với ete dầu hỏa 4 lần x 50ml Loại nước bằng Na2SO4 và quay cất để thu được 1,14g axit béo không no (UFA).
Chúng tôi đã nghiên cứu và xây dựng quy trình này dựa trên phương pháp nấu agar truyền thống, hiện đang được áp dụng rộng rãi tại các cơ sở chế biến agar trong nước, đặc biệt là tại Công ty TNHH sản xuất và thương mại Hải Thành ở Hải Phòng.
Sơ đồ 2.2: Quy trình công nghệ nấu agar từ bã rong đã chiết lipit tổng
