Bài thuyết trình kỹ thuật gen: Cắt nối chọn lọc tiền mRNA của gen sterol 27-hydroxylase (CYP 27) gây ra bởi đột biến G thành A ở nucleotide cuối cùng của exon 6 trong bệnh nhân mắc bệnh cerebrotendinous xanthomatosis (CTX). Nhóm 6 _ Lớp 10-03 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công Nghệ Sinh Học Tìm hiểu về bệnh cerebrotendinous xanthomatosis (CTX)               ! "  #$ % & ! ' ( ) * + ,- ./ 0 & !  12 ' 3456)*&70$%.8$7($4) * 9:;14;'+ 7<37=>?&@6 5+ 7<37=4707'7'? AB(CD542 "1=2 E 5%7.F%G;.;+ Các biểu hiện khác của CTX bao gồm tiêu chảy mãn tính ở trẻ sơ sinh, làm đục ống kính của mắt (đục thủy tinh thể), phát triển chậm ở trẻ nhỏ, xương dần dần giòn dễ gãy, có các vấn đề về thần kinh ở tuổi trưởng thành, chẳng hạn như mất trí nhớ, co giật, ảo giác, trầm cảm, và khó khăn với các phản ứng phối hợp (mất điều hòa) và nói. Các triệu chứng thần kinh gây ra bởi sự tích tụ các chất béo và ngày càng tăng số lượng của xanthoma trong não. Xanthoma cũng có thể tích tụ trong dây thần kinh (myelin), làm gián đoạn các tín hiệu thần kinh trong não. Thoái hóa (teo cơ) của mô não gây ra bởi dư thừa tiền lipid cũng góp phần tăng các vấn đề về thần kinh. Xanthoma dây chằng (thường gặp nhất ở gân Achilles, gân kết nối gót chân của bàn chân cơ bắp chân) bắt đầu hình thành ở đầu tuổi trưởng thành. Xanthoma gân có thể gây khó chịu và can thiệp tới sự linh hoạt gân. CTX cũng tăng nguy cơ phát triển bệnh tim mạch, sớm xơ vữa động mạch. HD =   IJKL  " % %  +MIJKLN)OKLB$O7( D5PQ5?R?./  ; '+ SO  ! 7D 3% A  7.F T 9  Q4 ? " ( ) *+HD =   KLB   N 1N U A  < 7' 34 56 +V=QN$3%T$.;>.  9=@1$5+ WR12U4$.(U:4 2141X3;'+Y> 95 $ %$ 5 4 2 14 %  4 )  5  R A + Z;[\7D=%77.F470:IJKL+Z@= -7D=7]DA3 4OKLB+HD=3]=)7]^ :50 _`K3+"R$G? '57D==M^:50 _`K+ Gen sterol 27-hydroxylase (CYP27) Tóm tắt nghiên cứu ," R 4 70 7.F a 7D = M  ^  !  & b A  ` A    KLB IJ KL   % X   c7=>X&d,^A+ 4 7D = ! 50   Be M A 7@ & [f .; R 5g &bAD.;7&=5<"N .:A-7D=7=Q4?X&d,^ 7.F Q%7'h7=+445 97@"A> =M^!&bA`"IJKL c7=X&Ad,^$i_!jkQ  `$1 !D5b(. l !7@&[f5 &  4d,^7D=M^+,"R 7 =  3%   4N3m3"  A7D= ;'51n70>)./QG?X &d,^+ 43.; 343$1o<A "R H1o<7.Fb7'3%457' !47!3%T354"; : 1  .gp1& .F$ 7   5 ) ? A G+  " R $./  T 9  A  5 3 7' 3%   4 1= QN   + Kỹ thuật điện di [...]... định lượng III Phân tích trình tự gen Phân tích trình tự gen là kỹ thuật xác định trình tự theo cấu trúc bậc một của chuỗi các nucleotide trong một phân tử nucleic acid, xác đinh vị trí, sắp xếp các nucleotide trong phân tử DNA Trong những năm gần đây, một số phương pháp xác định trình tự mới nhờ sự hỗ trợ của máy tính_ Giải trình tự gen trên máy tự động Các bước thực tế Trình tự phân tích DNA được... cách phân tích định lượng của các tín hiệu II Kỹ thuật PCR đảo ngược RT-PCR (inverse PCR) Phản ứng RT-PCR là phản ứng khuếch đại một đoạn khuôn mẫu RNA theo nguyên lý của PCR Do trong tự nhiên một số virus có hệ gen là RNA nên muốn khuếch đại một đoạn gen của nó thì người ta phải dùng kỹ thuật RT-PCR Kỹ thuật chung Gồm 2 giai đoạn: −Phản ứng biến đổi RNA hệ gen thành sợi cDNA thứ nhất phải nhờ đến một... 27 hydroxylase được chèn vào vecter biểu hiện gen pTARGET ™ bởi vùng Eco RI Các trình tự nucleotide của cDNA bình thường và đột biến cDNA được xác nhận bởi phân tích trình tự Plasmid cho chuyển nhiễm đã được chuẩn bị bằng cách sử dụng JETSTAR plasmid Kit VI Kỹ thuật chuyển nhiễm Chuyển nhiễm là quá trình cố tình chuyển các axit nucleic vào các tế bào Thuật ngữ này được sử dụng đặc biệt là cho các... là phiên mã ngược (RT) Sau đó quá trình tổng hợp sợi cDNA thứ hai lại nhờ một enzyme khác là cDNA polymerase I −Khi đã có DNA sợi đôi từ khuôn mẫu RNA thì phản ứng tiếp theo sẽ là khuếch đại gen nhờ kỹ thuật PCR được thực hiện với ba mức nhiệt độ phù hợp ở mỗi chu kỳ, để nhân đoạn cDNA, tạo nên số lượng bản sao DNA cần thiết Quá trình khuếch đại cDNA mạch kép của gen sterol 27-hydroxylase • 1 µg RNA... hiện gen pTARGET ™ trong đó có chứa CMV ngay đầu khu vực enhancer / promoter, một intron khảm biểu hiện mức độ cao chèn, và các tín hiệu SV40 polyadenylation ở cuối Plasmid của các cấu trúc minigene bằng JETSTAR plasmid Kit Hai minigenes có cấu trúc tương tự, ngoại trừ đột biến G-A ở nucleotide cuối cùng của exon 6, có xác nhận bởi phân tích trình tự V Gây đột biến điểm định hướng (site-directed mutagenesis)... tế bào vật chủ Để biểu hiện các gen ngoại lai trong tế bào bắt đầu bằng việc gắn nó vào trong vector biểu hiện (thường là plasmid) Để quan sát kiểu nối khác nhau gây ra bởi sự đột biến G thành A ở nucleotide cuối cùng của exon 6, hai minigene cấu tạo, có và không có đột biến, đã được tạo ra và được chuyển nạp vào các tế bào COS Trình tự hệ gen từ exon 5 exon 9 của gen CYP27 từ bệnh nhân và một đối... 27hydroxylase Phân tích trình tự xác nhận vạch ở 726 bp quan sát trong minigen bình thường tương ứng với loại RNA có cách cắt nối chính xác Mặt khác, vạch đậm được quan sát thấy trong các minigen đột biến Xác định các mạch cDNA bất thường thiếu exon 5 và exon 6, và một vạch mờ được tạo ra bởi cắt nối chọn lọc tiền là minigen thiếu exon 6, vạch mờ còn lại mRNA do đột biến, minigen cấu trúc mất 1 đoạn... (tính ngược từ đầu 3’ gồm trình tự gen từ exon 5 đến exon 9 của exon) và sử dụng một mối nối chưa của gen CYP27, có hoặc không có đột rõ nào đó ở đầu 5’ (Hình A) biến, được chuyển nạp vào các tế bào COS RT-PCR phân tích của RNA tổng số được chiết xuất từ các tế bào chuyển nạp sử dụng mồi SPup và SPd, cho thấy một vạch duy nhất ở 726 bp ở minigen bình thường Trong khi ở minigen đột biến, có 1 vạch đậm... Template, và gia nhiệt đến 92ºC trong 2 phút cho biến tính • Sau đó, các mẫu đã được nạp vào một ABI PRISM™ 310 Genetical Analyzer để phân tích trình tự sử dụng các thuốc thử huỳnh quang Tất cả các mẫu được sắp xếp theo trình tự ở cả 2 đầu để xác nhận các đột biến đã được xác định Đoạn mồi sử dụng cho trình tự là: + FLup (nucleotide:20–40, 5’CCATGGCTGCGCTGGGCTGCG3’) + P357 (nucleotide 382–402, 5’GAGGGAAAGTACCCAGTACGG3’)... phân tử mới cho bệnh CTX và cung cấp thông tin về việc ghép nối sai của tiền mRNA trong gen đa exon Người thực hiện: Nhóm 5 Nguyễn Thị Vân Anh Nguyễn Thị Ngọc Anh Nguyễn Ngọc Minh Huế Xin cảm ơnĐặng Khánh Ly và lắng sự theo dõi Dương cả mọi người!!! nghe của tất Thị Ngọc Thuý Nguyễn Thuỷ Tiên Bùi Thị Trang Bài thuyết trình của chúng tôi đến đây là kết thúc!!! Made by Narcissus . Bài thuyết trình kỹ thuật gen: Cắt nối chọn lọc tiền mRNA của gen sterol 27-hydroxylase (CYP 27) gây ra bởi. bằng cách phân tích định lượng. III. Phân tích trình tự gen Phân tích trình tự gen là kỹ thuật xác định trình tự theo cấu trúc bậc một của chuỗi các nucleotide