Luận văn Công nghệ tổng hợp Lysine ii Mục lục Danh mục hình iv Danh mục bảng vi Danh mục đồ thị viii CHƯƠNG I : TỔNG QUAN 1 1. 1.Giới thiệu về lysine 1 1.1.1. Khái niệm 1 1.1.2. Cấu tạo 1 1.1.3. Vai trò và ứng dụng 2 1.1.4. Các dạng tồn tại của lysine 4 1.2. Các phương pháp thu nhận lysine 8 1.2.1. Phương pháp thủy phân 8 1.2.2. Phương pháp tổng hợp hóa học 9 1.2.3. Phương pháp lên men 9 1.2.4. Phương pháp kết hợp 9 1.3. Cơ chế sản xuất L-lysine từ tế bào vi sinh vật 11 1.3.1. Sơ đồ chuyển hóa 11 1.3.2. Thuyết minh các giai đoạn chuyển hóa 13 1.5. Tổng hợp lysine từ Corynebacterium glutamicum 19 1.5.1. Đặc điểm hình thái của Corynebacterium glutamicum 19 1.5.2. Bộ gen của Corynebacterium glutamicum 20 1.5.3. Lịch sử sử dụng Corynebacteria glutamicum 24 1.5.4. Sản xuất lysine theo quy mô công nghiệp 24 1.6. Cải tạo giống Corynebacterium glutamicum 25 1.6.1. Khái niệm 25 1.6.2. Một số phương pháp dùng để cải tạo giống Corynebacterium glutamicum 26 1.6.3 Các plasmid nội sinh của Corynebacteria glutamicum sử dụng trong việc thiết kế vector: 28 1.6.4. Việc biểu hiện gen ở Corynebacterium glutamicum 30 1.6.5. Phương pháp cải tạo giống Corynebacterium glutamicum để thu dư lysine từ aspertate 30 1.7. Cố định tế bào vi sinh vật 37 1.7.1. Định nghĩa cố định tế bào 37 1.7.2. Phương pháp cố định tế bào 38 1.7.3. Chất mang cố định tế bào vi sinh vật: 38 iii 1.7.4. Chỉ tiêu đánh giá hiệu quả cố định tế bào 39 1.8. Công nghệ lên men L-Lysine 39 1.8.1. Các vi khuẩn lên men L-lysine 39 1.8.2. Môi trường lên men 40 1.8.3. Các phương pháp lên men 44 1.8.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 46 1.8.5. Qui trình lên men 48 1.8.6. Thu nhận và tinh sạch sản phẩm 55 1.8.7. Phân tích chất lượng và số lượng L-lysine 57 CHƯƠNG 2: CÁC HƯỚNG NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN 58 2.1. Nghiên cứu về các đối tượng sản xuất lysine 58 2.1.1 Sử dụng dịch cỏ như một gradient trong sản xuất lysine 58 2.1.2 Đặc điểm con đường tổng hợp sinh học lysine trong Obligate Methylotroph Methylophilus methylotrophus 58 2.1.3. Các nghiên cứu về đối tượng sản xuất lysine là Corynebacterium glutamicum 59 2.2. Công nghệ lên men L-lysine 78 2.2.1. Nghiên cứu công nghệ sản xuất acid amin L-lysine 78 2.2.2. Khảo sát quá trình lên men bởi Corynebacterium glutamicum tự do và chế phẩm cố định để ứng dụng thu nhận L-lysine 85 2.2.3. Nghiên cứu quá trình lên men thu nhận L-lysine ở các chế độ lên men khác nhau 88 2.2.4. Nghiên cứu quá trình lên men liên tục L-lysine 90 2.2.5. Nghiên cứu tổng hợp lysine bằng tế bào cố định 96 CHƯƠNG 3: KẾT LUẬN 100 Tài liệu tham khảo 101 iv Danh mục hình Hình 1. 1 Hai dạng đồng phân quang học của lysine 2 Hình 1. 2 Cấu trúc không gian của L-lysine. 2 Hình 1. 3 Nhu cầu của lysine, threonine và methionine trong thức ăn heo con và thành phần của những amino acid này chứa sẵn trong thưc vật . 3 Hình 1. 4 Sản xuất lysine lên men (tấn/năm) trong suốt 3 thập kỉ qua . 4 Hình 1. 5 L-lysine sulphate . 4 Hình 1. 6 L-lysine HCl 5 Hình 1. 7 Sản phẩm thương mại L-lysine với B6 6 Hình 1. 8 Sản phẩm thương 6 Hình 1. 9 Sản phẩm thương 7 Hình 1. 10 Sản phẩm thương mại 7 Hình 1. 11 Sản phẩm thương mại Lysine-1000 90ct. 8 Hình 1. 12 Sản phẩm thương mại Lysine Powder 8 Hình 1. 13 Sơ đồ tổng quát chuyển hóa tứ glucose ra lysine và các amino acid khác Hình 1. 14 Con đường tổng hợp lysine từ glucose . 13 Hình 1. 15 Sự chuyển hóa tạo thành Oxaloacetate và Malate . 14 Hình 1. 16 Con đường tổng hợp lysine . 16 Hình 1. 17 Sơ đồ diều hòa dị lập thể 18 Hình 1. 18 Corynebacterium glutamicum . 20 Hình 1. 19 Hệ gen của Corynebacterium glutamicum. 23 Hình 1. 20 Bản đồ cắt giới hạn của các plasmid pHM1519 và pBL1 của Corynebacterium glutamicum 29 Hình 1. 21 Con đường tổng hợp phân nhánh của L-lysine trong giống Corynebacteria glutamicum hoang dại. . 32 Hình 1. 22 Cấu trúc của Aspartate kinase . 33 Hình 1. 23 Trình tự DNA của vùng promoter dapA . 36 Hình 1. 24 Sơ đồ các phương pháp cố định tế bào . 38 Hình 1. 25 Mô hình sản xuất các amino acid . 50 v Hình 1. 26 Mô hình lên men thu L-lysine . 51 Hình 2. 1 Cô lập gen ddh của C. glutamicum và cấu trúc của một plasmid tổ hợp C. glutamicum - E.coli . 68 Hình 2. 2 Nhuộm họat tính DDH sau polyacrylamide gel Electrophoresis . 69 Hình 2. 3 Sơ đồ vật lý, phân tích và đánh dấu trình tự của DNA 70 vi Danh mục bảng Bảng 1. 1 So sánh các phương pháp thu nhận lysine . 9 Bảng 1. 2 Đặc điểm hình thái của C. glutamicum 19 Bảng 1. 3 Thống kê lượng amino acid được sản xuất hiện nay. 24 Bảng 1. 4 Các plasmid nội sinh của Corynebacterium được sử dụng trong việc thiết kế vector . 28 Bảng 1. 5 Ảnh hưởng của số lượng bản sao dapA khác nhau trên tốc độ tăng trưởng, sự bài tiết L-lysine . 35 Bảng 2. 1 Các chủng vi khuẩn sản xuất acid L-glutamic hoang dại theo báo cáo như là chủng bố mẹ để sản xuất các amino acid và như là gen chủ cho nhân dòng . 60 Bảng 2. 2 Kết quả thu được từ sáu chủng đột biến ở điều kiện lên men thu 61 Bảng 2. 3 Hiệu quả của gen ddh trong C. glutamicum 70 Bảng 2. 4 Cách sử dụng codon của gen ddh . 71 Bảng 2. 5 Giống C. glutamicum dùng trong bài nghiên cứu này . 73 Bảng 2. 6 Vị trí chuỗi primer đặc biệt được sử dụng phổ biến để thay thế trong G. glutamicum bằng phương pháp PCR và chuỗi DNA tiếp theo sau . 73 Bảng 2. 7 Sản lượng và những đặc trưng của sự sản xuất lysine của 75 Bảng 2. 8 Sinh khối và các chất chuyển hóa của C. glutamicum ATCC 13032 lysCfbr 77 Bảng 2. 9 Nhu cầu đồng hóa của C. glutamicum ATCC 13032 lysCfbr PEFTUfbp 78 Bảng 2. 10 Khả năng lên men của chủng CM24 trên 4 loại môi trường. 79 Bảng 2. 11 Ảnh hưởng của pH lên sản lượng L-lysine qui mô 50 lít. 80 Bảng 2. 12 Ảnh hưởng của oxy hòa tan lên sản lượng L-lysine ở qui mô 50 lít. 81 Bảng 2. 13 Ảnh hưởng của oxy hòa tan lên sản lượng L-lysine ở qui mô 150 lít. 82 Bảng 2. 14 Ảnh hưởng của oxy hòa tan lên sản lượng L-lysine ở qui mô 1500 lít. 83 Bảng 2. 15 Hiệu suất thu hồi L-lysine. 83 Bảng 2. 16 Tỷ lệ rửa trôi tế bào sau tái sử dụng lên men chế phẩm tế bào cố định (%). 87 vii Bảng 2. 17 Sản lượng L-lysine thu được bằng các phương pháp lên men khác nhau. . 89 Bảng 2. 18 Ảnh hưởng của hàm lượng đường giới hạn lên năng suất và sản lượng L- lysine. 89 Bảng 2. 19 Năng suất và sản lượng L-Lysine trong lên men repeat fed batch và liên tục 89 Bảng 2. 20 Ảnh hưởng của nồng độ CaCl 2 lên sinh khối và nồng độ L-Lysine 97 Bảng 2. 21 Ảnh hưởng của lượng tế bào ban đầu và thời gian lên men lên sự tổng hợp 97 viii Danh mục đồ thị Đồ thị 2. 1 So sánh sản lượng L-lysine tạo bởi C. glutamicum từ sáu chủng đột biến trong môi trường lên men theo phương pháp Fed-batch . 62 Đồ thị 2. 2 Hoạt động invivo của fructose 1,6-biphosphatase trong các chủng C. glutamicum khác nhau 75 Đồ thị 2. 3 Ảnh hưởng của thời gian lên men lên sinh khối và sản lượng L-lysine ở qui mô 50 lít 79 Đồ thị 2. 4 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sản lượng L-lysine ở qui mô 50 lít. 80 Đồ thị 2. 5 Ảnh hưởng của thời gian lên men lên sinh khối và sản lượng L-lysine ở qui mô 150 lít. 81 Đồ thị 2. 6 Ảnh hưởng của thời gian lên men lên sinh khối và sản lượng 82 Đồ thị 2. 7 Sản lượng L-lysine của các lần tái sử dụng lên men bằng các chế phẩm 87 Đồ thị 2. 8 Thời gian nuôi cấy liên tục 91 Đồ thị 2. 9 Ảnh hưởng của tỉ lệ pha loãng lên các thông số trạng thái ổn định 92 Đồ thị 2. 10 Ảnh hưởng của tỉ lệ đường bổ sung lên năng suất 93 Đồ thị 2. 11 Ảnh hưởng của khuấy đảo lên các thông số trạng thái ổn định. 94 Đồ thị 2. 12 Ảnh hưởng của khí giàu oxy lên các thông số trạng thái ổn định. 95 Đồ thị 2. 13 Ảnh hưởng của lượng tế bào ban đầu lên sự tổng hợp L-lysine bằng các tế bào C.glutamicum cố định 98 Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu 1 CHƯƠNG I : TỔNG QUAN 1. 1.Giới thiệu về lysine: 1.1.1. Khái niệm: Lysine là một α-amino acid thiết yếu con người không thể tổng hợp được. Lysine chứa hai nhóm (-NH 2 ) và một nhóm (-COOH). Trong cấu tạo phân tử lysine có một carbon bất đối xứng nên chúng có hai dạng đồng phân quang học: D-lysine và L-lysine. Hai đồng phân quang học này có tính chất hóa lý giống nhau, chỉ khác nhau khả năng làm quay mặt phẳng phân cực ánh sáng, một sang phải và một sang trái làm tính chất sinh học của chúng hoàn toàn khác và cơ thể sinh vật sống chỉ hấp thu được lysine dạng L. Lysine tồn tại dạng rắn và tinh thể trong điều kiện bình thường, bị phân hủy ở nhiệt độ 200-300°C, có màu tím xanh khi tương tác với ninhydrin [38]. Lysine là một trong 9 amino acid không thay thế trong tổng số 20 amino acid, tìm thấy trong cấu trúc của những phân tử protein tự nhiên của tất cả sinh vật sống và được tổng hợp từ vi sinh vật. Lysine thuộc họ aspartate, được tổng hợp qua con đường phân nhánh. Lysine là acid amin rất cần thiết cho hoạt động sống của người và động vật. Nhu cầu lysine trên thế giới năm 2006 là 950,000-1000,000 tấn. 1.1.2. Cấu tạo: Công thức phân tử: C 6 H 14 N 2 O 2 , khối lượng phân tử 146,188 g/mol, điểm đẳng điện pH = 9.59, Codon của lysine là AAA và AAG. [38] Công thức cấu tạo: NH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH(NH 2 )-COOH Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu 2 Hình 1. 1 Hai dạng đồng phân quang học của lysine [38]. Hình 1. 2 Cấu trúc không gian của L-lysine [38]. Tên gọi: Lysine còn có tên gọi khác là axit α-e-diaminocaproic và 2,6- diaminohexanoic acid. 1.1.3. Vai trò và ứng dụng: Lysine giữ vai trò sống còn trong tổng hợp protein, là chìa khóa trong sản xuất enzyme, hoocmon và các kháng thể giúp cơ thể tăng cường sức đề kháng, chống bệnh tật đặc biệt ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh mụn gộp môi hay mụn gộp sinh dục. Cơ thể người và động vật thiếu lysine cơ thể sẽ không hoạt động bình thường, đặc biệt ở động vật còn non và trẻ em sẽ xảy ra hiện tượng chậm lớn, trí tuệ phát triển kém. Chính vì thế lysine thường được đưa vào phần ăn của trẻ và của gia súc. L-lysine là một amino acid cần thiết và đòi hỏi phải luôn có sẵn trong thức ăn để đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng của động vật, đặc biệt đối với thức ăn từ ngũ cốc, lúa mì hoặc lúa mạch thì nghèo lysine. Do đó bổ sung nguồn giàu lysine vào là D - l ysine L - L l ysine [...]... carboxykinase 15 Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu Giai đọan tổng hợp lysine từ aspartate: Hình 1 16 Con đường tổng hợp lysine [34] Trong cơ chế sinh tổng hợp lysine của vi khuẩn thì lysine được tổng hợp cùng lúc với methionie, threonine, isoleunine và đều thuộc họ aspartate có chất 16 Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu chung là Aspartate-β- semialdehyde Điều khiển quá trình tổng hợp lysine ở tế bào vi khuẩn... lysine, sau đó sử dụng vi sinh vật để chuyển hóa những chất này thành lysine 1.3 Cơ chế sản xuất L -lysine từ tế bào vi sinh vật: 1.3.1 Sơ đồ chuyển hóa: Điểm quan trọng trong cơ chế tổng hợp lysine của vi khuẩn là lysine được tổng hợp cùng với methionine, threonine và đều xuất phát từ một chất chung đó là Aspactat - β - semialdehyde Quá trình tổng hợp xảy ra theo sơ đồ tổng quát sau: 11 Chương 1: Tổng. .. - Phản ứng nhanh - Cho ra raxemic pháp hóa tổng hợp nên lysine - Dễ thực hiện (hỗn hợpL -lysine - Sản phẩm ít tạp chất và D -lysine) _tốn học kém khi tách - Giá thành cao Phương Nhờ khả năng tổng - Thu lysine dạng L - Thời gian lên men pháp hợp thừa của một số - Nguyên liệu sản xuất dài lên men vi sinh vật, nuôi cấy rẻ tiền, dễ kiếm - Điều khiển phản thu nhận lysine - Năng suất cao do phản ứng khó, và... bổ sung lysine cho động vật dưới dạng thức ăn như cho lysine vào sữa Ở người lysine được bổ sung vào thuốc dạng viên và thuốc uống 1.1.4 Các dạng tồn tại của lysine:  L -lysine Sulphate Hình 1 5 L -lysine sulphate [18] Thành phần: Lysine Sulphate là muối sulphate với lysine L -lysine : 51% min, trung bình là 65% Sulphate : 15% max 4 Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu Các acid amin : 10% min Độ ẩm : 3% max... thương mại Lisine Power [40] 6 Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu  Lysine capsures [40] Hình 1 9 Sản phẩm thương mại Lysine Capsures Thành phần của sản phẩm này là L -lysine HCl [40]  Lysine Vit- B12 Granules [40] Hình 1 10 Sản phẩm thương mại Lysine Vit – B12 Granules [40] Thành phần: 300mg lysine, 15mg vitamin B12 Granule có hương vị ngọt  Lysine- 1000 90ct [40] Lysine đóng vai trò quan trọng cho sự... aspartate Aspartate là cơ chất cung cấp toàn bộ nguồn cacbon cho lysine Do đó, để tổng hợp nhiều lysine thì nguồn aspartat phải đủ và ổn định Vì vậy, một trong những hướng để cải tạo giống sản xuất nhiều lysine là ta có thể điều khiển quá trình tổng hợp oxaloacetate theo các cơ chế như đã trình bày phía trên Giai đoạn 2: Quá trình sinh tổng hợp lysine từ aspartate: Từ aspartate qua các phản ứng tạo ra Aspartate-β-... đường chuyển hoá tạo sản phẩm lysine ta có thể điều khiển enzyme diamino pimelatedehydrogenase để từ piperideine-2,6dicarboxylate tạo ra diaminopimelate Bên cạnh đó ta có thể điều khiển hoạt động của enzyme permease để kiểm soát lượng lysine tiết ra ngoài (Hình 1.16) 17 Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu 1.4 Điểu kiện tổng hợp dư L -lysine: Sơ đồ điều hòa dị lập thể tổng hợp lysine: Hình 1 17 Sơ đồ diều... 5 Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu 1.1.5 Các sản phẩm lysine thương mại:  L -lysine với B6 [37] Hình 1 7 Sản phẩm thương mại L -lysine với B6 [37] Thành phần: L -lysine, vitamin B6 (Pyridoxine hydrochloride), Mg, Si, men, gluten, muối, đường và các sản phẩm sữa Mỗi Capsule sẽ cung cấp: L -lysine 500mg, Vitamin B6 6mg Giá thành: 380000 VND  Lysine power [40] Thành phần của sản pham này là L -lysine HCl... Arsen : 0,0002% max Lysine Sulphate có thể được bổ sung vào L -lysine HCl làm thức ăn cho vật nuôi, chúng có hiệu quả như L -lysine HCl  L -lysine HCl (L -Lysine monohydrochoride) [18] Xuất xứ : Trung Quốc Hình thức : Màu nâu sáng Hình 1 6 L -lysine HCl [18] Thành phần : ≥ 98.5% Ẩm : £1% Amonium (NH4) : 0.04% Kim loại nặng : £ 0.003% pH (1 :10 nước) : 5 - 6.09 Hình 2.5: L -lysine HCl L -lysine HCL 98.5% (Feed... cholesterol Lysine xuất hiện để giúp cơ thể hấp thụ và chuyển hóa canxi, nó đóng một vai trò quan trọng trong việc hình thành collagen, một chất quan trọng cho xương và mô liên kết bao gồm da, gân và sụn 7 Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu Hình 1 11 Sản phẩm thương mại Lysine- 1000 90ct [40]  Lysine Powder [40] Hình 1 12 Sản phẩm thương mại Lysine Powder [40] Thành phần L -Lysine 1.2 Các phương pháp thu nhận lysine: [2] . Công nghệ tổng hợp Lysine ii Mục lục Danh mục hình iv Danh mục bảng vi Danh mục đồ thị viii CHƯƠNG I : TỔNG QUAN 1 1. 1.Giới thiệu về lysine. tượng sản xuất lysine là Corynebacterium glutamicum 59 2.2. Công nghệ lên men L -lysine 78 2.2.1. Nghiên cứu công nghệ sản xuất acid amin L -lysine 78 2.2.2.