Nghiên cứu sản xuất nước giải khát lên men từ trái dâu tằm

Ở Việt Nam hiện nay, nhu cầu về nước giải khát đang ngày càng tăng lên, một phần là do thời tiết đang có phần nóng lên, một phần nữa là do đời sống con người đang dần được cải thiện. Để có thể làm phong phú thêm chủng loại và góp phần tạo ra một loại nước giải khát có hàm lượng dinh dưỡng cao, được sự đồng ý của Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, sự giúp đỡ của cán bộ trong Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường cùng với sự hướng dẫn tận tình của ThS. Trương Phước Thiên Hoàng, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu sản xuất nước giải khát lên men từ trái dâu tằm”.

MỞ ĐẦU

Đặt vấn đề

Dâu tằm, với tên khoa học là Morus nigra L., đã được y học cổ truyền sử dụng để chữa trị hen suyễn và viêm phế quản nhờ vào các bộ phận như lá, vỏ rễ và quả Các thành phần của cây dâu tằm chứa nhiều hợp chất dinh dưỡng có lợi cho sức khỏe, bao gồm các acid amin thiết yếu, vitamin A, thiamine, riboflavin và nhiều vi chất khác.

Quả dâu tằm chứa hàm lượng vitamin cao, mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe con người Tuy nhiên, tại Việt Nam, dâu tằm chủ yếu được tiêu thụ dưới dạng trái cây tươi, và chỉ một phần nhỏ được sử dụng để sản xuất siro, thính, và nước ép Việc chưa khai thác triệt để các lợi ích của dâu tằm là một thiếu sót cần được khắc phục.

Ngành sản xuất nước giải khát đang phát triển nhanh chóng với sự đa dạng về chủng loại và số lượng Thế kỷ XXI được đánh giá là thời đại của các sản phẩm nước giải khát dinh dưỡng như nước ép trái cây và nước giải khát lên men, loại nước uống tự nhiên với độ cồn thấp và hàm lượng dinh dưỡng cao, phù hợp với nhiều lứa tuổi Tại Việt Nam, nhu cầu về nước giải khát ngày càng tăng do thời tiết nóng lên và đời sống người dân cải thiện Để phong phú thêm chủng loại nước giải khát dinh dưỡng, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu sản xuất nước giải khát lên men từ trái dâu tằm” với sự hỗ trợ của Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường, cùng sự hướng dẫn tận tình của ThS Trương Phước Thiên Hoàng.

Yêu cầu đề tài

Nghiên cứu đã phân lập thành công chủng nấm men từ trái dâu tằm, đồng thời đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố như tỉ lệ giống, nồng độ chất khô ban đầu, pH ban đầu và nhiệt độ trong quá trình lên men nước dâu tằm.

Xây dựng được quy trình sản xuất thử nghiệm nước giải khát lên men dâu tằm.

Nội dung đề tài

Phân lập chủng nấm men trong quả dâu tằm trên môi trường Hansen.

Nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ giống đến quá trình lên men nước dâu tằm.

Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất khô ban đầu đến quá trình lên men nước dâu tằm.

Nghiên cứu ảnh hưởng của pH ban đầu đến quá trình lên men nước dâu tằm.

Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men nước dâu tằm.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Tổng quan về dâu tằm

2.1.1 Giới thiệu về cây dâu tằm

Cây dâu tằm, hay còn gọi là mulberry, có nhiều giống khác nhau, bao gồm Dâu tằm trắng (Morus alba L.), Dâu tằm đen (M nigra L.), Dâu tằm Mỹ và Dâu tằm đỏ (M rubra L.) Ngoài ra, chúng còn có họ hàng gần với giống Dâu tằm Hàn Quốc (Morus australis) và Dâu tằm Himalaya (M laevigata).

Morus alba L có nguồn gốc từ miền đông và miền trung Trung Quốc, được du nhập sang châu Âu từ nhiều thế kỷ trước và đưa sang châu Mỹ trong thời kỳ thực dân nhằm phát triển nghề nuôi tằm Loài cây này đã tự nhiên phát triển và lai giống với Morus rubra L có sẵn ở các nước thuộc địa Morus rubra L có nguồn gốc từ miền đông nước Mỹ, trong khi Morus nigra L có nguồn gốc từ châu Á và đã được trồng để lấy quả ở châu Âu từ trước thời La Mã cổ đại.

Hình 2.1 Quả dâu tằm đen (Morus nigra L.)

 Khả năng thích nghi

Morus alba L là giống cây dâu có khả năng chịu đựng tốt trong điều kiện khô hạn, ô nhiễm và đất bạc màu, trong khi Morus rubra L cũng có khả năng tương tự nhưng phát triển chậm hơn trong điều kiện khí hậu lạnh và nóng ẩm Ngược lại, Morus nigra L cần môi trường thuận lợi để phát triển tốt và là một trong những giống cây dâu chịu lạnh kém nhất Morus alba L được công nhận là giống cây chịu lạnh tốt nhất trong các loại dâu thông dụng hiện nay.

 Quá trình sinh trưởng và phát triển cây

Cây dâu tằm (Morus alba L.) là loại cây rụng lá theo mùa, có thể cao tới 80 feet và thường phát triển theo hình chóp hoặc dạng tán Cây này phát triển tốt trong điều kiện đất đai màu mỡ, mang lại giá trị kinh tế và sinh thái cao.

Morus alba L có chiều cao lên tới 70 feet, trong khi Morus nigra L là giống thấp nhất trong ba loại dâu tằm, chỉ cao khoảng 30 feet và thường phát triển theo dạng bụi nếu không được chăm sóc từ nhỏ Tuổi thọ của các loại dâu tằm rất khác nhau; Morus rubra L có thể sống hơn 75 năm, trong khi Morus alba L và Morus nigra L có thể sống trên 100 năm.

Morus alba L., hay còn gọi là dâu trắng, được đặt tên không chỉ vì chồi nụ màu trắng mà còn do màu sắc của quả Lá của cây có độ dày mỏng và màu xanh sáng khác nhau tùy thuộc vào vị trí trên cây Trong khi đó, Morus rubra L có lá lớn và dày hơn, với bề mặt lá nhám và lông tơ ở mặt dưới Morus nigra L có lá tương tự nhưng nhỏ hơn, cành non cứng cáp hơn và chồi lớn hơn Các loài dâu có thời gian rụng lá nhất định trong năm, với Morus alba L thường rụng lá vào đầu mùa xuân, trong khi Morus nigra L thường rụng lá muộn hơn khoảng hai tháng.

Dâu tằm là cây đơn tính và lưỡng tính, có khả năng thụ phấn với những cây lân cận Hoa của chúng nhỏ và thường khó nhận biết, thường xuất hiện từ nách lá của những nhánh non đang phát triển và trên phần chồi non của nhánh già Dâu tằm thụ phấn chủ yếu nhờ gió và các phương pháp tự nhiên, cho phép chúng hình thành quả mà không cần sự giao phấn Tại California, dâu tằm vẫn có thể ra quả mà không cần thụ phấn.

Dâu tằm có quả không giống hoàn toàn với quả mâm xôi, mà chỉ là một tập hợp quả bề ngoài tương tự Sau khi hoa được thụ phấn, quả bắt đầu phình to và thay đổi hoàn toàn về cấu trúc, màu sắc, trở nên mọng nước và béo Màu sắc của quả không đồng nhất với giống dâu, chẳng hạn như Morus alba L có thể cho quả màu trắng, xanh nhạt, hơi phai màu đỏ hoặc đen Thường thì, Morus alba L cho quả ngọt nhưng thiếu vị chua cần thiết Trong khi đó, Morus rubra L cho quả màu đỏ thẫm gần như đen, với hương vị ngang bằng với giống dâu.

Morus nigra L., hay còn gọi là dâu tằm đen, nổi bật với quả lớn, nhiều nước và hương vị hài hòa giữa vị ngọt và chua Loại quả này được xem là thơm ngon nhất trong các loại dâu tằm.

2.1.3 Thành phần hoá học và ứng dụng

Thành phần hóa học của quả dâu tằm phụ thuộc vào nhiều yếu tố như giống và điều kiện trồng trọt Dưới đây là thành phần trung bình của quả dâu tằm trong điều kiện trồng trọt bình thường.

Bảng 2.1 Thành phần hoá học của quả dâu (trong 100g)

Nước Protein Chất béo Carbonhydrat Xơ

Trong quả dâu tằm còn chứa một lượng vitamin tương đối lớn, thành phần vitamin của dâu như sau:

Bảng 2.2 Thành phần vitamin trong quả dâu (trong 100g)

Vitamin A Thiamin Riboflavin Vitamin B6 Vitamin C

25 UI 0,029 mg 0,101 mg 0,050 mg 36,4 mg

Quả dâu tằm không chỉ chứa nhiều thành phần vi lượng mà còn được ứng dụng trong y học Theo Hartwell, quả dâu tằm có thể được sử dụng để chữa trị nhiều bệnh lý như ung bướu, hen suyễn và viêm phế quản (trích dẫn bởi Lê Văn Nhất Hoài, 2004).

Tổng quan về nấm men

2.2.1 Đặc điểm chung của nấm men

Nấm men là nhóm nấm có cấu tạo đơn bào, sống riêng lẻ hoặc thành từng đám, không di động và chủ yếu sinh sản vô tính bằng hình thức nảy chồi.

Chúng phân bố rộng rãi trong thiên nhiên như trong đất, nước, lương thực thực phẩm…, đặc biệt có nhiều trong các loại hoa quả chín, ngọt.

Hình dạng và kích thước nấm men thay đổi tùy theo loài, giống, điều kiện dinh dưỡng và một số yếu tố khác.

Nấm men thường có nhiều hình dạng khác nhau, bao gồm hình trứng và hình bầu dục như Saccharomyces cerevisiae và Saccharomyces ellipsoideus, hình tròn như Candida utilis, hình ống dài như Pichia, và hình quả dưa chuột.

(Saccharomyces pastorianus), hình một đầu nhọn (Brettanomyces), hình tam giác (Trigonopsis) và một số hình dạng đặc biệt khác.

Một số nấm men có tế bào hình dài, nối tiếp nhau thành dạng sợi gọi là khuẩn ty (mycelium) hoặc khuẩn ty giả (pseudomycelium) Trong khuẩn ty giả, các tế bào không nối liền nhau chặt chẽ như ở khuẩn ty Khuẩn ty và khuẩn ty giả thường được quan sát ở các giống như Endomycopsis, Candida, Trichosporon, và nhiều loài nấm chỉ sinh khuẩn ty giả khi không được cung cấp đủ oxy.

Hình dạng của nấm men không ổn định và phụ thuộc vào tuổi giống cũng như điều kiện ngoại cảnh Chẳng hạn, Saccharomyces thường có hình bầu dục trong môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng Trong điều kiện yếm khí, nấm men có hình tròn, trong khi trong điều kiện hiếu khí, tế bào có hình dạng dài hơn.

Kích thước tế bào nấm men thay đổi tùy thuộc vào giống, loài và giai đoạn phát triển, với kích thước trung bình từ 3 – 5 µm, trong khi nấm men bia có kích thước từ 6 – 8 µm và nấm men gia súc thường nhỏ hơn Để quan sát hình thái và đo kích thước tế bào nấm men, người ta thường sử dụng môi trường mạch nha dịch thể với nồng độ đường khoảng 10 – 15 °B hoặc trong môi trường thạch mạch nha, với thời gian nuôi cấy từ 3 ngày ở nhiệt độ 25 – 30 °C.

Nấm men là sinh vật có nhân thật, với cấu trúc tế bào bao gồm màng tế bào, nguyên sinh chất, nhân, ty thể, ribosome và không bào Ngoài ra, nấm men còn chứa một số thể vùi như glycogen, lipid và volutin.

2.2.2 Vai trò của nấm men

Nấm men có khả năng sinh sản nhanh chóng và tạo ra khối lượng lớn, giàu protein, lipid và vitamin, đặc biệt là vitamin B Chúng có khả năng lên men các loại đường để sản xuất rượu trong điều kiện yếm khí, trong khi trong điều kiện hiếu khí, nấm men có thể tăng nhanh lượng sinh khối tế bào.

Hầu hết các giống nấm men trong quá trình trao đổi chất không sản sinh ra chất độc hại cho sức khỏe con người và vật nuôi, do đó chúng được ứng dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp chế biến thực phẩm Chúng được sử dụng trong sản xuất rượu, bia, nước giải khát có cồn, làm men bánh mì, cũng như chế biến các sản phẩm sữa lên men như kefir và johur, bên cạnh việc sản xuất thức ăn cho gia súc.

Nấm men, đặc biệt là loài S cerevisiae, được sử dụng rộng rãi trong sản xuất protein đơn bào, vitamin và enzyme Loài nấm men này còn là công cụ quan trọng trong việc mang DNA tái tổ hợp, phục vụ cho việc phát triển các sản phẩm thế hệ mới trong ngành công nghệ sinh học hiện đại.

Một số loại nấm men như Candida albicans và Cryptococcus neoformans có thể gây bệnh cho con người và gia súc, trong khi các loại nấm như Endomycopsis fibuligera và Saccharomyces bisporus có thể gây hư hỏng thực phẩm.

2.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nấm men

Nấm men là vi sinh vật hiếu khí tùy nghi, có khả năng hô hấp như một cơ thể hiếu khí bậc cao Khi môi trường thiếu oxy, chúng chuyển sang hô hấp kỵ khí, được gọi là quá trình lên men Trong giai đoạn này, tốc độ sinh sản của tế bào nấm men bị kiềm hãm và đến một thời điểm nhất định gần như dừng lại Về cơ chế sinh học, quá trình này sử dụng không hết năng lượng từ các chất dinh dưỡng trong môi trường, vì quá trình phân hủy một phân tử glucose qua lên men chỉ giải phóng khoảng

Quá trình lên men của đường chỉ tạo ra 28 kcal, trong khi nếu oxy hóa hoàn toàn 1 gam đường, sẽ sinh ra 674 kcal Quá trình này được gọi là phosphoryl hóa, trong đó các hợp chất như ATP và ADP tham gia tích cực.

Nấm men hấp thụ thức ăn qua con đường chọn lọc trên bề mặt tế bào và khuếch tán vào bên trong Màng và lớp bao bọc nguyên sinh chất của tế bào hoạt động như màng bán thấm, điều hòa các chất dinh dưỡng vào tế bào và thải các sản phẩm trao đổi chất ra ngoài Sau khi được hấp thụ, các chất dinh dưỡng sẽ tham gia vào các phản ứng hóa học để chuyển hóa thành các hợp chất như protein, glucid và lipid.

2.2.4 Đặc điểm chung của S cerevisiae Đươc Meyen mô tả vào năm 1938, tế bào có dạng hình trứng, bầu dục…, kích thước trung bình 3 – 6 * 8 –12 àm, sinh sản bằng hình thức nảy chụ̀i khụng theo quy luọ̃t, có thể xuất hiện từng cái một, từng đôi hoặc một chuỗi.

Khuẩn lạc có màu trắng nhạt, rìa tròn, lồi lên, bề mặt sáng lấp lánh, đường kính 1 –

2 mm vào ngày thứ ba.

Phát triển tối ưu ở 33 – 35 0 C trong môi trường chứa 10 – 30 % glucose Nhiệt độ tối thiểu là 4 0 C trong 10 % glucose và 13 0 C trong 50 % glucose, nhiệt độ tối đa là 38 –

39 0 C (Jermini and Schmidt – Lorenz, 1987, trích từ Vương Thị Hồng Vy, 2007).

Có khả năng phát triển ở pH = 1,6 trong HCl; pH = 1,7 trong H3PO4 và pH = 1,8 –

Acid benzoic và acid sorbic là hai loại acid hữu cơ có sức chịu đựng lớn nhất, với nồng độ tương ứng là 100mg/kg ở pH 2,5 – 4 và 200mg/kg ở pH 4 (Juven et al, 1978, trích từ Vương Thị Hồng Vy, 2007).

Công nghệ lên men

2.3.1 Tổng quan về quá trình lên men

Lên men là quá trình trao đổi chất dưới tác dụng của enzyme, dẫn đến sự hình thành các sản phẩm khác nhau Tùy thuộc vào sản phẩm tích tụ sau quá trình lên men, có nhiều kiểu lên men khác nhau Hai hình thức lên men chính là lên men yếm khí và lên men hiếu khí.

Lên men sản xuất nước giải khát là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấm men.

Tác nhân chính của quá trình lên men nước giải khát là các chủng nấm men

Saccharomyces Dựa vào đặc tính của quá trình lên men mà nấm men được chia thành hai dạng chính:

Nấm men nổi: gây ra sự lên men nổi, lên men ở nhiệt độ cao 20 – 28 0 C Quá trình lên men nhanh, tạo nhiều bọt.

Nấm men chìm: quá trình lên men chậm ở nhiệt độ 5 – 10 0 C, CO2 thoát ra ít trong quá trình lên men, nấm men nằm ở đáy thùng lên men.

2.3.1.2 Cơ chế của quá trình lên men

Để lên men ethanol thành acetaldehyde, người ta cần bổ sung một lượng nấm men nhất định vào môi trường Lượng nấm men sử dụng có thể khác nhau tùy theo phương pháp Với diện tích tế bào lớn, nấm men có khả năng hấp thụ chất dinh dưỡng rất hiệu quả Đường và các chất dinh dưỡng trong môi trường lên men sẽ được hấp thụ trên bề mặt nấm men, sau đó khuếch tán vào trong tế bào Quá trình lên men dẫn đến sự hình thành rượu và CO2 theo phương trình tổng quát.

CH3COCOOH CH3CHO + CO2

CH3CH=O + NAD-H + + H + CH3CH2OH + NAD

Quá trình lên men chuyển đường thành rượu là một chuỗi phản ứng oxy hóa khử có sự tham gia của enzyme nội bào Rượu etylic khuếch tán qua màng tế bào nấm men, hòa tan mạnh trong nước, trong khi CO2 cũng hòa tan nhưng với mức độ thấp hơn Khi CO2 sinh ra trong quá trình lên men, nó khuếch tán vào môi trường và nhanh chóng đạt trạng thái bão hòa, tạo thành bọt khí bám vào tế bào nấm men Khi bọt khí lớn lên, tế bào nấm men nổi lên bề mặt do chênh lệch khối lượng riêng, và khi đến bề mặt, các túi khí vỡ ra, thải CO2 ra ngoài Tế bào nấm men lại chìm xuống, tạo điều kiện cho quá trình lên men diễn ra liên tục, giúp tăng cường sự tiếp xúc giữa nấm men và môi trường, rút ngắn thời gian lên men Mặc dù CO2 có thể ức chế quá trình lên men, nhưng khi thải khí, khả năng lên men của nấm men lại được cải thiện.

Lên men ethanol được chia làm hai thời kỳ:

Trong thời kỳ cảm ứng, lượng acetaldehyde sản sinh ra còn thấp, dẫn đến việc hydro từ NADH2 được chuyển đến glyceraldehyde-3-phosphate để tạo thành glycerin-3-phosphate Sau đó, glycerin-3-phosphate sẽ mất gốc phosphate và chuyển đổi thành glycerin.

Khi acetaldehyde đã đạt được một lượng nào đó, chất tiếp nhận hydro lúc này là acetaldehyde và acetaldehyde bị khử thành rượu ethylic

2.3.2 Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men

Mỗi loài sinh vật đều có nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển, và đối với nấm men Saccharomyces, nhiệt độ lý tưởng nằm trong khoảng 28 – 32°C Khi nhiệt độ tăng cao, hoạt tính của nấm men giảm nhanh, đồng thời dễ bị nhiễm lactic và nấm men hoang dã Ở nhiệt độ 30°C, men hoang dã phát triển nhanh hơn Saccharomyces từ 2-3 lần, trong khi ở nhiệt độ 35 – 38°C, tốc độ phát triển này có thể tăng gấp 6 – 8 lần Ngoài ra, quá trình lên men ở nhiệt độ cao còn dẫn đến việc sản sinh nhiều este, aldehyd và làm thất thoát rượu do sự gia tăng CO2.

Nhiệt độ lên men cao nhất là 39 o C và thấp nhất là 4 – 6 o C.

Nồng độ H+ trong môi trường ảnh hưởng lớn đến hoạt động của nấm men, vì mỗi vi sinh vật chỉ phát triển tốt trong những trạng thái ion nhất định, phụ thuộc vào pH của môi trường pH tối ưu cho quá trình lên men của nấm men không cố định mà thay đổi theo nhiều yếu tố như loài, chủng nấm men, thành phần của môi trường lên men và các điều kiện lên men khác.

pH tối ưu cho quá trình lên men thường nằm trong khoảng từ 3,5 đến 6 Môi trường pH không chỉ ảnh hưởng đến quá trình lên men mà còn tác động đến hoạt động của các enzyme được hình thành trong nấm men Nghiên cứu của Haldane chỉ ra rằng 96 enzyme có pH tối ưu từ 4 đến 8, trong khi đó, ở pH dưới 4, hoạt tính của các enzyme này sẽ giảm dần.

Trong quá trình lên men rượu, một số acid sẽ được hình thành thêm, dẫn đến sự hạ thấp pH xuống.

2.3.2.3 Nồng độ đường

Các loại dịch quả và dịch đường hóa tạo ra áp suất thẩm thấu, và áp suất này tăng lên khi nồng độ đường trong môi trường gia tăng Nấm men cần duy trì sự cân bằng giữa áp suất thẩm thấu của môi trường và áp suất nội tế bào Nếu không, nấm men sẽ bị co nguyên sinh.

Các loại nấm men khác nhau có khả năng chịu đựng áp suất thẩm thấu khác nhau Nấm men nổi, như giống Zygosaccharomyces, đặc biệt có khả năng phát triển trong môi trường có hàm lượng đường cao, từ 50% đến 80%, cho thấy sức chịu đựng vượt trội so với các loại nấm men khác.

2.3.2.4 Nồng độ cồn ethylic

Cồn ethylic là sản phẩm chính được tạo ra từ quá trình lên men rượu từ đường, nhưng nó có khả năng ức chế hoạt động của nấm men Nồng độ rượu 1,5% đã phần nào ức chế sự sinh sản và phát triển của nấm men, trong khi ở nồng độ 5%, sự sinh sản bắt đầu ngừng trệ Khi nồng độ rượu tăng lên 7-8%, quá trình lên men giảm mạnh và bước vào giai đoạn lên men yếu Hầu hết các loại nấm men trong điều kiện tối ưu có thể chịu được nồng độ cồn khoảng 14-16%.

2.3.2.5 Ảnh hưởng của đạm muối trong dịch lên men

– Đạm Để nấm men phát triển nhanh và cường độ lên men mạnh thì đòi hỏi phải đủ đạm trong dịch lên men.

Trong quá trình sản xuất, nước quả thường chứa đủ đạm để đáp ứng nhu cầu của nấm men Tuy nhiên, trong những năm gặp điều kiện không thuận lợi như sâu bệnh hay hạn hán, tỷ lệ đạm có thể thấp, do đó cần bổ sung thêm Đối với nấm men Saccharomyces, muối amon là lựa chọn phù hợp vì chúng có khả năng đồng hóa các muối này Từ muối amon, nấm men có thể tổng hợp tất cả các acid amin và protein cần thiết Nếu bổ sung thêm acid amin, đặc biệt là dưới dạng hỗn hợp, sẽ có tác dụng kích thích rõ rệt.

Muối khoáng là yếu tố cần thiết cho nấm men để hình thành các tổ chức của chúng và đóng vai trò quan trọng trong việc sản xuất enzyme, giúp kích thích các phản ứng sinh hóa trong quá trình lên men rượu.

Khi bổ sung P2O5, K2O và MgO trong quá trình lên men, sự lên men sẽ được kích thích Các nguồn cung cấp K và P có thể sử dụng bao gồm K2HPO4, KH2PO4, (NH4)2HPO4, NH4H2PO4 và K2SO4 Đối với Mg và lưu huỳnh, MgSO4 là nguồn bổ sung hiệu quả, trong khi FeCl3 và FeSO4 được sử dụng làm nguồn cung cấp sắt.

Oxy đóng vai trò quan trọng trong giai đoạn đầu của quá trình lên men, khi nấm men thực hiện hô hấp hiếu khí để tăng cường sinh khối.

Khi chuyển sang giai đoạn lên men, oxy trở thành yếu tố bất lợi Để quá trình lên men diễn ra hiệu quả, cần phải yếm khí hoàn toàn, điều này ngăn cản sự phát triển của các vi sinh vật cần oxy như vi khuẩn lactic và nấm men hoang dã.

2.3.2.7 Nồng độ CO 2 của môi trường

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện tại Viện Công Nghệ Sinh học và Môi Trường – Đại họcNông Lâm TPHCM từ 28/02/2011 đến 24/06/2011.

Vật liệu thí nghiệm

Quả dâu tằm tươi, được thu hoạch từ Đà Lạt, Lâm Đồng, là nguyên liệu chính trong sản phẩm này Quả được sử dụng ở trạng thái nguyên vẹn, không bị dập nát và đạt độ chín kỹ thuật hoàn hảo.

3.2.2 Hoá chất và dụng cụ thí nghiệm

 Hoá chất xác định đường tổng số (theo phương pháp Ferycyanua)

Dung dịch K3Fe(CN)6 1%

Dung dịch NaOH 5%, HCl 5%, NaOH 2,5N

Pb(CH3COO)2 thể rắn.

Phenolphtalein, xanh metylen Đường glucose 0,5%.

 Hoá chất xác định hàm lượng acid tổng

Dung dịch chuẩn NaOH 0,1N.

Chỉ thị phenolphtalein, chỉ thị metylen xanh, chỉ thị hồ tinh bột.

 Và một số hoá chất thông thường khác:

3.2.2.2 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

Trong quá trình thí nghiệm, chúng tôi đã sử dụng một số thiết bị sẵn có tại Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Đại học Nông Lâm TPHCM.

– Cần điện tử 2 số OHAVS (Golo Series)

– Cân điện tử 4 số Precisa XT220A

– Máy đo pH ORION 3 STAR

Sử dụng các dụng cụ thường có ở phòng thí nghiệm như bình tam giác, pipet,buret, nhiệt kế, cồn kế…

Phương pháp nghiên cứu

Phân lập nấm men là quá trình tách nấm men từ quần thể ban đầu và đưa về dạng thuần khiết.

3.3.1.1 Quy trình phân lập nấm men

Hình 3.1 Quy trình phân lập nấm men từ trái dâu tằm

Giữ giống trong ống thạch nghiêng

Chọn và rửa sạch dâu

Lắc tăng sinh trong 1 giờ (37 0 C)

Pha loãng trong nước muối sinh lý

3.3.1.2 Thuyết minh quy trình

Chọn những quả dâu chín kỹ, không bị dập nát và không có mùi lạ Rửa sạch dâu nhiều lần với nước thường, sau đó ngâm trong nước muối để hạn chế sự phát triển của nấm mốc Cuối cùng, vớt dâu ra để ráo nước.

Để lên men yếm khí, bạn cần rửa sạch dâu, cho vào một hũ nhựa nhỏ, thêm đường và đậy kín Sau đó, để hỗn hợp này lên men ở nhiệt độ thường trong khoảng 36-48 giờ.

Trước khi phân lập, mẫu nấm men cần được chuyển về dạng lỏng bằng cách chiết dịch lên men thay vì nghiền nát Cụ thể, 1 ml dịch sẽ được pha loãng trong 99 ml môi trường peptone đệm (độ pha loãng 10^-2) và sau đó tiến hành lắc tăng sinh ở nhiệt độ 37°C trong 1 giờ để nấm men thích ứng với môi trường mới.

Pha loãng là quá trình thêm dịch tăng sinh vào các ống nghiệm chứa nước muối sinh lý, nhằm tạo ra các nồng độ pha loãng khác nhau.

Để tiến hành thí nghiệm, đầu tiên, ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lý được hấp khử trùng ở 121°C trong 20 phút và để nguội Sử dụng pipetman, hút 1 ml dịch tăng sinh cho vào ống nghiệm thứ nhất để đạt độ pha loãng 10^-3, sau đó trộn đều Tiếp theo, hút 1 ml từ ống thứ nhất chuyển sang ống thứ hai để có độ pha loãng 10^-4, và tiếp tục thực hiện tương tự cho các độ pha loãng tiếp theo.

- Cấy trang: thực hiện cấy vào đĩa petri có chứa môi trường Hansen.

Cấy trang là bước đầu tiên trong quy trình phân lập, nhằm tạo ra các khuẩn lạc đơn trên bề mặt thạch Những khuẩn lạc này sẽ được làm thuần trong các bước tiếp theo của quá trình phân lập Số lượng khuẩn lạc đơn sau khi cấy trang càng nhiều thì việc làm thuần sẽ càng trở nên dễ dàng hơn.

Để thực hiện thao tác chuyển 0,1 ml dịch pha loãng lên bề mặt môi trường trong đĩa petri, sử dụng pipetman và đầu tip vô trùng Nhúng đầu que trải thủy tinh vào cồn 70 độ, hơ qua ngọn lửa và để nguội trong không gian vô trùng Sau đó, mở đĩa petri và nhẹ nhàng đặt que trải lên bề mặt thạch, sử dụng đầu gạt xoay để trải dịch đều lên bề mặt Khi đã trải đều, rút que trải ra khỏi đĩa, đậy đĩa lại và gói bằng giấy báo hoặc bao nilon Cuối cùng, ủ ở nhiệt độ 37 độ C trong khoảng 36 – 48 giờ.

Cấy ria là bước quan trọng trong quy trình làm thuần khiết chủng nấm men, được thực hiện trên các đĩa petri chứa môi trường Hansen Quy trình này diễn ra sau khi đã thực hiện cấy trang, nhằm mục đích phân lập và thuần hóa dần dần chủng nấm men cần nghiên cứu.

Sau 48 giờ cấy giống, quan sát khuẩn lạc trên bề mặt đĩa và chọn lọc khuẩn lạc đơn Khuẩn lạc đơn của nấm men có hình dạng tròn, hơi lồi và màu trắng sữa Sử dụng que cấy vô trùng, chuyển khuẩn lạc sang một đĩa môi trường khác chưa cấy, đặt nhẹ que cấy lên bề mặt thạch và ria các đường trên bề mặt thạch (ria chữ T, ria 4 góc) Sau mỗi đường ria, cần đốt khử trùng và làm nguội que cấy trước khi thực hiện đường ria tiếp theo Cuối cùng, bao gói đĩa petri và ủ ở nhiệt độ thường hoặc 37°C.

Cấy ria cần được thực hiện từ 3 đến 4 lần để đảm bảo chủng nấm men thu được là thuần khiết Khi quan sát khuẩn lạc trên bề mặt đĩa, nếu thấy nhiều khuẩn lạc đơn có hình dạng và màu sắc đồng đều, điều này cho thấy chủng nấm men đã được thuần khiết.

Cấy chấm là bước quan trọng cuối cùng trước khi chuyển nấm men vào ống giữ giống Quy trình này nhằm tạo ra các khuẩn lạc đơn với số lượng lớn nấm men, giúp thuận tiện cho việc quan sát, định danh và bảo quản giống.

Tăm tre bình thường được xử lý bằng cách làm tù một đầu và hấp khử trùng ở 121°C trong 20 phút Sau đó, thao tác vô trùng được thực hiện bằng cách sử dụng đầu đã làm tù của que tăm, chuyển sang một đĩa môi trường khác, và chấm nhẹ lên bề mặt thạch (chấm 3 chấm hoặc 9 chấm) Cuối cùng, đĩa petri được gói lại và ủ ở nhiệt độ 37°C trong khoảng 36 đến 48 giờ.

Giữ giống nấm men có thể thực hiện trong ống thạch nghiêng hoặc đĩa petri được dán kín bằng paraffin, giúp bảo quản chủng nấm men lâu dài và ngăn ngừa nhiễm khuẩn từ các chủng nấm men lạ, nấm mốc và vi sinh vật khác Tuy nhiên, sau một thời gian, cần phải cấy chuyển để đảm bảo rằng chủng nấm men không bị thoái hóa.

Để thực hiện thao tác, đầu tiên đổ các ống thạch nghiêng chứa môi trường Hansen Sau đó, sử dụng que cấy vòng để cấy giống vào đĩa petri, tiếp theo là cấy ziczac lên môi trường bên trong ống nghiệm Hơ đầu ống nghiệm, đậy nút bông và bọc kín đầu ống nghiệm bằng parafin Cuối cùng, giữ giống trong điều kiện lạnh từ 8-10 độ C.

3.3.2 Nghiên cứu sản xuất nước lên men từ trái dâu tằm

3.3.2.1 Quy trình dự kiến sản xuất nước lên men từ trái dâu tằm

Dâu tằm (tươi, ít dập nát) Rửa, phân loại Ủ

Xử lý sau lên men (làm trong, điều vị)

Chiết chai (thuỷ tinh 330 ml)

Bảo quản trong tủ lạnh

Hình 3.2 Quy trình dự kiến sản xuất nước lên men từ trái dâu tằm

 Thuyết minh quy trình

Nguyên liệu là yếu tố quyết định chất lượng sản phẩm, do đó việc lựa chọn nguyên liệu cho quá trình lên men rất quan trọng Dâu tằm được mua tại Đà Lạt, Lâm Đồng cần phải là dâu mới hái, chất lượng tốt và ít quả dập nát Trong quá trình vận chuyển, dâu được để trong các thùng xốp thoáng khí để hạn chế dập quả Sau khi vận chuyển, dâu cần được phân loại và rửa ngay, loại bỏ quả dập nát và chưa đủ độ chín, rửa bằng nước 2-3 lần và có thể ngâm với nước muối loãng để hạn chế nấm mốc, sau đó để ráo nước Quá trình phân loại và rửa cần diễn ra nhanh chóng để tránh oxy hóa Sau khi rửa, dâu sẽ được bổ sung enzyme pectinase và ủ ở 42°C trong 2 giờ để tăng hiệu suất ép dịch, giảm độ nhớt và nâng cao chất lượng dịch ép về mặt hóa lý và cảm quan, tạo ra dịch trong, màu đẹp và tươi hơn.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ