Giáo Trình Thực Hành Vi Sinh Giáo Trình Thực Hành Vi Sinh MỤC LỤC Bài 1 Kỹ thuật sử dụng và bảo quản kính hiển vi 4 Bài 2 Kỹ Thuật Nhuộm Gram 8 Bài 3 Nhận định kết quả khảo sát kính hiển vi 12 Bài 4 Kỹ thuật nhuộm kháng acid 14 Bài 5 Kỹ thuật cơ bản vô trùng trong vi sinh 18 Bài 6 Kỹ thuật cấy vi khuẩn 23 Bài 7 Kỹ thuật kháng sinh đồ 26 Bài 8 Tụ cầu khuẩn ( Staphylococci ) 34 Bài 9 Liên cầu khuẩn ( Streptococci ) 37 Bài 10 Phế cầu khuẩn ( Streptococcus pneumoniae ) 44 Bài 11 Màng não cầu – L.
Kỹ thuật sử dụng và bảo quản kính hiển vi
CÁCH SỬ DỤNG VÀ BẢO QUẢN KÍNH HIỂN VI
1 Mô tả cấu tạo kính hiển vi quang học
2 Nếu được chức năng từng bộ phân cấu tạo của kính hiển vi
3 Trình bày cách sử dụng kính hiển vi để quan sát mẫu vật
4 Trình bày được cách bảo quản kính hiển vi
Kính hiển vi (KHV) là một dụng cụ quang học đề khuếch đại hình ảnh một vật thể nhỏ mà mắt thường không nhìn thấy được
Trị số khuếch đại của KHV thường dùng trong phòng thí nghiệm có độ khuếch đại 100 – 1000 lần
KHV là một dụng cụ quan trọng và tinh tế, thiết yếu cho việc khảo sát các bệnh phẩm của bệnh nhân Bệnh phẩm có thể được soi trực tiếp hoặc đã qua xử lý bằng các kỹ thuật chuyên biệt, nhằm mục đích đảm bảo chẩn đoán chính xác.
Vì thế ta phải biết sử dụng, bảo quản đúng cách để có KHV tốt sẵn sàng cho việc khảo sát chuẩn đoán bệnh phẩm hoặc cần nghiên cứu
Kính hiển vi có thể có nhiều hình dạng khác nhau tùy theo mẫu sản xuất, nhưng cấu tạo cơ bản là giống nhau, gồm những bộ phận:
Thị kính là thấu kính nằm phía trên, cho phép mắt nhìn thấy hình ảnh qua vật Nó có chức năng khuếch đại hình ảnh do vật kính cung cấp Có ba loại thị kính phổ biến là x5, x10 và x15, trong đó loại x10 được sử dụng nhiều nhất.
Ống kính là một ống cho phép ánh sáng di chuyển từ thị kính đến vật kính, đồng thời giữ cho hai thành phần này cách nhau một khoảng cách nhất định.
2.3 Đĩa mang vật kính là một bộ phận có 4 lỗ để gắn vật kính, khi xoay sẽ đưa vật kính cần sử dụng vào ống kính
2.4 Vật kính: là hệ thống thấu kính hội tụ được đặt gần vật khảo sát có vai trò co ảnh thật ngược chiều với vật
Trị số khuếch đại của KHV của 3 – 5 vật kính được khắc trên vật kính thông thường một KHV thường dùng 3 loại:
- Vật kính x10: cho thị trường lớn nhất, có độ phóng đại to 10 lần Sauk hi điều chỉnh thấy rõ mẫu vật, vật kính này thường cách tiêu bản 16mm
- Vật kính x40: có độ phóng đại trung bình, phóng to gấp 40 lần Sauk hi điều chỉnh để thấy rõ mẫu vật, vật kính này thường cách tiêu bản1,5 - 4mm
Vật kính x100 là loại vật kính có độ phóng đại lớn nhất, thường được sử dụng để quan sát mẫu vật rõ nét Khoảng cách giữa vật kính và mẫu vật thường dao động từ 0,2 đến 1,8 mm Để sử dụng hiệu quả loại vật kính này, cần phải có dầu soi và chỉ nên điều chỉnh bằng ống vi cấp.
Kính tụ quang là một hệ thống thấu kính hội tụ, có chức năng tập trung ánh sáng chiếu vào vật cần soi Thiết bị này được gắn vào thân kính và có khả năng di chuyển lên xuống thông qua ốc di chuyển kính tụ quang.
Vị trí tụ quang khi cần khảo sát:
- Với VK x10 kính tụ quang cách lỗ chiếu quang 1,5 – 2,5 cm
- Với VK x40 kính tụ quang cách lỗ chiếu quang 0,2 – 0,5 cm
- Với VK x100 kính tụ quang nằm sát vừa chạm mặt dưới tiêu bản
2.6 Màn chắn ánh sáng: có thể đóng mở để, dùng để tăng hay giảm ánh sáng đi qua tụ quang
- Đèn: Ánh sáng bóng đèn được gắn vào đế thân kính
- Gương phản chiếu: Đặt đèn Neon cách kính 20 – 30 cm, đối diện gương phản chiếu để lấy ánh sáng
+ Gương mặt lõm: khi sử dụng vật kính x10, x40
+ Gương mặt phẳng: khi sử dụng vật kính x100
2.8 Hệ thống ốc điều chỉnh:
Bàn kính là một thiết bị quan trọng trong việc khảo sát mẫu vật, với thiết kế có lỗ khoét giúp ánh sáng từ tụ quang chiếu sáng trực tiếp vào vật cần nghiên cứu Bàn kính cũng được trang bị cơ chế di chuyển lên xuống nhờ hai loại ốc, tạo điều kiện thuận lợi cho việc điều chỉnh vị trí của mẫu vật.
Ốc thứ cấp là hai ốc có đường kính lớn, được gắn bên thân kính, giúp di chuyển bàn kính lên xuống với khoảng cách mà mắt thường có thể quan sát được.
Ốc vi cấp là hai ốc có đường kính nhỏ hơn, được gắn tại cùng vị trí với ốc thứ cấp Chúng có chức năng điều chỉnh bàn kính lên xuống với khoảng cách rất nhỏ, giúp cải thiện độ rõ nét của hình ảnh.
- Tiều xa là bộ phận kẹp trên bàn kính, dùng để kẹp, giữ tiêu bản trên bàn kính
Tiêu xa có thể di chuyển di chuyển sang trái phải và tiến về trước ra sau nhờ ốc di chuyển tiểu xa
- Ốc nâng hạ tụ quang lên xuống theo từng loại vật kính
3 Cách sử dụng kính hiển vi:
Làm tiêu bản, chuẩn bị kính hiển vi, cắm nguồn điện
- Luôn luôn sử dụng vật kính x 10 tìm quang trường đúng sau đó mới sử dụng các vật kính có độ phóng đại cao hơn đề quan sát vật
- Hạ tụ quang xuống (cách lỗ chiếu quang 1,5 – 2,5cm)
- Nâng bàn kính lên vị trí cao nhất bằng ốc thứ cấp
Để quan sát vật một cách rõ ràng, bạn cần nhìn vào thị kính và từ từ vặn ốc thứ cấp để hạ bàn kính xuống cho đến khi thấy vật Sau đó, tiếp tục vặn ốc vi cấp từ từ cho đến khi hình ảnh trở nên sắc nét.
- Nâng và hạ tụ quang lại, hay giảm bớt ánh sáng để nhìn rõ vật
Thực hiện như VK x10, nhưng tụ quang cách lỗ chiếu quang 0,2 – 0,5 cm
- Đưa ảnh khảo sát vào tâm thị kính VK x10 hay x40 rõ nét
- Xoay VK x40 ra, nhỏ 1 giọt dầu soi kính lên vật khảo sát
- Nâng tụ quang gần chạm mặt dưới tiêu bản
- Đưa vật x100 vào đúng khất VK phải chạm vào giọt dầu
- Nhìn vào thị kính, chỉ được điều chỉnh bằng ốc vi cấp để nhìn thấy rõ vật
- Điều chỉnh ánh sáng cho phù hợp
* Khi khảo sát tiêu bản một tay chỉnh ốc di chuyển tiêu bản, một tay di chuyển ốc vi cấp để nhìn rõ ảnh
4 Bảo quản kính hiển vi:
- Sau khi sử dụng xong xoay VK nhỏ nhất về đối diện lỗ chiếu quang
- Hạ bàn kính xuống, mở kẹp lấy tiêu bản và xử lý đúng yêu cầu kỹ thuật
- Đưa tiêu xa vào sát thân kính
- Đóng màn chắn, hạ tụ quang, vặn đèn về ánh sáng yếu
- Dùng vải mềm lau đầu, thân kính và bàn kính
- Dùng giấy lau kính lau thị kính, VK x 10, x 40 theo hình xoắn ốc từ trong ra ngoài VK x100 lau sạch dầu ở VK bằng Xylen và để khô tự nhiên
- Dùng bao che phủ và cất kính trong phòng lạnh hoặc tủ ấm 40 0 C tránh mốc meo, để kính tránh xa hóa chất và nguồn nước
- Khi di chuyển kính thật nhẹ nhàng , 1 tay cầm thân, tay kia đỡ chân kính Để đứng KHV không được để nghiêng
- Thường xuyên kiểm tra định kỳ các bộ phận cơ học và quang học để sửa chữa kịp thời
Kỹ Thuật Nhuộm Gram
1 Nắm đươc nguyên lý của kỹ thật nhuộm Gram
2 Thực hiện được kỹ thuật nhuộm Gram
3 Nhận định được kết quả nhuộm Gram
4 Tránh được các yếu tố kỹ thuật làm sai lệch kết quả nhuộm Gram
Nhuộm Gram là một phương pháp thực nghiệm quan trọng để phân loại vi khuẩn thành hai nhóm chính: Gram dương và Gram âm, dựa trên đặc tính hóa lý của thành tế bào Kỹ thuật này được phát triển bởi nhà khoa học người Đan Mạch Hans Christian Gram vào năm 1884 và đã được Hucker cùng nhiều nhà nghiên cứu khác cải tiến sau này.
Trong quá trình nhuộm Gram, sự khác biệt về cấu trúc vách tế bào giữa vi khuẩn Gram dương và Gram âm là yếu tố quyết định Vi khuẩn Gram dương giữ lại phức hợp tím Crystal Violet - iod mà không bị tẩy màu bởi cồn 95%, trong khi vi khuẩn Gram âm không giữ được phức hợp này Khi nhuộm lại bằng dung dịch Safranin 0,5%, vi khuẩn Gram dương vẫn duy trì màu tím của Crystal Violet, trong khi vi khuẩn Gram âm chuyển sang màu đỏ của Safranin.
Kính hiển vi, que cấy đầu tròn, đèn cồn, bút chì mỡ, phiến kính (slide), bình xịt nước cất, đồng hồ bấm phút
Các loài vi khuẩn có thể bao gồm vi khuẩn Gram âm như E.coli, Salmonella và vi khuẩn Gram dương như S aureus, Bacillus cereus, cùng với dịch cơ thể hoặc mẫu sinh thiết từ các khu vực nghi ngờ nhiễm khuẩn.
- Pha thuốc nhuộm tím gentians: + Tím gentians nồng độ 1/10 trong cồn ethylic 950 10ml + Acid phenic 1ml + Nước cất 100ml Lắc đều, lọc qua giấy lọc
- Pha dung dịch lugol: + Iod 1g + Kali iodid (KI) 2g + Nước cất 5ml Nghiền tan trong cối sứ rồi cho thêm nước cất cho đủ 200ml
- Pha thuốc nhuộm Safranin: + Fucshin kiềm nồng độ 1/10 trong cồn ethylic
950 10ml + Acid phenic 5ml + Nước cất 100ml Lắc đều, lọc qua giấy lọc
4.1 Mẫu thử làm phiến phết:
Đối với bệnh phẩm là mủ hoặc các chất ngoại tiết tương tự, cần thực hiện một phiến phết mỏng bằng cách sử dụng khuyên cấy đã được khử trùng, sau đó trải đều trên tấm kính với diện tích khoảng 1,5 – 2,5 cm.
Khi lấy bệnh phẩm bằng que quấn gòn, bạn nên sử dụng que gòn để làm phiến phết thẳng hoặc pha loãng với một giọt nước muối vô trùng nếu bệnh phẩm đã khô.
- Nếu bệnh phẩm là đàm hay phân: chọn phần có mủ hay máu
- Nếu bệnh phẩm lỏng như nước tiểu, nước tủy sống: làm phiến phết từ cặn lắng ly tâm với ống hút có đường kính nhỏ
- Nếu lứa cấy lỏng tùy theo độ đcụ mà ta lấy 1 giọt hay lấy đầy 2 giọt khuyên cấy để làm phiến phết
Khi cấy trên môi trường đặc, hãy sử dụng que cấy để chấm vào một khúm vi khuẩn riêng lẻ Sau đó, pha loãng với một giọt nước muối trên kính và trải mỏng thành phiến phết Việc phân tán đều và không quá dày sẽ giúp quan sát rõ từng tế bào vi khuẩn.
4.2 Kỹ thuật làm phiến phết
- Cầm que cấy thật thẳng đứng, đầu khuyên cấy đặt trên ngọn lửa đèn cồn và đốt đỏ đầu que cấy
- Để nguội dùng khuyên cấy lấy bệnh phẩm
Đặt khuyên bệnh phẩm lên giữa tấm kính và áp sát vào mặt kính Sau đó, phết đều mẫu bệnh phẩm theo đường xoắn ốc để tạo thành một lớp mỏng hình bầu dục có diện tích khoảng 1,5 x 2,5 cm.
- Đốt đỏ đầu que cấy khử khuẩn
4.3 Kỹ thuật làm phiến phết
Phiến phết được làm khô tự nhiên trong không khí hoặc hơ nhẹ trên ngọn đèn Để lưu định phiến phết, cần đưa nhanh tấm kính qua lại trên ngọn lửa đèn cồn khoảng 4 – 5 lần, với mặt có phiến phết hướng lên trên Lưu ý không hơ nóng quá mức để tránh làm co lại các tế bào.
- Thứ nhất, nhuộm bằng dung dịch tím Crystal Violet trong 30 giây đến 1 phút, rửa nước
- Thứ hai, nhuộm thêm dung dịch lugol và giữ trong 1 phút, rửa nước;
- Thứ ba, khử màu: nhỏ dung dịch alcohol 90%, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước;
- Thứ tư, nhuộm tiếp bằng dung dịch Fucshin trong 1 phút, rửa nước, để khô
Kết quả : Quan sát ở vật kính dầu 100x Vi khuẩn được phân biệt thành 2 nhóm:
+ Vi khuẩn Gram (+): bắt màu tím của Crystal Violet
+ Vi khuẩn Gram (-): bắt màu đỏ của Safranin
5 Giải thích tính bắt màu Gram của vi khuẩn
Vi khuẩn Gram dương có vách tế bào dày từ 15 đến 50 nm, được cấu tạo bởi peptidoglycan dạng lưới, có khả năng giữ phức hợp tím gentians - iod Ngược lại, vi khuẩn Gram âm có lớp vách tế bào peptidoglycan mỏng hơn và thường có thêm lớp màng lipopolysaccharde (LPS) bên ngoài.
Hình 2.1 Sơ đồ vách tế bào vi khuẩn Gram dương (trái) và Gram âm (phải)
Sau khi nhuộm với phức hợp gentians - iod, mẫu được xử lý bằng hỗn hợp khử màu, làm mất nước các lớp peptidoglycan trong vách tế bào Gram dương, giúp giữ phức hợp gentians - iod bên trong tế bào Đối với vi khuẩn Gram âm, dung dịch alcohol 90% hòa tan lipid và làm tan màng ngoài của vách tế bào, khiến lớp peptidoglycan mỏng không giữ được phức hợp gentians - iod, dẫn đến việc tế bào Gram âm bị khử màu và bắt màu thuốc nhuộm bổ sung.
6 Những sai lầm có thể gặp trong phương pháp nhuộm Gram
- Có những sai lầm trong phương pháp nhuộm Gram làm cho vi khuẩn Gram dương nhuộm thành màu hồng của vi khuẩn Gram âm, đó là:
Việc phết vi khuẩn ở lứa cấy quá già (trên 24h) dẫn đến sự suy yếu của cấu trúc vách vi khuẩn gram dương, làm giảm khả năng ngăn cản sự tẩy màu bởi alcohol.
Dung dịch Lugol có thể mất hiệu quả khi đã pha quá lâu và không còn chứa đủ iod Dấu hiệu nhận biết tình trạng này là màu sắc của dung dịch trở nên nhạt hơn, không còn sậm màu như ban đầu.
+ Tẩy màu bằng alcohol quá lâu đã làm cho vi khuẩn Gram dương cũng bị tẩy màu
- Có những sai lầm trong phương pháp nhuộm Gram làm cho vi khuẩn Gram âm nhuộm thành màu tím của vi khuẩn Gram dương, đó là:
+ Phết vi khuẩn quá dầy làm cho alcohol không thể tẩy màu toàn bộ vi khuẩn trong phết nhuộm
+ Tẩy màu bằng alcohol quá ngắn hay dung dịch alcohol bị pha quá loãng làm cho màu Gram không được tẩy khỏi tế bào vi khuẩn
Nhận định kết quả khảo sát kính hiển vi
NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ KHẢO SÁT KÍNH HIỂN VI
1 Nêu các nội dung chính phải phải ghi vào phiếu trả lời kết quả khảo sát kính hiển vi một mẫu xét nghiệm
2 Nêu ý nghĩa kết quả khảo sát hiển vi đối với lâm sàng
Khảo sát hiển vi cho ta các đặc tính về hình dạng vi khuẩn và các đặc tính này gồm có:
Về hình thể vi khuẩn được chia làm nhiều loại:
Là những vi khuẩn hình cầu, có thể tròn đều đặn như quả bóng, hoặc không đều như bầu dục, hình ngọn nến Đường kính 0,3 – 1 μm
Trực khuẩn là những vi khuẩn hình que, có thể có hai đầu tròn hoặc vuông, cùng với hai loại đầu thon nhọn như chiếc thoi, hoặc một hay hai đầu phồng to như chùy hay tạ Chúng có chiều dài từ 2 – 6 μm và chiều ngang khoảng 5 μm Trực khuẩn có thể dài hoặc ngắn, với một số loại quá ngắn đến mức có thể bị nhầm lẫn với cầu khuẩn, do đó chúng được gọi là trực cầu khuẩn (Coccobacilli).
Là những vi khuẩn có hình cong như dấu phẩy, chiều dài 2 – 5μm, chiều ngang từ 0,3 - 6μm
Là những vi khuẩn có hình cong như lò xo Có 2 loại:
Có ít vòng xoắn, ngắn và cứng Di động chậm nhờ những tiêm mao Thí dụ: Spirillum
Có nhiều vòng xoắn, dài và mềm mại Di động nhanh bằng thân vi khuẩn Thí dụ: Treponema
2 TÍNH CHẤT BẮT MÀU NHUỘM GRAM
- Phân biệt được 2 loại vi khuẩn:
Loại vi khuẩn gram (+): bắt màu tím
Loại vi khuẩn gram (-): bắt màu đỏ
- Các loại vi khuẩn trẻ ăn màu rất đậm, vi khuẩn già ăn màu nhạt
- Có loại vi khuẩn ăn màu rất yếu Nếu tẩy màu quá lầu vi khuẩn gram (+) tẩy màu thành vi khuẩn gram (-)như trường hợp vi khuẩn bạch hầu
- Phần lớn cả tế bào vi khuẩn ăn màu rất đều, nhưng có vài loại vi khuẩn chỉ ăn màu ở 2 đầu như Yersinia
3 CÁCH SẮP XẾP TẾ BÀO
Tế bào vi khuẩn sắp xếp theo nhiều cách tùy theo kiểu phân bào của vi khuẩn
Cách sắp xếp Danh từ chuyên môn Loại vi khuẩn
Cocci, coccus Diplococci Streptococci Staphylococci Tetrad
Diplococcus và Neisseria Streptococcus spp
Staphylococcus aureus Gaffkya tetragena Sarcina lutea
E coli, Shigella spp Klebsiella spp Bacillus spp Corynebacterium diphteriae
3 Phẩy khuẩn và xoắn khuẩn
Thường đứng riêng lẽ từng con một
4.1 Tế bào vi khuẩn không có nhân thật sự
Tuy nhiên trong tế bào vi khuẩn ta có thể tìm thấy :
- Các hạt biến sắc trong tế bào vi khuẩn bạch hầu
- Các bào tử như trong tế bào vi khuẩn bệnh than
4.2 Quanh tế bào vi khuẩn
Tiêm mao : giúp cho vi khuẩn di động
Tùy vào vi trị của tiêm mao mà ta phân biệt
- Loại vi khuẩn có 1 tiêm mao ở 1 đầu
- Loại vi khuẩn có 2 tiêm mao ở 2 đầu
- Loại vi khuẩn có một chùm tiêm mao ở 1 hay 2 đầu
- Loại vi khuẩn có 1 chủm tiêm mao ở 1 hay 2 đầu
Nang là lớp vỏ bọc bên ngoài của một số loại vi khuẩn, được cấu tạo từ polyoside hoặc chất nhầy Chúng chỉ xuất hiện trong những điều kiện dinh dưỡng đặc biệt, chẳng hạn như ở bệnh nhân hoặc trong môi trường có chất đản bạch.
Vi khuẩn có thể di chuyển từ vị trí này sang vị trí khác nhờ vào sự hoạt động của tiêm mao Những loại vi khuẩn không có tiêm mao sẽ không có khả năng di động.
Tiêm mao đóng vai trò quan trọng trong khả năng di động của vi khuẩn Các loại vi khuẩn thường có một hoặc hai tiêm mao, hoặc chỉ một tiêm mao ở một đầu, cho phép chúng di chuyển nhanh chóng và theo đường thẳng Ngược lại, những vi khuẩn có tiêm mao bao quanh thân thường di chuyển chậm hơn và theo hình chữ chi.
Khảo sát kính hiển vi là một phần quan trọng trong phân tích bệnh phẩm nhằm chuẩn đoán các bệnh nhiễm khuẩn Công tác này giúp định hướng cho việc chẩn đoán trong nhiều trường hợp Để đạt được điều này, phòng thí nghiệm cần ghi nhận đầy đủ các chi tiết về hình dạng của vi khuẩn quan sát được, bao gồm số lượng, hình thể, cách bắt màu, cách sắp xếp và cấu tạo của chúng.
Ví dụ : Kết quả khảo sát kính hiển vi trực tiếp của :
1 Mủ abces : có nhiều cầu khuẩn gram (+) đứng thành chuỗi
- Có khá nhiều trực khuẩn gram (+), đầu vuông, có nang và xếp thành chuỗi
- Ít Cầu khuẩn Gram (+) đứng thành chùm
3 Nước tiểu : Có vài trực khuẩn gram (-)
Kỹ thuật nhuộm kháng acid
1 Nắm đươc nguyên tắc của nhuộm kháng acid
2 Thực hiện được kỹ thuật nhuộm kháng acid
3 Nhận định được kết quả nhuộm kháng acid
4 Tránh được các yếu tố kỹ thuật làm sai lệch kết quả nhuộm kháng acid
Tế bào vi khuẩn kháng acid được bao bọc bởi lớp vỏ sáp, cho phép phức hợp màu carbolfuchsin không bị tẩy màu bởi dung dịch tẩy mạnh như acid hay alcohol acid Để phức hợp màu này thấm qua lớp vỏ sáp của vi khuẩn, có hai phương pháp cần áp dụng.
Phương pháp nhuộm nóng Ziehl Neelsen sử dụng dung dịch màu carbolfuchsin để thấm qua lớp vỏ sáp của vi khuẩn, giúp nhuộm màu vi khuẩn hiệu quả.
Phương pháp nhuộm lạnh, hay còn gọi là phương pháp Kinyoun, sử dụng dung dịch carbolfuchsin đậm đặc để nhuộm vi khuẩn Nhờ vào đặc tính thẩm thấu của carbolfuchsin, khi phủ dung dịch này lên mẫu phết và để lâu, vi khuẩn có thể được nhuộm màu ngay cả khi có lớp vỏ sáp bảo vệ.
- Dụng cụ: Lam kính sạch, que cấy, giá nhuộm, giá cắm, bôcan, …
- Hoá chất: Các thuốc nhuộm Ziehl Neelsen:
Bộ thuốc nhuộm kháng acid được chứa trong các chai sẩm màu, nắp vặn chặt, giữ trong tối ở nhiệt độ phòng
- Bệnh phẩm: Đờm hoặc các dịch khác như dịch màng não, dịch màng phổi…
- Đánh dấu tiêu bản, trải đều vi khuẩn lên tiêu bản, để khô tự nhiên, sau đó dùng ngọn lửa đèn cồn để cố định tiêu bản
Phủ đều thuốc nhuộm Carbolfuchsin lên toàn bộ diện tích dàn và bệnh phẩm Sử dụng que bông cồn, nhẹ nhàng đốt dưới lam kính cho đến khi mặt tiêu bản bốc hơi, thực hiện quá trình này 3 lần trong 5 phút Cuối cùng, rửa dưới vòi nước chảy nhẹ để hoàn thiện.
Để tẩy màu, hãy nhỏ một vài giọt hỗn hợp cồn acid lên góc lam nhuộm cho đến khi màu sắc biến mất Sau đó, rửa sạch lam dưới vòi nước máy chảy nhẹ nhàng.
- Nhuộm xanh methylen blue trong 1 phút, rửa nước
- Để khô soi kính hiển vi ở vật kính 100
Khi quan sát phết nhuộm kháng acid dưới kính hiển vi với vật kính dầu, trực khuẩn kháng acid sẽ xuất hiện với màu đỏ cánh sen, trong khi các vi khuẩn thông thường và các tế bào khác như tế bào biểu mô hay bạch cầu sẽ có màu xanh.
Khi trả lời một kết quả nhuộm kháng acid, không được kết luận là dương tính M tuberculosis mà chỉ trả lời là có hiện diện trực khuẩn kháng acid
Riêng với mẫu đàm, cần quan sát 3 dòng, mỗi dòng quan sát khoảng 100 quang trường (QT) dầu, ghi nhận kết quả theo bảng dười đây:
Số trực khuẩn kháng acid/ số quang trường Cách ghi kết quả
+/- 1+, số trung bình/ 100 QT 2+, số trung bình/ 100 QT 3+, số trung bình/ 100 QT 4+, > 9/QT
5 Các sai lầm kỹ thuật có thể gặp trong phương pháp nhuộm kháng acid
Phết nhuộm quá dày có thể khiến cho acid alcohol không loại bỏ hết màu carbolfuchsin, dẫn đến việc các trực khuẩn không kháng acid vẫn giữ màu đỏ cánh sen Tuy nhiên, có thể phân biệt chúng với vi khuẩn kháng acid bằng cách quan sát màu sắc của vùng nhầy.
Trong mẫu xét nghiệm, 17 tế bào biểu mô và bạch cầu xung quanh vẫn giữ màu đỏ, cho thấy màu sắc không bị tẩy hết Hơn nữa, trực khuẩn không có hình dạng đặc trưng của trực khuẩn kháng acid, mà có hình dáng mập mạp, không mảnh khảnh như những trực khuẩn kháng acid thực sự.
Màu carbolfuchsin có thể bị cặn, gây khó khăn trong quá trình tẩy màu bằng alcohol acid, dẫn đến vi khuẩn vẫn giữ màu đỏ cánh sen Để khắc phục tình trạng này, cần lọc màu carbolfuchsin qua giấy lọc thường xuyên mỗi khi kiểm tra, đặc biệt khi phát hiện cặn sau khi đổ bỏ màu khỏi lam.
Để đảm bảo chất lượng, cần kiểm tra thuốc nhuộm trước khi sử dụng mỗi lô mới và thực hiện kiểm tra định kỳ hàng tháng đối với các lô thuốc nhuộm đang sử dụng.
Kỹ thuật cơ bản vô trùng trong vi sinh
KỸ THUẬT CƠ BẢN VÔ TRÙNG TRONG VI SINH
1 Trình bày được những nguyên tắc cơ bản trong vô trùng phòng vi sinh
2 Thực hiện những kỹ thuật cơ bản vô trùng trong phóng vi sinh
3 Xử lý các vấn đề xảy có thể làm lây nhiễm bệnh phẩm vi sinh
1 KHÁI NIỆM VÀ TẦM QUAN TRỌNG
Thao tác vô trùng là những hành động cần thiết trong quy trình kỹ thuật nhằm ngăn chặn vi sinh vật từ môi trường hoặc người thực hiện xâm nhập vào mẫu vật và vật liệu xét nghiệm, đồng thời bảo vệ chúng khỏi sự ô nhiễm ngược lại.
Thao tác vô trùng đóng vai trò quan trọng trong xét nghiệm vi sinh vật Việc không thực hiện đúng quy trình vô trùng có thể gây ra nhiều hậu quả nghiêm trọng.
1.2.1 Hỏng vật liệu xét nghiệm
Tất cả các môi trường nuôi cấy vi sinh vật cần phải được vô trùng để đảm bảo chất lượng Nếu môi trường nuôi cấy bị bội nhiễm và không được bảo quản lạnh, nó sẽ nhanh chóng hỏng Ngoài ra, các sinh phẩm như kháng huyết thanh, kháng nguyên, bệnh phẩm và một số hóa chất cũng có thể tạo điều kiện cho sự phát triển của vi sinh vật bội nhiễm, dẫn đến hỏng hóc.
1.2.2 Không đánh giá được kết quả hoặc làm sai lệch kết quả
Việc phát hiện bội nhiễm trong vật liệu xét nghiệm là rất quan trọng, vì nếu không được kiểm tra, nó có thể làm hỏng hoàn toàn kết quả xét nghiệm Trong quá trình lấy bệnh phẩm hoặc phân lập vi sinh vật, sự bội nhiễm có thể dẫn đến việc vi sinh vật không phải là nguyên nhân chính của bệnh lấn át vi sinh vật gây bệnh Điều này đặc biệt khó khăn khi xác định các vi sinh vật gây bệnh cơ hội, khiến cho việc phân tích kết quả trở nên phức tạp hơn.
19 trường định danh tính chất sinh vật hoá học bị bội nhiễm sẽ dẫn đến định danh sai, làm cho kết quả không phù họp
1.2.3 Làm mất hoặc biến đổi vi sinh vật đang lưu giữ
Vi sinh vật được bảo quản trong môi trường thích hợp và vô trùng để ngăn ngừa sự nhiễm bẩn từ bên ngoài Quá trình lưu giữ này rất quan trọng nhằm tránh việc vi sinh vật bị lấn át hoặc có sự trao đổi chất liệu di truyền, dẫn đến biến chủng không mong muốn.
Vi sinh vật từ các loại bệnh phẩm, từ môi trường nuôi cấy có thế gây nhiễm ra môi trường sống bên ngoài
1.2.5 Gây nhiễm trùng cho cán bộ y tế và bệnh nhân
Trong quá trình thực hiện kỹ thuật xét nghiệm, việc tuân thủ đúng các thao tác vô trùng là rất quan trọng Nếu không thực hiện đúng, người thực hiện có thể gặp nguy cơ nhiễm trùng, và đồng thời, việc lấy mẫu xét nghiệm không đúng cách cũng có thể dẫn đến nhiễm trùng cho bệnh nhân.
2 CÁC DỤNG CỤ CẦN THIẾT ĐỂ TIẾN HÀNH CẤY VÔ TRÙNG
2.1 Phòng xét nghiệm Được khử trùng: phòng xét nghiệm phải được khử trùng bằng hoá chất sát trùng thích hợp
Không có luồng gió lưu thông: Tất cả các cửa phòng xét nghiệm đều phải đóng kín và không sử dụng quạt
2.3 Đèn khử trùng: dùng đèn cồn để khử trùng que cấy trong quá trình xử lý, nuôi cấy, phân lập vi sinh vật
2.4 Các dụng cụ vô trùng khác: đĩa petri, ống nghiệm, pipet phải tiệt trùng
2.5 Trang thiết bị bảo hộ cho người làm xét nghiệm: Mũ, khẩu trang, áo choàng
3 MÔT SỐ THAO TÁC VÔ TRÙNG CƠ BẢN
Để tiệt trùng que cấy trước khi lấy mẫu xét nghiệm, bạn cần đưa que cấy vào ngọn lửa của đèn cồn Giữ que cấy thẳng đứng, để vòng tròn đầu kim loại chìm trong nửa trên của ngọn đèn cho đến khi đầu que nóng đỏ Sau đó, chuyển que cấy nằm ngang và đẩy lên phía trên để tiệt trùng phần thân que cấy.
Sau khi sử dụng, que cấy cần được tiệt trùng để đảm bảo an toàn và ngăn ngừa ô nhiễm Quy trình tiệt trùng tương tự như khi chuẩn bị que cấy trước khi lấy mẫu xét nghiệm, bằng cách đốt que cấy trên ngọn lửa đèn cồn.
3.2 Thao tác với ống nghiệm
Trước khi mở nút ống nghiệm, cần nghiêng ống nghiệm một góc nhỏ hơn 45 độ so với mặt phẳng ngang Việc mở ống nghiệm ở tư thế thẳng đứng hoặc nghiêng quá lớn có thể làm bụi bẩn và vi sinh vật trong không khí rơi vào, dẫn đến nhiễm bẩn.
Ngay sau khi mở ống nghiệm và trước khi đóng nút, cần hơ ống nghiệm trên ngọn lửa đèn cồn để tiêu diệt vi sinh vật bám ở miệng và phần thành ống Quá trình này yêu cầu hơ đủ nóng và xoay ống nghiệm để đảm bảo toàn bộ miệng ống được nóng đều.
Tƣ thế cầm ống nghiệm
Khi để đĩa petri trên bàn, cần phải đảm bảo nắp đĩa luôn ở trên và không được gói lại Việc để đĩa lật ngược sẽ tạo điều kiện cho bụi và vi sinh vật trong không khí rơi vào khe giữa nắp và đĩa, từ đó có nguy cơ làm ô nhiễm môi trường nuôi cấy.
Trong tủ ấm, sau khi thực hiện cấy hoặc làm kháng sinh đồ, đĩa petri nên được đặt ngược (nắp ở phía dưới) để giảm thiểu sự bay hơi nước từ môi trường thạch Việc đặt đĩa petri đúng cách sẽ giúp duy trì độ ẩm cần thiết cho sự phát triển của vi sinh vật.
3.4 Cấy phân vùng trên môi trường phân lập
Phân lập vi khuẩn là kỹ thuật tách riêng một loại vi khuẩn từ mẫu xét nghiệm có chứa nhiều loại vi khuẩn khác nhau Quá trình này giúp thu được vi khuẩn thuần nhất, phục vụ cho các nghiên cứu và ứng dụng trong y học và sinh học.
Kỹ thuật cấy phân vùng được thực hiện theo trình tự sau:
- Lấy mẫu cần phân lập vi khuẩn đưa vào môi trường: Dùng que cấy vô trùng lấy mẫu đặt vào một vị trí gần rìa đĩa môi trường
- Tạo vùng thứ nhất: Dùng que cấy đã tiệt trùng ria qua nơi đã đặt mẫu xét nghiệm tạo thành một vùng chiếm khoảng 1/4 diện tích đĩa môi trường
Để tạo vùng thứ hai, trước tiên cần đốt que cấy để tiệt trùng, sau đó thực hiện kỹ thuật ria Những đường ria đầu tiên sẽ cắt vào một đầu của các đường ria cuối thuộc vùng thứ nhất Diện tích của vùng thứ hai nên chiếm khoảng 1/3 diện tích tổng thể của đĩa môi trường.
Để tạo vùng thứ ba, bạn cần đảo mặt que cấy và thực hiện ria tương tự như cách tạo vùng thứ hai Diện tích của vùng thứ ba nên chiếm khoảng 1/3 diện tích của đĩa môi trường.
Chú ý: Các đường ria cấy càng xít nhau càng tận dụng được diện tích bề mặt môi trường để dàn mỏng mẫu xét nghiệm
Sơ đồ cấy phân vùng trên đĩa môi trường phân lập
3.5 Cấy vi khuẩn lên môi trường thạch nghiêng
Môi trường đặc được đun nóng hoá lỏng, đổ vào ống nghiệm, giữ ống ở tư thế nghiêng thích họp, chờ thạch đặc lại sẽ được ống thạch nghiêng
Kỹ thuật cấy trên thạch nghiêng được thực hiện theo trình tự sau:
Kỹ thuật cấy vi khuẩn
KỸ THUẬT CẤY VI KHUẨN
1 Mô tả các kỹ thuật cấy vi khuẩn trong các dạng môi trường
2 Thực hành thao tác đúng các kỹ thuật
1 CẤY PHÂN LẬP TRÊN HỘP PETRI
Kỹ thuật cấy chữ chi là phương pháp phổ biến để tách vi khuẩn gây bệnh khỏi hỗn tạp vi sinh trong mẫu bệnh phẩm Quy trình này được thực hiện bằng cách cấy mẫu lên bề mặt môi trường thạch đặc, giúp xác định và phân lập các vi khuẩn có hại.
Trong phương pháp cấy 3 chiều:
Đầu tiên sau khi khử khuẩn khuyên cấy trên ngọn lửa để nguội
Lấy đầy khuyên cấy chất khử hay huyền dịch vi khuẩn cần cấy phân lập, cấy chữ chi trờn ẳ mặt thạch
Đốt khuyờn cấy lần 2, để nguội, sau đú kộo một vạch đường cấy từ ẳ mặt thạch vựng thứ nhất sang cấy chữ chi trờn ẳ mặt thạch kế cận
Đốt khuyên cấy lần 3, sau khi để nguội làm tiếp tục như trên , cấy chữ chi cho đến khi tất cả mặt thạch được cấy
Trong phương pháp cấy 3 chiều, việc thay đổi chiều cấy sẽ giúp giảm mật độ vi khuẩn Cuối cùng, sau khi ủ trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, chúng ta sẽ thu được các khúm vi khuẩn riêng lẻ được tách rời.
Nếu bệnh phẩm được cấy bằng que bông, lăn que trên một rìa nhỏ ở mặt hộp thạch xong dùng que cấy phân lập như trên
Cấy phân lập có thể thực hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau, nhưng mục tiêu chính là thu được đầy đủ khuẩn lạc của các loại vi khuẩn có trong bệnh phẩm, từ đó tạo điều kiện thuận lợi cho việc phân lập.
Phương pháp cấy 3 chiều trên hộp petri được sử dụng để tái tạo các khúm vi khuẩn đã được tách rời, nhằm đạt được một lứa cấy tinh khiết.
25 trong công tác định danh hoặc trong trường hợp cần phong phú vi khuẩn gây bệnh từ bệnh phẩm thì phải cấy bệnh phẩm vào môi trường lỏng
Sử dụng khuyên cấy vi khuẩn để chấm trực tiếp lên tâm khuẩn lạc hoặc trên mẫu bệnh phẩm Tiếp theo, tạo nhũ tương bằng cách cọ nhẹ khuyên cấy trên bề mặt canh cấy gần thành ống nghiệm Cuối cùng, nghiêng ống nghiệm để hòa tan hoàn toàn nhũ tương vào môi trường.
Với chất cấy lỏng, thì lấy đầy một khuyên cấy chuyển thẳng và trộn đều vào môi trường lỏng
Cấy bằng cách gạch chữ chi nhẹ nhàng từ đáy lên đỉnh môi trường
Dùng que cấy đâm xuống một đường ở giữa mặt môi trường, xong tiếp tục cấy chữ chi ở phần nghiêng sâu của môi trường
Hình 1 Các loại môi trường trong nuôi cấy vi khuẩn
Hình 2 a Khuyên cấy; b Kim cấy; c Pipet Paster thủy tinh d, g, h Cấy trên MT thạch nghiêng, i Cấy trên MT thạch bán lỏng
Hình 3 Kỹ thuật cấy phân lập trong hộp Petri
Kỹ thuật kháng sinh đồ
KỸ THUẬT KHÁNG SINH ĐỒ
1 Giải thích được nguyên tắc kháng sinh đồ bằng phương pháp khuếch tán kháng sinh trong thạch
2 Thực hành thành thạo đúng qui trình kỹ thuật làm kháng sinh đồ theo phương pháp khoanh giấy khuếch tán trong thạch
3 Báo cáo kết quả chính xác nhanh chóng
Kháng sinh trong khoanh giấy sẽ khuếch tán ra môi trường xung quanh đĩa chứa các chủng vi khuẩn thử nghiệm, từ đó ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn Mức độ nhạy cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh được thể hiện qua đường kính các vòng vô khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh.
2.1 Loại mẫu: Các chủng vi khuẩn gây bệnh phân lập được từ các bệnh phẩm lâm sàng, trong các vụ dịch và ở trong môi trường ngoại cảnh
- Thước đo vòng vô khuẩn
- Dụng cụ đặt khoanh giấy kháng sinh (Dispensing apparatus)
- Hộp lồng nhựa đáy phẳng có đường kính 90mm
Sử dụng môi trường tiêu chuẩn là MHA ( Mueller Hinton agar) pH là
7,4.Thạch MHA là môi trường tốt nhất để thử nghiệm kháng sinh đồ thường qui các vi khuẩn không khó mọc
Trước khi sử dụng, nếu mặt thạch còn ẩm thì nên để hộp thạch hé nắp ở tủ ấm
Giữ nhiệt độ ở 35 độ C trong buồng khí lưu cho đến khi bề mặt khô Khi trải vi khuẩn, bề mặt thạch cần duy trì độ ẩm nhưng không để nước đọng trên bề mặt hoặc nắp đậy.
Các khoanh giấy kháng sinh phải được bảo quản trong hộp riêng trong điều kiện khô ráo, ở trong tủ lạnh nhiệt độ 8 0 C hoặc -20 0 C
Trước khi mở nắp các lọ chứa đĩa kháng sinh, nên để chúng ra khỏi tủ lạnh khoảng 1 đến 2 giờ để đạt nhiệt độ phòng thí nghiệm Điều này giúp tránh hiện tượng ngưng tụ nước trên đĩa do sự tiếp xúc với không khí ẩm lạnh.
Sau khi sử dụng, khoanh giấy thừa cần được đóng kín và bảo quản trong tủ lạnh Chỉ nên sử dụng các đĩa còn hạn sử dụng và loại bỏ những đĩa đã quá hạn.
3.1 Chuẩn bị chủng vi khuẩn và pha hỗn dịch vi khuẩn
Mỗi chủng vi khuẩn cần được cấy vào môi trường thạch không có chất ức chế, như thạch dinh dưỡng, thạch máu hoặc thạch não tim, trước 1 ngày thử nghiệm, nhằm tạo ra các khuẩn lạc thuần riêng biệt.
Ủ các đĩa thạch qua đêm ở 37 độ C Sử dụng que cấy vô trùng để lấy một khuẩn lạc và hòa tan vào 2 ml nước muối sinh lý vô trùng (BHI) trong 15 phút cho đến khi đạt độ đục chuẩn 0,5 McFarland, được xác định bằng cách so sánh với độ đục chuẩn trên nền giấy trắng có vạch đen Lưu ý cần phải trộn đều ống đục chuẩn trước khi sử dụng.
Nếu độ đục của huyền dịch vi khuẩn không đạt chuẩn 0,5 McFarland, có thể điều chỉnh bằng cách thêm nước muối sinh lý hoặc bổ sung thêm vi khuẩn.
3.2 Láng vi khuẩn lên đĩa thạch
Trong vòng 15 phút sau khi pha huyền dịch vi khuẩn, hãy sử dụng một que gòn vô khuẩn để nhúng vào huyền dịch và nhẹ nhàng xoay que gòn trên thành ống nghiệm Hành động này sẽ giúp loại bỏ huyền dịch vi khuẩn thừa khỏi que gòn.
Để trải đều vi khuẩn lên mặt thạch MHA đã được hong khô, sử dụng que gòn để cấy vạch theo hình tròn Sau khi hoàn tất một lần cấy, xoay mặt thạch 60 độ và tiếp tục cấy vạch lần nữa Lặp lại quy trình này để đảm bảo mầm cấy được trải đều trên bề mặt thạch.
- Để khô mặt các đĩa thạch bằng cách đặt chúng vào trong tủ ấm 15 phút trước khi đặt kháng sinh
3.3 Đặt khoanh giấy kháng sinh
- Khoanh giấy kháng sinh được đặt càng sớm càng tốt, trong vòng 15 phút sau khi láng vi khuẩn lên đĩa thạch
Sử dụng kẹp đầu nhọn vô trùng để đặt từng khoanh giấy kháng sinh lên đĩa thạch, đồng thời ép nhẹ để đảm bảo chúng tiếp xúc hoàn toàn với mặt thạch Cần chú ý rằng khoảng cách giữa tâm các đĩa là 20 – 25 mm Thông thường, hộp đường kính 150mm có thể đặt 12 đĩa, trong khi hộp đường kính 90mm chỉ đặt được 7 đĩa.
Để đảm bảo độ chính xác khi đo vòng ức chế, không nên di chuyển khoanh giấy sau khi đã tiếp xúc với mặt thạch, nhằm tránh việc các vòng ức chế chồng chéo lên nhau.
- Để các đĩa thạch ở nhiệt độ phòng trong 30 phút cho kháng sinh từ các khoanh giấy khuếch tán trên mặt thạch
- Lộn ngược các đĩa thạch và ủ ấm ở 37 0 C trong vòng 18-20 giờ
4 ĐỌC VÀ PHÂN TÍCH KẾT QUẢ
Sau khi ủ ấm từ 16 – 18 giờ, lấy các đĩa thạch ra khỏi tủ ấm Nếu vi khuẩn được trải đều và mầm cấy đạt độ đục chuẩn, vi khuẩn sẽ phát triển thành những khúm mịn liên kết với nhau, tạo thành một vòng vô khuẩn đồng nhất Ngược lại, nếu vi khuẩn mọc thành những khúm riêng lẻ, điều đó cho thấy mầm cấy quá loãng và cần thực hiện lại thí nghiệm Đo và ghi lại kích thước vòng vô khuẩn bằng thước đo từ mặt sau của đĩa mà không mở nắp.
Chu vi vòng vô khuẩn là khu vực mà mắt thường không nhìn thấy sự phát triển của vi khuẩn Không cần quan tâm đến các khúm vi khuẩn nhỏ hay sự gia tăng nhẹ của chúng Đường kính vòng vô khuẩn được xác định dựa trên việc đánh giá độ nhạy, trung gian hoặc kháng của vi khuẩn đối với kháng sinh được thử nghiệm.
PHIẾU TRẢ LỜI KẾT QUẢ KHÁNG SINH ĐỒ
Họ tên bệnh nhân:……… Địa chỉ: ………
Kết quả kháng sinh đồ:
STT Kháng sinh Code Đường kính S R I
Kỹ thuật viên Trưởng khoa xét nghiệm
Bảng 1 Đường kính vòng vô khuẩn của một số l oại kháng sinh thường dùng ĐĨA KHÁNG SINH CODE HÀM
Khi làm ksđ các vi khuẩn đường ruột 10μg ≤ 13 14 -16 ≥ 17
Khi làm ksđ Streptococci (không phải
Khi làm ksđ Listeria monnocytogenes 10μg ≤ 19 - ≥ 20
Khi làm ksđ các vi khuẩn gram âm khác 100μg ≤ 19 20 - 22 ≥23
Methicillin khi làm ksđ Staphylococci 5μg ≤ 10 10 - 13 ≥ 14
Oxacillin khi làm ksđ Staphylococci Ox 1 μg ≤10 11 - 12 ≥13
Khi làm ksđ Staphylococci 10 units ≤ 28 - ≥ 29
Khi làm ksđ Enterococci 10 units ≤ 14 - ≥ 15
Khi làm ksđ Listeria monnocytogenes 10 units ≤ 19 - ≥ 20
2 CÁC PHỐI HỢP β – lactam ức chế β-lactamase
Khi làm ksđ các vi khuẩn khác 20/10 μg ≤ 13 14 - 17 ≥ 18
Khi làm ksđ vi khuẩn đường ruột gram (-) và
Khi lám ksđ các vi khuẩn gram âm khác 75/10 μg ≤ 14 15 - 19 ≥ 20
3 CÁC CEPHALOPORIN VÀ CEPHEM KHÁC
Khi làm ksđ các vi khuẩn gram dương khác
Khi làm ksđ Enterococci để phát hiện kháng mức độ cao
Khi làm ksđ các vi khuẩn khác
Khi làm ksđ Enterococci để phát hiện đề kháng mức độ cao
Khi làm ksđ các vi khuẩn khác
Tụ cầu khuẩn ( Staphylococci )
1 Mô tả được đặc tính hình thể và bắt màu nhuộm của Staphylococci
2 Mô tả được tính chất nuôi cấy của Staphylococci
3 Thao tác thành thạo các trắc nghiệm định danh Staphylococci
1 NƠI CƢ TRệ VÀ TÍNH GÂY BỆNH
Tụ cầu khuẩn được chia thành hai nhóm: coagulase dương và coagulase âm
Có 3 loại tụ cầu khuẩn quan trọng thường gặp nhất
1.1 Staphylococcus aureus (nhóm coagulase dương)
- Nhiễm khuẩn thông thường như: mụn, mụn nhọt, viêm lỗ tai và xoang mũi
- Nhiễm khuẩn nặng như: sưng phổi, nhiễm khuẩn huyết, viêm màng não, viêm màng trong tim và nhiễm khuân nước tiểu
- Nhiễm khuẩn thức ăn; khi vào cơ thể tiết ra độc tố ruột ( Enterotoxin ) gây ngộ độc thực phẩm
1.2 Staphylococcus epidermidis (nhóm coagulase âm)
Thường gặp nhiễm khuẩn do dùng các loại ống thông đưa vào sâu bên trong cơ thể
Gặp trong nhiễm khuẩn tiết niệu
2 ĐẶC TÍNH HÌNH THỂ VÀ NHUỘM
Cầu khuẩn là loại vi khuẩn có đường kính khoảng 1µm, thường xuất hiện dưới dạng riêng lẻ, đụi hoặc chuỗi ngắn, chủ yếu hình chùm nho Chúng không có khả năng di động, thuộc nhóm Gram dương, mặc dù đôi khi có thể trở thành Gram âm trong các lứa cấy già.
Vi khuẩn có thể phát triển dễ dàng trong môi trường thông thường Sau khoảng 18 – 24 giờ ủ ở nhiệt độ 37ºC, các khúm vi khuẩn sẽ xuất hiện với hình dạng tròn, đường kính từ 2 – 4 mm, lồi, biên đều và có màu sắc đa dạng từ trắng, vàng chanh đến vàng kim.
- Tụ cầu khuẩn tăng trưởng được trên môi trường chứa 7,5% NaCl, trong khi cũng ở độ muối này hầu hết các loại vi trùng khác bị ngăn chặn
- Trên thạch máu (BA) vi khuẩn gây tiêu huyết
- Nhuộm Gram trực tiếp từ bệnh phẩm và hoặc từ lứa cấy
Mục đích: chẩn đoán phân biệt khúm Staphylococci với khúm khuẩn
Nguyên tắc: Tụ cầu khuẩn có enzym catalase sẽ làm phóng thích O 2 từ nước oxy già tạo hiện tượng sủi bọt
Để thực hiện kỹ thuật trên kính, nhỏ một giọt nước oxy già 3% lên lam kính Sau đó, chạm nhẹ que cấy vô khuẩn vào khúm vi khuẩn và tiếp tục chạm vào giọt nước oxy già để tiến hành thí nghiệm.
Kết quả: sủi bọt ngay tức khắc là phản ứng dương
Chú ý: phản ứng dương giả khi:
- Que cấy chạm vào thạch máu lấy theo hồng cầu
4.3 Khả năng tăng trưởng và lên men trên môi trường M.S.A(Chapman)
Tụ cầu khuẩn có khả năng phát triển trên môi trường MSA với 7,5% NaCl Đặc biệt, Staphylococcus aureus có khả năng lên men đường Mannitol, tạo ra vùng màu vàng xung quanh khúm vi khuẩn.
Nguyên tắc: Vi khuẩn Staphylococcus aureus có chứa enzym coagulase có khả năng làm đông huyết tương
Kỹ thuật: cho 1 khúm vi khuẩn vào 0,5 ml huyết tương thỏ, ủ/37ºC
Kết quả: Staphylococcus aureus làm đông huyết tương trong vòng 4 giờ
Nguyên tắc : Staphylococcus saprophyticus kháng với Novobiocin Nếu dùng đĩa giấy tẩm 5μm Novobiocin đường kính vùng bị chặn đối với Staphylococcus saprophyticus sẽ nhỏ hơn 16mm
+ Cấy vi khuẩn lên mặt thạch
+ Đặt đĩa giấy tẩm Novobiocin lên trên
+ Ủ 37°C trong 18-24 giờ Đo đường kính vùng bị chặn
+ Nhạy cảm: Đường kính vòng vô khuẩn >16mm
+ Đề kháng: Đường kính vòng vô khuẩn