Giáo trình Thực hành Vi sinh vật học cung cấp cho người học những kiến thức như: Chuẩn bị dụng cụ - pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật; Phân lập vi sinh vật; Nuôi cấy, quan sát sự phát triển của vi sinh vật;...Mời các bạn cùng tham khảo!
SINH VẬT
NGUYÊN TẮC LÀM VIỆC
Khi làm việc với vi sinh vật, sinh viên phải thao tác với số lượng lớn và đậm đặc tế bào, bao gồm cả những loài có ích và nhiều loài gây bệnh cho người, động vật, thực vật Việc tiếp xúc thường xuyên với vi sinh vật là điều không thể tránh khỏi trong quá trình nghiên cứu Để bảo vệ sức khỏe và nâng cao hiệu quả nghiên cứu, người làm thí nghiệm cần tuân thủ nghiêm ngặt các quy tắc an toàn sinh học.
1 Phải mặc áo blouse trong thời gian thực tập tại phòng thí nghiệm
2 Không nói chuyện, không ăn uống, không hút thuốc và không đi lại lộn xộn trong phòng thí nghiệm
3 Khi làm việc trong phòng thí nghiệm vi sinh vật phải tuyệt đối giữ vệ sinh, tôn trọng sự ngăn nắp và trật tự của phòng thí nghiệm
4 Tuyệt đối không để canh trường hay vật phẩm, môi trường nuôi cấy vi sinh vật gây bẩn ra bàn ghế, sách vở, quần áo hay các vật dụng khác Trường hợp gây bẩn phải làm vệ sinh ngay
5 Khi sử dụng các trang thiết bị, dụng cụ… phải hết sức thận trọng, tránh làm đổ vỡ và hư hỏng
6 Khi xảy ra tai nạn hoặc sự cố, cần báo ngay với cán bộ phụ trách để có biện pháp xử lý thích hợp, kịp thời
7 Sau khi kết thúc bài thực hành, phải vệ sinh nơi làm việc của mình, vệ sinh các dụng cụ máy móc, dụng cụ thí nghiệm và xếp vào nơi qui định Rửa tay sạch và dùng cồn sát khuẩn trước khi rời khỏi phòng thí nghiệm.
MỘT SỐ LƯU Ý VỚI SINH VIÊN NHẰM ĐẠT KẾT QUẢ TỐT TRONG THỰC HÀNH VI SINH VẬT HỌC
- Trước khi vào bài thực hành:
Cần nghiên cứu kỹ mục đích – yêu cầu và nội dung toàn bộ bài hướng dẫn để hình dung được công việc sắp làm
Để nắm vững cơ sở khoa học của phương pháp thực nghiệm, cần hiểu rõ các nguyên tắc của từng thí nghiệm Việc đọc kỹ hướng dẫn thực hiện thí nghiệm giúp bạn nắm bắt được quy trình một cách chính xác Nếu gặp khó khăn, hãy xem lại các khái niệm và kiến thức lý thuyết liên quan để làm rõ vấn đề.
Cần duy trì sổ ghi chép cho các công việc thí nghiệm, bao gồm tên thí nghiệm, đối tượng nghiên cứu, nguyên tắc cơ bản của phương pháp và các kết quả đạt được.
Cần thực hiện đúng các thao tác và quy trình thí nghiệm để đạt được mục đích và yêu cầu đề ra
- Sau mỗi giờ thực hành:
Phải làm đầy đủ tường trình theo phần câu hỏi và bài tập (nếu có) đã nêu cuối bài.
ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THỰC TẬP
Kết quả cuối kỳ thực tập được đánh giá dựa trên ba tiêu chí chính: mức độ chuyên cần, hiểu biết về nguyên tắc và khả năng thực hành thao tác Mức độ chuyên cần được xác định qua sự hiện diện đầy đủ và thái độ nghiêm túc trong học tập Hai tiêu chí còn lại, bao gồm khả năng nhớ các thao tác chính và mức độ thành thạo trong thực hành, sẽ được đánh giá thông qua bài kiểm tra viết hoặc phỏng vấn và bài thực hành cuối kỳ.
CHUẨN BỊ DỤNG CỤ - PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI
- Biết cách bao gói, làm nút bông, khử trùng dụng cụ bằng nồi hấp khử trùng ở áp suất cao và bằng tủ sấy
- Nắm vững yêu cầu, nguyên tắc, các bước thực hiện pha chế và khử trùng môi trường nuôi cấy vi sinh vật
- Ống nghiệm, bình tam giác, pipet, đĩa petri … sạch để bao gói
- Ống nghiệm, bình tam giác, đĩa petri để pha môi trường
- Gòn không thấm, giấy báo, thun…
- Máy đo pH hoặc giấy đo pH
- Cốc thủy tinh, đũa khuấy, phễu thủy tinh, muỗng cân hóa chất, giấy lọc
- Dao, kéo, giá ống nghiệm
- Agar, khoai tây, nước cất
- Giấy lau kính hiển vi
- Các loại hóa chất cần cho pha chế môi trường dinh dưỡng
III CHUẨN BỊ DỤNG CỤ
- Dụng cụ được bao gói để nuôi cấy vi sinh vật phải đạt độ trung tính, phải thật sạch và khô, không bị nứt mẻ
Để đảm bảo dụng cụ sau khi khử trùng vẫn giữ được tính vô trùng, việc bao gói cần phải thực hiện một cách kín kẽ và cẩn thận, giúp dễ dàng lấy ra sử dụng khi cần thiết.
1.2 Phương pháp bao gói dụng cụ
Việc bao gói dụng cụ gồm hai khâu:
- Làm nút bông: đối với ống nghiệm, bình tam giác, pipet…
- Bao gói: cho hầu hết các dụng cụ thủy tinh
Dùng một miếng gòn không thấm nước cuộn lại, nhét vào miệng ống nghiệm sao cho vừa đủ chặt
- Nút gòn có kích thước và độ chặt vừa phải
- Đầu nút phải tròn, gọn, phần ngoài lớn hơn phần trong ống nghiệm
- Lấy nút ra hay đóng vào dễ dàng
Cách làm nút gòn cho các chai lọ, bình cầu và bình tam giác tương tự như với ống nghiệm, nhưng cần sử dụng nhiều gòn hơn Để tăng tính thẩm mỹ và bảo vệ, bạn có thể bọc nút gòn bằng một lớp vải gạc.
1.4 Cách bao gói dụng cụ
Sau khi hoàn thành việc làm nút bông, cần bao gói phần nút bông bằng giấy dầu hoặc giấy báo để bảo vệ khỏi độ ẩm trong quá trình hấp khử trùng, từ đó đảm bảo điều kiện vô trùng tốt hơn.
- Cắt các mảnh giấy hình chữ nhật với kích thước tùy theo dụng cụ cần bao gói
- Quấn giấy quanh phần đầu của nút bông
- Gập ống giấy sát vào nút bông ở mặt trước và hai bên
- Gập nốt phần giấy còn lại và cài sâu vào bên trong
+ Phần giấy bao ngoài phải chặt và kín
+ Bao bằng giấy dầu với dụng cụ hấp ướt
+ Bao bằng giấy báo với dụng cụ sấy khô khi khử trùng
Để khử trùng các dụng cụ như pipet, đĩa pêtri và que gạt, cần bao kín toàn bộ bằng giấy Một giải pháp thay thế là sử dụng hộp nhôm kín để chứa tất cả các dụng cụ này.
2 Phương pháp khử trùng dụng cụ
Khử trùng có thể được thực hiện bằng nhiều phương pháp lý hóa như nhiệt độ, bức xạ, lọc và hóa chất Việc lựa chọn tác nhân khử trùng phụ thuộc vào mục đích sử dụng và loại vật liệu cần được khử trùng.
Các dụng cụ thủy tinh chịu nhiệt thường được khử trùng bằng phương pháp nhiệt khô trong tủ sấy Đối với các thanh gạt thủy tinh, chúng được khử trùng bằng cách đốt với cồn 70 độ C, trong khi các que cấy kim loại được khử trùng bằng cách đốt trực tiếp trên ngọn lửa.
Trong trường hợp cần khử trùng môi trường nuôi cấy vi sinh vật, phương pháp nhiệt ẩm bằng nồi hấp áp lực (autoclave) ở áp suất 1 atm và nhiệt độ 121 độ C là lựa chọn phổ biến Phương pháp này đảm bảo tiêu diệt hoàn toàn vi khuẩn và các mầm bệnh, tạo ra môi trường an toàn cho việc nghiên cứu và phát triển vi sinh vật.
5 phần hữu cơ của môi trường không bị cháy, biến tính và môi trường không bị mất nước
Trong môi trường có chứa các chất phân tử lượng nhỏ như vitamin, amino acid, hoặc huyết thanh chứa protein là nhân tố tăng trưởng, phương pháp nhiệt ẩm có thể làm biến tính các thành phần này Do đó, để đảm bảo tính ổn định của chúng, thường áp dụng phương pháp khử trùng riêng bằng cách lọc qua màng.
2.1 Khử trùng dụng cụ, môi trường bằng nồi hấp áp lực
Phương pháp này sử dụng nồi hấp vô trùng với áp suất cao, được chế tạo từ kim loại chịu nhiệt và áp suất lớn Thiết bị này có khả năng tự động điều chỉnh áp suất và thời gian khử trùng theo nhu cầu của người sử dụng.
Gia tăng nhiệt độ bằng hơi nước bảo hòa dưới áp suất lớn hơn áp suất khí quyển thông thường Khi áp suất của hơi nước tăng, nhiệt độ cũng theo đó tăng lên nhờ vào hệ thống van kín chặt.
Mối quan hệ giữa áp suất ghi trên áp kế với nhiệt độ trong nồi biểu hiện qua bảng sau đây: Áp suất (atm) Nhiệt độ ( 0 C)
Phương pháp khử trùng bằng nhiệt ẩm cho phép diệt cả tế bào dinh dưỡng lẫn bào tử của vi sinh vật
- Trình tự các bước sử dụng nồi hấp áp lực như sau
+ Bổ sung nước ở đáy nồi đến vạch quy định
+ Xếp dụng cụ và vật liệu cần khử trùng vào giá đặt bên trong nồi hấp, không nên xếp quá chặt để hơi nước lưu thông dễ dàng
+ Đậy kín nắp nồi hấp Trường hợp nắp có nhiều ốc vặn, cần vặn ốc theo từng cặp đối xứng nhau
+ Mở van thông hơi giữa 2 nồi (trường hợp nồi hấp 2 lớp)
+ Bật công tắc, đun nồi hấp
Khi nhiệt độ đạt 80 độ C hoặc 0,5 atm, hãy từ từ mở van xả để loại bỏ hoàn toàn không khí trong nồi trong khoảng 3 – 5 phút cho đến khi hơi nước thoát ra liên tục, sau đó đóng van lại.
Khi áp suất đạt yêu cầu, bắt đầu tính thời gian khử trùng Sau khi hoàn tất thời gian khử trùng, cần tắt điện và chờ cho nhiệt độ cùng áp suất giảm xuống mức 0 trước khi mở nắp, nhằm tránh tai nạn và ngăn chặn sự thay đổi đột ngột của áp suất có thể gây hư hại cho môi trường.
Một số nồi hấp hiện đại được trang bị tính năng tự động kiểm soát thời gian và áp suất, cùng khả năng tự đuổi khí ra ngoài, giúp người dùng tiết kiệm thời gian và công sức trong quá trình nấu nướng.
Để đảm bảo an toàn và hiệu quả trong quá trình hấp khử trùng, người thực hiện thí nghiệm cần chú ý kiểm tra mực nước và bổ sung nước cần thiết trước khi sử dụng thiết bị Việc tuân thủ đúng quy trình hướng dẫn là rất quan trọng.
Để đảm bảo độ kín cho nắp nồi có nhiều ốc vặn, cần xiết ốc theo từng cặp đối xứng Điều này giúp tránh tình trạng nắp nồi bị chênh hoặc làm hư vòng đệm cao su.
PHÂN LẬP VI SINH VẬT
- Nắm vững nguyên tắc và mục đích của việc phân lập vi sinh vật
- Thực hiện được các bước phân lập và làm thuần các chủng vi sinh vật
- Cỏ khô ngâm trong nước 2 – 3 ngày; bánh men cơm rượu; nước trái cây (thơm, nho…) để 2 ngày; cơm nguội để 4 - 5 ngày
- Môi trường thạch đĩa (Hansen, PGA, peptone, Gause/Czapek – dox), thạch nghiêng (PGA) để phân lập
- Đèn cồn, gòn thấm, giấy vệ sinh
- Que gạt vô trùng, que cấy vòng, que cấy móc
- Các ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng
- Các bình tam giác chứa 99ml nước cất vô trùng
- Nhãn dán (hoặc bút ghi ống nghiệm)
Trong tự nhiên và các vật phẩm nghiên cứu, vi sinh vật thường xuất hiện dưới dạng hỗn hợp với nhiều loài khác nhau Để nghiên cứu hình thái, sinh lý, sinh hóa hoặc ứng dụng thực tiễn của một loài vi sinh vật cụ thể, việc đưa chúng về dạng thuần khiết là rất cần thiết.
Phân lập vi sinh vật là quá trình tách riêng các loài vi sinh vật từ quần thể ban đầu và chuyển chúng về dạng thuần khiết Quy trình này đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật.
Vi sinh vật ở dạng thuần khiết là giống vi sinh vật được tạo ra từ 1 tế bào ban đầu
IV PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VI SINH VẬT THUẦN KHIẾT
Nguyên tắc phân lập vi sinh vật là tách rời các tế bào vi sinh vật và nuôi cấy chúng trong môi trường dinh dưỡng đặc trưng, nhằm tạo ra các khuẩn lạc mọc riêng rẽ và cách biệt Đối với hầu hết các loại mẫu nghiên cứu, quá trình này bao gồm các bước cơ bản để thu được vi sinh vật ở dạng thuần khiết.
- Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ từ một quần thể vi sinh vật trong thiên nhiên như đất, nước, không khí, những mẫu vật và sản phẩm khác…
- Phân lập vi sinh vật thuần khiết
- Kiểm tra độ thuần khiết
1 Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ (từ quần thể vi sinh vật) trên các môi trường phân lập
Để đạt được mục tiêu tách rời các mẫu, bước đầu tiên là pha loãng mẫu cần phân lập Nếu mẫu đang ở trạng thái đặc, cần chuyển đổi chúng về dạng lỏng để thực hiện quá trình này.
+ Hòa tan mẫu trong nước cất vô trùng
Sau đó thực hiện như mẫu ở dạng lỏng
+ Tiếp tục pha loãng ở nồng độ cần thiết
+ Cấy mẫu trên môi trường đặc trưng của nó
Mỗi loại vi sinh vật có những đặc tính riêng biệt trong môi trường dinh dưỡng Dựa vào đặc điểm này, người ta đã phát triển các môi trường nuôi cấy chỉ cho phép một nhóm vi sinh vật nhất định phát triển, trong khi các vi sinh vật khác sẽ bị ức chế hoàn toàn hoặc một phần.
Ví dụ: cần phân lập nấm mốc hoặc xạ khuẩn thì phân lập trên môi trường có thêm chất kháng sinh để ức chế vi khuẩn
2 Phân lập vi sinh vật trên môi trường đặc ở đĩa petri a Đối với vi sinh vật hiếu khí
- Trãi mẫu bằng phương pháp gạt:
+ Hút 0,1 ml dịch mẫu đã pha loãng cho vào đĩa petri có môi trường thích hợp
Sử dụng que gạt thủy tinh để phân phối dịch mẫu đều trên bề mặt thạch, sau đó tiếp tục gạt mẫu này lên bề mặt thạch của đĩa petri thứ hai và thứ ba để đảm bảo sự đồng nhất trong quá trình thí nghiệm.
Đặt các đĩa petri 1, 2, 3 vào tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp Sau một khoảng thời gian nhất định, tùy thuộc vào giống vi sinh vật, chúng ta sẽ thu được các khuẩn lạc riêng biệt từ các đĩa thứ 2 và 3.
- Trãi mẫu bằng phương pháp ria:
+ Khử trùng que cấy vòng, để nguội
+ Lấy một ít dịch tế bào ria các đường trên hộp petri như hình vẽ
+ Sau mỗi đường ria, đốt que cấy và làm nguội trước khi thực hiện đường ria tiếp theo
Gói đĩa petri và ủ ở nhiệt độ phù hợp để phát triển vi sinh vật Sau một khoảng thời gian nhất định, tùy thuộc vào loại vi sinh vật, chúng ta sẽ quan sát được các khuẩn lạc riêng biệt xuất hiện từ các đường ria.
Hình 3: Phân lập bằng kỹ thuật ria b Đối với vi sinh vật kỵ khí
+ Dùng môi trường đặc trong ống nghiệm đem chưng cách thủy để loại bỏ không khí trong môi trường
+ Để nguội môi trường còn 45 – 50 0 C
Để tiến hành thí nghiệm, đầu tiên bạn cần hút 0,1 ml dịch nghiên cứu và cho vào ống môi trường, sau đó đậy nắp và lắc đều Tiếp theo, hãy nhanh chóng rót môi trường trong ống nghiệm vào nắp dưới của đĩa pêtri và đậy nắp lại thật nhanh để đảm bảo không còn không khí giữa mặt nắp và môi trường.
+ Dùng parafin hàn kín phần tiếp xúc giữa 2 nắp của đĩa petri và ủ ở nhiệt độ thích hợp
Sau khi vi sinh vật phát triển, cần chọn các khuẩn lạc riêng lẻ trong khối môi trường Tiếp theo, sử dụng que cấy để cắt cả khối môi trường và cấy vào môi trường lỏng phù hợp.
3 Kiểm tra độ thuần khiết của giống phân lập Độ thuần khiết của các giống đã phân lập sẽ được kiểm tra vết cấy, kiểm tra độ thuần của khuẩn lạc a Kiểm tra vết cấy
Quan sát sự sinh trưởng của vi sinh vật qua vết cấy trên môi trường đặc
+ Nếu vết cấy có bề mặt và màu sắc đồng đều, thuần nhất chứng tỏ giống mới phân lập đã tinh khiết thì giữ lại
+ Nếu vết cấy không thuần nhất thì loại bỏ b Kiểm tra lại độ thuần chủng của các khuẩn lạc
+ Chọn các khuẩn lạc riêng rẽ trên môi trường thạch nghiêng
+ Tách các khuẩn lạc này ra và hòa tan, pha loãng ở nồng độ cần thiết trong nước cất vô trùng
+ Nhỏ một giọt dịch trên vào đĩa petri có môi trường
+ Dùng 1 que gạt phân phối giọt dịch đều khắp mặt thạch đĩa petri thứ nhất, rồi đĩa thứ 2, thứ 3
+ Đặt các đĩa petri vào tủ ấm với nhiệt độ và thời gian thích hợp tùy loại vi sinh vật
+ Sau đó lấy ra quan sát các khuẩn lạc riêng rẽ Sự thuần khiết của khuẩn lạc là biểu hiện sự thuần khiết của giống
Để kiểm tra độ thuần khiết của các giống phân lập vi khuẩn, có thể sử dụng kính hiển vi để quan sát các tiêu bản cố định nhuộm màu hoặc tiêu bản tế bào sống Nhiều loại vi khuẩn như Pseudomonas, Bacterium, và Bacillus thường có hình thái đồng nhất, mặc dù kích thước tế bào có thể khác nhau Ngược lại, các vi sinh vật như Mycobacterium, Nocardia, và Corynebacterium lại có sự đa dạng lớn về hình thái, khiến việc xác định độ thuần khiết của chúng trở nên khó khăn hơn khi quan sát dưới kính hiển vi.
V PHÂN LẬP MỘT SỐ GIỐNG VI SINH VẬT
+ Men bánh mì: men cái bánh mì (dạng paste hoặc bột) hòa tan trong nước cất vô trùng, sau đó pha loãng vài lần trước khi sử dụng
+ Men rượu hoặc men cơm rượu: bánh men bẻ đôi, cạo lấy phần bột ở giữa, hòa trong nước cất vô trùng, pha loãng vài lần trước khi sử dụng
Để tạo men trái cây, bạn hãy cho một ít nước mía hoặc trái cây tươi như thơm, nho vào ống nghiệm sạch Sau đó, dầm lấy nước và bọc miệng ống nghiệm bằng giấy Để hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ Khi thấy dịch trong ống nghiệm bắt đầu sủi bọt, bạn có thể pha loãng vài lần trước khi sử dụng.
- Môi trường phân lập: Hansen
+ Trãi mẫu bằng phương pháp ria:
Chuẩn bị nguồn phân lập như đã hướng dẫn Sử dụng que cấy vòng để lấy một ít dịch tế bào nấm men và dàn đều trên một cạnh của đĩa petri Đốt đầu que cấy để khử trùng, sau đó kéo thành những đường zic-zắc từ cạnh có tế bào nấm men Tiến hành tương tự ở ba vùng kế tiếp.
Gói hộp petri, ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày
+ Trãi mẫu bằng que gạt :
Cho 0,1 ml dịch tế bào nấm men lên mặt thạch petri và sử dụng que gạt đã được khử trùng bằng cồn để trải đều dịch tế bào trên bề mặt thạch Có thể tiếp tục gạt trên các đĩa thứ hai và thứ ba để đảm bảo phân bố đồng đều.
Gói petri, ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày
NUÔI CẤY, QUAN SÁT SỰ PHÁT TRIỂN CỦA VI SINH VẬT 18 I MỤC ĐÍCH YÊU CẦU
TRIỂN CỦA VI SINH VẬT
- Nắm vững các nguyên tắc và mục đích của việc nuôi cấy vi sinh vật
- Thực hiện được các thao tác cấy truyền từ ống giống sang các loại môi trường thạch nghiêng, thạch đứng, thạch đĩa…
- Theo dõi, quan sát và ghi nhận sự phát triển của vi sinh vật trên các loại môi trường nuôi cấy
- Bút ghi ống nghiệm, gòn thấm
- Que cấy vòng, que cấy móc
- Đèn cồn, giá để ống nghiệm
- Các ống môi trường thạch nghiêng (Peptone, Hansen, PGA), thạch đĩa (Peptone, Hansen, PGA), môi trường lỏng (Peptone, Hansen, PG)
- Các ống giống vi khuẩn (E coli, Bac subtilis, Streptococcus), nấm men (Saccharomyces….), nấm sợi (Aspergillus, Penicillium, Mucor, Rhizopus…)
III PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY VI SINH VẬT
Quá trình nuôi cấy vi sinh vật thực chất gồm 2 khâu: nuôi và cấy
- Nuôi là quá trình đảm bảo và duy trì những điều kiện thuận lợi nhất cho sự hoạt động và phát triển của vi sinh vật
- Cấy là những thao tác chuyển vi sinh vật từ môi trường đang sống sang môi trường thuận lợi hơn cho sự phát triển của chúng
Hai khâu này không thể tách rời nhau trong quá trình nghiên cứu và ứng dụng của vi sinh vật
2 Mục đích của việc nuôi cấy
- Phát hiện sự có mặt của vi sinh vật trong các vật liệu nghiên cứu
- Tiến hành việc nhân giống vi sinh vật một cách nhanh chóng
- Cấy truyền từ canh trường cũ sang canh trường mới để giữ giống
- Nghiên cứu các đặc tính sinh học của vi sinh vật
- Mọi thao tác nuôi cấy đều phải thực hiện trong điều kiện vô trùng để tránh tạp nhiễm
- Môi trường và dụng cụ nuôi cấy phải được khử trùng triệt để
- Duy trì tốt các điều kiện nuôi cấy để vi sinh vật phát triển
4 Các phương pháp nuôi cấy a Phương pháp chung của việc cấy chuyền
Ví dụ: cấy truyền từ ống nghiệm chứa giống sang ống nghiệm chứa môi trường
Gồm các thao tác chính sau:
- Tay trái cầm 2 ống nghiệm: ống giống nằm ở ngoài, ống môi trường ở trong, giữ cả hai ống hơi nghiêng
- Tay phải cầm que cấy và khử trùng trên ngọn đèn cồn cho đến khi nóng đỏ dây cấy
- Dùng ngón út và ngón áp út kẹp nút bông vào lòng bàn tay xoay nhẹ, kéo nút bông ra và giữ trên tay đến khi đậy lại
- Hơ nóng để khử trùng không khí ở miệng 2 ống nghiệm
- Đợi khi que cấy vừa nguội, khéo léo đưa que cấy tiếp xúc với khuẩn lạc trong ống giống
- Rút que cấy ra, không để que cấy chạm vào thành ống nghiệm và đưa vào ống nghiệm môi trường để thực hiện thao tác cấy truyền
- Rút que cấy ra, khử trùng lại phần không khí nơi miệng ống nghiệm rồi đậy nút bông lại
- Để các ống nghiệm vào giá, đốt lại que cấy trên đèn cồn rồi để vào chỗ cũ
- Dán nhãn ghi tên giống vi sinh vật, ngày cấy, tên môi trường vào thành ống nghiệm
Cách cấy truyền này có thể tiến hành từ canh trường đặc (hoặc lỏng) sang môi trường đặc (hoặc lỏng)
Để cấy giống trong môi trường lỏng, ngoài việc sử dụng que cấy, có thể dùng pipet để hút môi trường Pipet cần được chuẩn bị và tiệt trùng kỹ lưỡng trước khi sử dụng, bao gồm rửa sạch, sấy khô, bọc giấy và khử trùng Khi sử dụng, cần tháo giấy bọc ra và sử dụng ngay lập tức Sau khi hoàn thành, pipet nên được cắm vào dung dịch khử khuẩn Phương pháp cấy trên thạch nghiêng cũng là một lựa chọn hiệu quả.
Phương pháp này dùng để cấy truyền các vi sinh vật hiếu khí
Thông thường, khi sử dụng que cấy vòng, quy trình thực hiện sẽ tương tự như đã nêu Tuy nhiên, sau khi lấy giọt canh chứa vi sinh vật vào đầu que cấy, chúng ta sẽ tiếp tục thực hiện các bước sau.
- Đưa đầu que cấy vào tận đáy ống nghiệm
- Nhẹ nhàng hòa giọt canh trường vi sinh vật vào giọt nước ngưng tụ ở đáy ống nghiệm
- Nhẹ nhàng và từ từ kéo đầu que cấy trên mặt thạch từ đáy lên trên theo các kiểu như sau:
+ Theo kiểu hình chữ chi
+ Theo đường vạch ngang song song
Hình 4: Một số kiểu cấy trên ống thạch nghiêng c Cấy đâm sâu trên thạch đứng
Phương pháp này được áp dụng để cấy vi sinh vật kị khí, sử dụng que cấy nhọn để đâm sâu vào môi trường Cách thực hiện tương tự như các phương pháp trước, chỉ có một số điều chỉnh nhỏ.
- Quay ngược ống môi trường cho miệng ống nghiệm hướng xuống dưới để tránh nhiễm lúc cấy
Đưa que cấy vi sinh vật vào ống thạch, đâm sâu đến đáy ống nghiệm Tùy theo yêu cầu, có thể thực hiện từ 1 đến 3 lần, có thể đâm chính giữa hoặc sát thành ống.
- Khi cắm que cấy vào cũng như khi rút ra, chú ý giữ que cấy thẳng, làm nhẹ nhàng không làm cho môi trường bị nứt nẻ
Hình 5: Cấy đâm sâu vào thạch đứng d Phương pháp cấy trên đĩa petri
Cấy trên đĩa petri có thể thực hiện bằng hai phương pháp: sử dụng que cấy vòng hoặc pipet Trong bài viết này, chúng ta sẽ tập trung vào phương pháp cấy bằng que cấy vòng và trình tự thực hiện sẽ được mô tả chi tiết.
- Để đĩa petri lên bàn
- Dùng que cấy lấy canh trường vi sinh vật theo thư tự và yêu cầu vô trùng như đã nêu phần trên
- Tay trái hé mở nắp hộp vừa đủ để cho đầu que cấy vào
- Nhẹ nhàng và nhanh chóng lướt que cấy trên mặt thạch theo các kiểu: + Theo hình chữ chi trên toàn bộ bề mặt thạch
+ Theo những đường song song
+ Theo 4 hình chữ chi ở bốn góc của đĩa thạch
Trong quá trình cấy, số lượng vi sinh vật giảm dần theo chiều dài đường cấy, dẫn đến việc các khuẩn lạc trở nên thưa thớt hơn khi vi sinh vật phát triển gần cuối đường.
Hình 6: Các kiểu cấy trên thạch đĩa
IV CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI VI SINH VẬT Để đảm bảo vi sinh vật phát triển tốt, sau khi cấy xong phải quan tâm đến các điều kiện nuôi dưỡng Có nhiều điều kiện ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật, nhưng đáng chú ý nhất là những điều kiện sau:
Tùy thuộc vào từng loài vi sinh vật, cần chọn nhiệt độ tối ưu để chúng phát triển và duy trì sự ổn định của nhiệt độ đó Dựa vào nhiệt độ tối ưu, vi sinh vật được phân chia thành ba nhóm chính.
+ Vi sinh vật ưa ấm có nhiệt độ tối thích 20 – 37 0 C
+ Vi sinh vật ưa nóng có nhiệt độ tối thích 55 - 60 0 C
Vi sinh vật ưa lạnh phát triển tốt nhất ở nhiệt độ từ 10 đến 15 độ C Để đảm bảo môi trường nhiệt độ lý tưởng cho chúng, cần sử dụng các tủ hoặc phòng ấm được trang bị bộ phận điều chỉnh nhiệt độ tự động, giúp duy trì nhiệt độ ổn định.
2 Độ ẩm Để đảm bảo độ ẩm cho vi sinh vật phát triển ta có thể thực hiện bằng các cách sau:
- Khi chuẩn bị môi trường phải đảm bảo đủ lượng nước
- Phun nước vô khuẩn vào phòng nuôi hoặc để nước bốc hơi trong tủ ấm
3 Điều kiện hiếu khí và yếm khí:
Cung cấp thường xuyên và đầy đủ oxy cho vi sinh vật có thể thực hiện bằng các biện pháp:
+ Lớp môi trường nuôi cấy có độ dày vừa phải (2 – 8cm) có thể nuôi trong ống nghiệm, khay, bình tam giác
+ Các bình chứa canh trường được lắc thường xuyên trong quá trình nuôi để cung cấp thêm oxy cho vi sinh vật
+ Nếu nuôi cấy sâu trong môi trường lỏng, thì phải tiến hành sục khí thường xuyên hay định kỳ
Ngăn cách không cho vi sinh vật tiếp xúc với oxy bằng cách:
Sau khi hoàn tất quá trình cấy, hãy phủ lên bề mặt môi trường một lớp dầu paraphin, dầu vazơlin hoặc thạch dày khoảng 2 cm Phương pháp này đơn giản và dễ thực hiện Lưu ý rằng dầu và thạch cần phải được vô khuẩn, đồng thời dầu phải có tính trung tính.
+ Cấy đâm sâu trong môi trường đặc
+ Nuôi cấy trong bình hút chân không, có thể dùng những ống nghiệm đặc biệt gieo cấy xong hút hết không khí rồi hàn kín lại
+ Đun sôi môi trường 20 – 30 phút rồi làm nguội nhanh để đuổi hết oxy trong đó
+ Dùng hóa chất để loại trừ oxy của không khí trong dụng cụ nuôi
+ Có thể nuôi vi sinh vật hiếu khí cùng vi sinh vật kỵ khí Phương pháp này thì khó áp dụng
V QUAN SÁT ĐẶC TÍNH SINH LÝ CỦA VI SINH VẬT NUÔI CẤY
Vi sinh vật khi phát triển trên môi trường tạo thành các khuẩn lạc với những đặc điểm sinh lý đặc trưng cho từng loài Quan sát các khuẩn lạc này rất quan trọng trong việc phân loại và nghiên cứu sinh hóa, di truyền của vi sinh vật Các phương pháp quan sát có thể sử dụng bao gồm mắt thường, kính lúp và kính hiển vi quang học.
1 Quan sát đặc tính phát triển của vi sinh vật trên môi trường đặc
Khi quan sát sự phát triển của vi sinh vật trên môi trường đặc cần ghi nhận các đặc điểm sau đây:
- Hình dạng khuẩn lạc (dạng tròn, dạng rễ cây, dạng không đều hay dạng bầu dục…)
- Kích thước khuẩn lạc (tính bằng mm) Nếu là dạng khuẩn lạc tròn ta đó đường kính khuẩn lạc Nếu không phải hình tròn ta đo chiều dài nhất
- Màu sắc: ghi màu sắc khuẩn lạc tạo thành, và màu của môi trường
- Bề mặt khuẩn lạc: ghi nhận bề mặt khuẩn lạc bóng, xù xì, gấp nếp hay gồ ghề…
- Mép khuẩn lạc: bằng phẳng, lượn sóng hay răng cưa…
- Độ đặc: dạng mỡ, bột nhão, dạng nhớt, dạng màng
2 Quan sát đặc tính phát triển của vi sinh vật trong môi trường lỏng
Sự sinh trưởng của vi sinh vật trong môi trường lỏng diễn ra ổn định và đồng nhất hơn so với môi trường đặc Khi quan sát sự phát triển của vi sinh vật trong môi trường lỏng, cần chú ý ghi nhận các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình này.
- Sinh trưởng yếu, vừa, hay mạnh mẽ
- Đục môi trường: đục đồng đều, dạng bông …
- Khả năng tạo váng: dạng váng vòng hay dạng kín, váng mỏng hay dày, phẳng hay xù xì, nhẵn nhụi hay gấp nếp, khô hay nhày, nổi hay chìm
- Khả năng tạo thành cặn tủa: ít hay nhiều, xốp hay đặc
VI THỰC HÀNH VÀ BÁO CÁO KẾT QUẢ
Thực hành cấy truyền vi khuẩn và nấm men từ ống giống sang môi trường thạch nghiêng, đĩa petri và môi trường lỏng là một quy trình quan trọng trong nghiên cứu vi sinh Sau khi cấy, mẫu được nuôi ủ ở nhiệt độ phòng để theo dõi sự phát triển của vi khuẩn và nấm men, giúp đánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển của chúng trong các điều kiện khác nhau.
Thực hành cấy truyền nấm mốc từ ống giống sang môi trường thạch đĩa và thạch nghiêng bằng phương pháp cấy 3 điểm Sau khi cấy, cần nuôi ủ ở nhiệt độ phòng và theo dõi sự phát triển của nấm mốc.
1 Nêu rõ nguyên tắc và mục đích của việc cấy truyền vi sinh vật từ ống giống sang môi trường?
2 Trình bày tóm tắt thao tác cấy truyền vi sinh vật từ ống giống sang môi trường thạch nghiêng và thạch đĩa?
3 Nêu và phân tích các điều kiện chính trong quá trình nuôi vi sinh vật?
4 Sau thời gian nuôi cấy 3 – 5 ngày quan sát và ghi nhận sự phát triển của vi khuẩn, nấm men, nấm mốc?
5 Mô tả hình dạng, màu sắc khuẩn lạc của vi khuẩn, nấm men, nấm sợi trên môi trường đặc?
ĐẾM SỐ LƯỢNG TẾ BÀO VI SINH VẬT
- Nắm được các bước thu và pha loãng mẫu nghiên cứu trước khi tiến hành đếm số lượng vi sinh vật
- Nắm vững các nguyên tắc và cách tiến hành đếm số lượng tế bào vi sinh vật theo phương pháp xác định trực tiếp và gián tiếp
- Quả bóp cao su, đèn cồn
- Đĩa petri có sẵn môi trường (hoặc chuẩn bị đĩa petri vô trùng và bình môi trường đã khử trùng) (môi trường Hansen, môi trường peptone agar)
- Pipet 1ml, 5ml, 10 ml vô trùng
- Mẫu cần kiểm tra (dịch nuôi cấy vi khuẩn và nấm men sau 3 – 5 ngày, bánh men cơm rượu)
- Các ống nghiệm chứa 9 ml nước cất vô trùng
- Một số bình tam giác chứa 99 ml nước cất vô trùng
- Cối, chày, bình tam giác vô trùng
III THU VÀ PHA LOÃNG MẪU
Để xác định tổng số lượng vi sinh vật và số lượng riêng của từng nhóm trong một mẫu vật, cần thực hiện việc đếm số lượng tế bào của chúng.
Khi xác định số lượng vi sinh vật trong đất, nước, không khí, dịch nuôi cấy hoặc các vật phẩm khác, có nhiều phương pháp được áp dụng Hai phương pháp phổ biến nhất trong việc này là
- Phương pháp xác định trực tiếp số lượng tế bào bằng phòng (buồng) đếm hồng cầu
- Phương pháp xác định gián tiếp số lượng tế bào bằng cách đếm số khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch
Cả hai phương pháp trên đều phải tiến hành qua hai giai đoạn sau đây:
Tùy thuộc vào loại vật phẩm cần xác định, việc lấy mẫu nghiên cứu cần được thực hiện với số lượng và khối lượng phù hợp Quy trình thu mẫu phải tuân thủ các yêu cầu nhất định để đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của kết quả nghiên cứu.
- Lấy mẫu có tính chất đại diện
- Lượng mẫu lấy vừa phải, đủ để phân tích các đặc tính lý, hóa, sinh học
- Dụng cụ lấy mẫu và chứa mẫu phải vô trùng
- Lấy mẫu xong phải phân tích ngay và không được để quá 24 giờ
- Mẫu lấy phải ghi vào nhãn ký hiệu và ghi vào sổ những đặc điểm của mẫu và nơi thu mẫu
Chuẩn bị một số bình tam giác với 99 ml nước cất vô trùng, ống nghiệm chứa 9 ml nước cất vô trùng và ống hút vô trùng 1 ml Điều này áp dụng khi mẫu nghiên cứu đang ở trạng thái lỏng.
- Hút 1 ml mẫu nghiên cứu cho vào ống nghiệm có 9 ml nước cất vô trùng
- Trộn đều dung dịch bằng cách hút lên rồi thổi xuống 3 – 5 lần ta được độ pha loãng 1/10 hay 10 -1
- Tiếp tục hút 1 ml ở ống nghiệm 1 cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nước cất vô trùng thứ 2
- Trộn đều dung dịch như trên ta có độ pha loãng 1/100 hay 10 -2
- Tiếp tục như vậy hút từ ống 2 sang ống 3, từ ống 3 sang ống 4 ta sẽ có các độ pha loãng tương ứng 10 -3 , 10 -4 …
Hình 7: Sơ đồ pha loãng mẫu nghiên cứu ở trạng thái lỏng và cấy vào môi trường đặc
27 b Nếu mẫu nghiên cứu ở trạng thái đặc (như đất, thực phẩm …)
- Chuẩn bị 2 bình tam giác có dung tích 250 ml
+ Bình 1 chứa 99 ml nước cất vô trùng
+ Bình 2 đã vô trùng và không chứa gì
- Khử trùng cối chầy sứ bằng cho một ít cồn vào và đốt lên Sau đó để nguội
- Cân 1g mẫu cho vào cối sứ và nghiền nát mẫu
- Dùng toàn bộ nước ở bình 1 để chuyển toàn bộ mẫu sang bình 2
- Lắc đều khoảng 5 phút, để lắng 30 giây rồi tiếp tục pha loãng mẫu như mẫu ở trạng thái lỏng
- Tùy theo sự ước đoán số lượng vi sinh vật trong mẫu mà pha loãng nhiều hay ít
Sau khi có độ pha loãng thích hợp thì tiến hành xác định số lượng tế bào vi sinh vật
Hình 8: Sơ đồ pha loãng mẫu nghiên cứu ở trạng thái đặc và cấy vào môi trường đặc
IV XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG TẾ BÀO VI SINH VẬT
1 Xác định trực tiếp số lượng tế bào vi sinh vật bằng phòng đếm hồng cầu
Phòng đếm hồng cầu dùng để đếm vi sinh vật có kích thước lớn (nấm men, bào tử nấm mốc)
Người ta thường dùng 2 loại phòng đếm hồng cầu Thomas và phòng đếm Geriep
Nguyên tắc cấu tạo của hai loại phòng đếm giống nhau, bao gồm một phiến kính dày hình chữ nhật được chia thành ba khoảng ngang Khoảng giữa được chia thành hai khoảng nhỏ, mỗi khoảng nhỏ có một lưới đếm với tổng cộng 400 ô vuông, diện tích 1mm² Do đó, diện tích của mỗi ô vuông là 1/400 mm² và chiều cao là 1/10 mm, dẫn đến thể tích của một ô nhỏ là 1/4000 mm³ Phòng đếm được thiết kế với lớp kính dày để bảo vệ.
1 Nhìn nghiêng; 2 Nhìn trên xuống; 3 Khung được phóng đại
- Lắc đều ống nghiệm pha loãng mẫu
- Đậy lá kính lên lưới đếm
Sử dụng ống hút vô trùng để lấy mẫu, nhỏ một giọt vào mép lá kính; nhờ sức mao dẫn, dịch sẽ tự động lan tỏa vào mặt trên của lưới đếm Cần lưu ý không để tạo bọt khí trong lưới đếm hoặc làm tràn mẫu xuống rãnh.
Để đếm tế bào, đặt phòng lên bàn kính hiển vi và để yên trong 3 – 5 phút Tiến hành đếm tế bào trong 5 ô lớn chéo nhau, chỉ đếm các tế bào nằm trong lồng ô con và những tế bào nằm trên 2 cạnh liên tiếp cùng chiều Hãy đếm lần lượt từ ô con 1 đến ô con cuối cùng.
- Số lượng tế bào trong 1 ml mẫu nghiên cứu được xác định bằng công thức:
Số tế bào/mL = a x 4000 x 10 3 b x 1/10 -n a : số tế bào trong 5 ô lớn (80 ô con) b : số ô con trong 5 ô lớn (16 ô x 5 = 80 ô con)
10 3 : số chuyển mm 3 thành ml (1000mm 3 = 1ml)
Lưu ý: số tế bào trong 5 ô lớn phải trên 200 mới đảm bảo được mức độ chính xác của phương pháp
2 Xác định gián tiếp số lượng tế bào bằng cách đếm số lượng các khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch
+ Cấy 1 thể tích xác định dịch huyền phù cần nghiên cứu lên môi trường đặc trưng trong đĩa petri
Để xác định số lượng tế bào, chúng ta cần đếm số khuẩn lạc hình thành sau quá trình nuôi cấy, vì mỗi khuẩn lạc đại diện cho sự phát triển của một tế bào.
+ Trước tiên phải ghi độ pha loãng và ngày cấy trên nắp petri
Để thực hiện việc pha loãng dịch huyền phù, cần chuẩn bị các nồng độ khác nhau như 10^-3, 10^-4, 10^-5, v.v Môi trường cần được chuẩn bị trong các ống nghiệm với thể tích khoảng 20 ml, đã được khử trùng và giữ ở trạng thái lỏng bằng cách đặt trong tủ ấm hoặc nồi cách thủy ở nhiệt độ 45 độ C.
+ Dùng pipet vô trùng hút 0,5 hoặc 1ml dịch pha loãng mẫu cho vào đĩa petri vô trùng
+ Sau đó đổ môi trường thạch từ ống nghiệm sang Dùng tay xoay tròn đĩa cho mẫu hòa đều vào môi trường
Chờ cho môi trường đặc lại, sau đó lật úp đĩa và đặt vào tủ ấm với nhiệt độ và thời gian phù hợp Cuối cùng, lấy ra để kiểm tra kết quả.
+ Mỗi mẫu cấy 3 nồng độ liên tiếp Mỗi nồng độ cấy 3 đĩa petri và lấy kết quả trung bình
Việc xác định số lượng khuẩn lạc được thực hiện sau một khoảng thời gian nhất định, tùy thuộc vào tốc độ phát triển của vi sinh vật cần phát hiện trong môi trường Kết quả từ các lần cấy lặp lại sẽ được tổng hợp để tính toán số khuẩn lạc trung bình xuất hiện từ độ pha loãng đó.
Lấy bút mực kẻ 2 đường kính giao nhau ở đáy hộp petri Đếm số khuẩn lạc trong từng vùng và nhớ đánh dấu những khuẩn lạc đã đếm
Số lượng tế bào vi sinh vật trong 1g mẫu được tính như sau:
Số tế bào / gam mẫu = M
M : Số khuẩn lạc trung bình trong 1 đĩa petri
N : Hệ số tính theo khối lượng khô tuyệt đối của mẫu
Độ pha loãng lý tưởng cho việc cấy vi khuẩn và xạ khuẩn trên thạch đĩa là khi đạt được số khuẩn lạc trung bình từ 50 đến 150 Đối với nấm mốc, nồng độ pha loãng phù hợp là từ 30 đến 50 khuẩn lạc.
V THỰC HÀNH VÀ BÁO CÁO KẾT QUẢ
- Thực hành đếm số lượng tế bào nấm men, vi khuẩn trong dịch nuôi cấy ở các nồng độ pha loãng khác nhau
- Thực hành kiểm tra số lượng tế bào nấm men trong mẫu bánh men cơm rượu ở 2 nồng độ 10 -5 , 10 -6
1 Tại sao khi kiểm tra số lượng tế bào vi sinh vật trong một loại mẫu nào đó người ta phải pha loãng mẫu?
2 Kiểm tra số lượng tế bào nấm men trong dịch nuôi cấy bằng cách đếm trên buồng đếm hồng cầu, kiểm tra số tế bào nấm men trong bánh men cơm rượu theo phương pháp đếm số khuẩn lạc Từ đó tính số tế bào nấm men trong 1 ml dịch nuôi cấy và 1g mẫu bánh men?
3 Xác định số lượng tế bào vi khuẩn ở 2 nồng độ pha loãng bằng cách đếm số khuẩn lạc trên môi trường thạch Tính số lượng tế bào vi khuẩn từ 1 ml mẫu ban đầu?
QUAN SÁT HÌNH THÁI VI SINH VẬT DƯỚI KÍNH HIỂN VI 31 I MỤC ĐÍCH YÊU CẦU
- Nắm vững cách sử dụng kính hiển vi quang học, đặc biệt là kỹ năng sử dụng vật kính dầu
- Biết cách làm tiêu bản (tạm thời) và quan sát một số đặc điểm của vi sinh vật dưới kính hiển vi
- Nắm vững phương pháp làm tiêu bản phòng ẩm để quan sát cuống sinh bào tử của nấm mốc
Để thực hiện tiêu bản cố định nhuộm màu và quan sát đặc điểm sinh học của vi sinh vật trên kính hiển vi, cần nắm vững các nguyên tắc và bước thực hiện Quy trình này bao gồm việc chuẩn bị mẫu, cố định vi sinh vật, tiến hành nhuộm màu và cuối cùng là quan sát dưới kính hiển vi để phân tích các đặc điểm hình thái và cấu trúc của vi sinh vật.
- Kính hiển vi, dầu soi
- Que cấy vòng, que cấy móc
- Phiến kính và lá kính sạch
- Hộp petri có chứa phiến kính và lá kính đã vô trùng
- Ống nghiệm chứa nước cất vô trùng
- Pipet 5 ml, 10 ml vô trùng
- 200 ml môi trường PGA vô trùng
- Mẫu cấy của vi khuẩn, nấm men, nấm mốc trên môi trường thạch đĩa
- Tiêu bản nhuộm đơn của vi khuẩn E coli, Bac.subtilis, Streptococcus
- Tiêu bản phòng ẩm nấm sợi: Aspergillus, Penicillium, Mucor, Rhizopus…
- Thuốc nhuộm đơn, nhuộm bào tử, nhuộm gram
- Bình tia, giấy lọc, giấy thấm
- Đèn cồn, que cấy vòng
- Dịch nuôi cấy tế bào vi khuẩn E coli, Bac.subtilis (1 – 2 tuần), nấm men
III QUAN SÁT HÌNH THÁI VI SINH VẬT
1 Quan sát vi sinh vật ở trạng thái sống – làm tiêu bản tạm thời
Là quan sát vi sinh vật ở trạng thái tự nhiên về hình dạng, cấu tạo, sự chuyển động, sự tăng trưởng và phát triển…
1.1 Cách làm làm tiêu bản giọt ép a Đối với vi khuẩn và nấm men
- Cho một giọt nước vô trùng lên phiến kính sạch
- Dùng que cấy vòng lấy một vòng dịch vi khuẩn hoặc nấm men hòa vào giọt nước
- Đậy lá kính lên giọt canh trường thật nhẹ để tránh không tạo bọt khí
- Đặt tiêu bản lên bàn kính hiển vi
- Quan sát ở vật kính 10x và 40x
Nếu giọt dịch nhiều quá, tràn ra ngoài phần tiếp xúc của phiến kính và lá kính ta dùng giấy thấm bớt đi
Khi mẫu ở dạng khuẩn lạc trên môi trường thạch, hãy dùng que cấy vòng chấm nhẹ vào bìa mép khuẩn lạc và hòa vào giọt nước vô trùng đã chuẩn bị trên phiến kính.
Hình 10: Cách làm tiêu bản giọt ép b Đối với nấm sợi và xạ khuẩn
Khi làm tiêu bản từ nấm mốc và xạ khuẩn, cần sử dụng kim dìm khuẩn để đưa vào dịch thấm ướt và tách các sợi ra Sau đó, đậy lá kính lên và quan sát dưới kính hiển vi với vật kính 10x và 40x Lưu ý rằng dịch thấm ướt cho xạ khuẩn là nước, trong khi nấm mốc cần sử dụng dung dịch lactophenol.
Để bảo tồn cấu trúc hệ sợi của nấm mốc và xạ khuẩn, đặc biệt là các cơ quan sinh sản như cuống sinh bào tử và cách đính bào tử, có thể thực hiện tiêu bản bằng phương pháp nuôi cấy trong môi trường ẩm Các bước tiến hành bao gồm:
- Cho vào đĩa petri một tờ giấy thấm, rồi đặt vào một phiến kính Đậy lại, gói giấy và đem hấp khử trùng
- Đun chảy môi trường dinh dưỡng đã khử trùng trong ống nghiệm (môi trường PGA cho nấm mốc và Gause cho xạ khuẩn)
- Mở hé nắp petri ở gần ngọn lửa đèn cồn, đổ thạch trong ống nghiệm lên phiến kính và chờ đông lại
- Lấy nước cất đã vô trùng đổ vào phần giấy thấm, để nước thấm đều tờ giấy (không tràn lên phiến kính)
- Dùng que cấy móc, khều nhẹ vào khuẩn lạc nấm mốc (hoặc xạ khuẩn) rồi chấm lên phần thạch của phiến kính trong phòng ẩm
- Gói cả hộp lại và nuôi ủ ở nhiệt độ thường 2 – 3 ngày (nấm mốc), 5 - 7 ngày (xạ khuẩn)
- Mở hộp petri và lấy phiến kính bên trong ra
Dùng giấy thấm để lau mặt đáy phiến kính, sau đó đậy lá kính lên khu vực có khuẩn lạc mọc Đặt phiến kính dưới kính hiển vi để quan sát mẫu ở trạng thái sống với vật kính có độ phóng đại 10x và 40x.
1.2 Phương pháp làm tiêu bản giọt treo
Loại tiêu bản này có thể theo dõi sự sinh sản, sự hình thành bào tử, khả năng di động … của vi sinh vật Cách tiến hành như sau:
+ Dùng phiến kính đặc biệt có phần lõm hình tròn ở giữa
+ Bôi vazơlin quanh phần lõm của phiến kính
+ Cho một giọt canh trường lên giữa lá kính
+ Cẩn thận úp ngược lá kính lên trên chỗ lõm của phiến kính
+ Được quan sát dưới kính hiển vi
Chú ý: không để giọt canh trường lan rộng hay chạm vào đáy của phần lõm
1.3 Cách làm tiêu bản tạm thời có nhuộm màu
Phương pháp nhuộm này tuân theo nguyên tắc sử dụng thuốc nhuộm ít độc hoặc không độc hại đối với vi sinh vật, được pha loãng ở nồng độ an toàn để đảm bảo tế bào vẫn sống và hoạt động bình thường sau khi nhuộm.
+ Nhỏ một giọt thuốc nhuộm xanh metylen 0,001% lên phiến kính
+ Nhỏ một giọt canh trường lên giọt thuốc nhuộm
+ Đậy lá kính lên giọt dịch
+ Quan sát tiêu bản ở vật kính 10x rồi 40x
2 Quan sát vi sinh vật ở trạng thái chết – làm tiêu bản cố định (tiêu bản vi sinh vật chết nhuộm màu)
Quan sát tiêu bản cố định là một phương pháp phổ biến trong nghiên cứu vi sinh vật học vì nó có ưu điểm sau:
- Thao tác tuy phức tạp nhưng tiêu bản có màu sắc đẹp, giữ được lâu
- Cho phép ta quan sát rõ ràng hình dạng và một số cấu tạo của tế bào cũng như dễ dàng đếm số lượng tế bào vi sinh vật…
- Không sợ bị lây nhiễm khi làm việc với vi sinh vật gây bệnh
Quá trình làm tiêu bản cố định thường qua các bước sau: a Làm vết bôi
- Chọn phiến kính sạch và khô Nếu chưa sạch phải rửa lại
Sử dụng bút chì màu, hãy khoanh một vòng tròn có đường kính từ 1 đến 2 cm trên một bên của phiến kính Sau đó, lật ngược phiến kính lại và đặt lên giá Nếu bạn đã quen với quy trình này, có thể bỏ qua bước lật kính.
Sử dụng que cấy để lấy một giọt canh trường và cho vào vòng đã khoanh Nếu canh trường đặc, hãy dùng que cấy lấy một giọt nước vô trùng và cho lên vòng đã khoanh, sau đó hòa đều một ít khuẩn lạc vi sinh vật với nước.
- Nghiêng que cấy 10 –15 độ, nhẹ nhàng dàn giọt canh trường ra khắp diện tích đã khoanh, không sát mạnh
- Khử trùng que cấy và để vào giá
- Để vết bôi khô tự nhiên
+ Lượng vi sinh vật lấy vừa phải
Vết bôi cần phải được thực hiện một cách tròn, gọn và thật mỏng, đảm bảo rằng vi sinh vật không tập trung tại một điểm hay chồng chất thành nhiều lớp, mà phải được phân phối đều trên bề mặt vết bôi.
+ Kích thước vết bôi vừa phải khoảng 1- 2 cm 2 , bé quá khó quan sát, lớn quá mất thời gian, tốn thuốc nhuộm b Cố định vết bôi
Việc cố định vết bôi nhằm các mục đích sau:
+ Giết chết vi sinh vật để an toàn khi tiếp xúc
+ Gắn chặt vi sinh vật vào phiến kính để lúc nhuộm thì rửa không bị trôi + Làm cho vi sinh vật dễ bắt màu
Một trong những phương pháp cố định đơn giản nhất là sử dụng đèn cồn để hơ nóng Cách thực hiện là kẹp phiến kính giữa hai ngón tay cái và ngón trỏ.
35 qua lại 4 – 5 lần trên phần không nóng lắm của đèn cồn, tránh không để tiêu bản nóng quá
Khi nghiên cứu cấu tạo tế bào, việc cố định bằng cách hơ nóng không mang lại lợi ích, vì vậy cần sử dụng hóa chất để cố định, thường là rượu và axêton Các phương pháp cố định này rất quan trọng trong việc bảo tồn cấu trúc tế bào.
+ Nhúng vết bôi vào rượu Với rượu 95 0 ngâm vết bôi từ 5 – 15 phút Với rượu metylic ngâm khoảng 2 – 5 phút
+ Ngâm vết bôi vào dung dịch axêton trong 5 phút
+ Nhỏ vài giọt rượu 90 – 95 0 lên vết bôi Đốt cháy và dập tắt ngay Làm như vậy vài lần rồi để khô c Nhuộm màu tiêu bản
Nguyên tắc cơ bản trong việc sử dụng thuốc nhuộm là chọn những loại có khả năng thẩm thấu qua màng tế bào, kết hợp với các thành phần khác nhau trong tế bào để tạo ra các hợp chất màu đặc trưng và bền vững.
- Tùy theo mục đích nghiên cứu và khả năng bắt màu khác nhau của các thành phần tế bào mà chọn loại thuốc nhuộm cho phù hợp
- Có hai cách nhuộm chính:
+ Nhuộm đơn giản: chỉ dùng một lọai thuốc nhuộm trên 1 tiêu bản
Nhuộm phức tạp, hay còn gọi là nhuộm kép, là phương pháp sử dụng đồng thời hai hoặc nhiều loại thuốc nhuộm trên một tiêu bản, như nhuộm gram, nhuộm bào tử hay nhuộm tiêm mao Tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu, việc lựa chọn phương pháp nhuộm phù hợp là rất quan trọng để đạt được kết quả chính xác.
Vết bôi đã cố định phải để khô mới đem nhuộm
- Đặt tiêu bản có vết bôi lên cầu thủy tinh (được đặt nằm ngang miệng một bôcan)
- Đặt miếng giấy lọc phủ lên toàn bộ vết bôi
Sử dụng ống nhỏ giọt để nhỏ thuốc nhuộm lên vết bôi một cách đều đặn Cần chú ý không cho quá nhiều thuốc nhuộm và đảm bảo trong suốt quá trình nhuộm, lớp thuốc nhuộm luôn được phủ đều trên vết bôi.
- Thời gian nhuộm tùy tính chất tiêu bản và thuốc nhuộm
- Thường nhuộm ở nhiệt độ phòng Để tăng cường tác dụng của thuốc nhuộm hoặc rút ngắn thời gian ta hơ nóng trên đèn cồn
Sau khi hoàn tất quá trình nhuộm, cần rửa sạch vết bôi bằng cách nghiêng phiến kính và sử dụng bình xịt để cho dòng nước chảy nhẹ nhàng qua vết bôi Tiếp tục rửa cho đến khi nước chảy ra không còn màu sắc.
- Dùng giấy thấm khô tiêu bản hoặc hơ nhẹ tiêu bản trên đèn cồn
- Quan sát tiêu bản ở vật kính 40x rồi chuyển sang vật kính 100x có dầu
Hình 11: Trình tự các bước làm tiêu bản cố định 2.2 Các phương pháp nhuộm tế bào vi sinh vật a Nhuộm đơn giản
Là phương pháp hay dùng trong phòng thí nghiệm, nó cho phép ta nhận định nhanh chóng về hình dạng của vi sinh vật
Tiến hành nhuộm tế bào vi khuẩn E coli, Bac.subtilis, tế bào nấm men theo trình tự như sau:
- Làm vết bôi, để khô tự nhiên
- Cố định bằng cách hơ nhẹ trên ngọn đèn cồn
- Đặt giấy lọc lên vết bôi đã cố định
- Nhỏ vài giọt thuốc nhuộm Fuchsin loãng trong 2 – 3 phút hoặc xanh metylen trong 3 – 5 phút
- Thấm khô bằng giấy thấm
- Quan sát dưới vật kính 100x (có dầu) b Nhuộm phức tạp (nhuộm kép)
