(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư cây đại bi Blumea balsamifera (L.) DC. và cây ngải cứu Artemisia vulgaris L. thuộc họ Cúc Asteraceae

(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư cây đại bi Blumea balsamifera (L.) DC. và cây ngải cứu Artemisia vulgaris L. thuộc họ Cúc Asteraceae(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư cây đại bi Blumea balsamifera (L.) DC. và cây ngải cứu Artemisia vulgaris L. thuộc họ Cúc Asteraceae(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư cây đại bi Blumea balsamifera (L.) DC. và cây ngải cứu Artemisia vulgaris L. thuộc họ Cúc Asteraceae(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư cây đại bi Blumea balsamifera (L.) DC. và cây ngải cứu Artemisia vulgaris L. thuộc họ Cúc Asteraceae(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư cây đại bi Blumea balsamifera (L.) DC. và cây ngải cứu Artemisia vulgaris L. thuộc họ Cúc Asteraceae(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư cây đại bi Blumea balsamifera (L.) DC. và cây ngải cứu Artemisia vulgaris L. thuộc họ Cúc Asteraceae(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư cây đại bi Blumea balsamifera (L.) DC. và cây ngải cứu Artemisia vulgaris L. thuộc họ Cúc Asteraceae(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư cây đại bi Blumea balsamifera (L.) DC. và cây ngải cứu Artemisia vulgaris L. thuộc họ Cúc Asteraceae(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư cây đại bi Blumea balsamifera (L.) DC. và cây ngải cứu Artemisia vulgaris L. thuộc họ Cúc Asteraceae(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư cây đại bi Blumea balsamifera (L.) DC. và cây ngải cứu Artemisia vulgaris L. thuộc họ Cúc Asteraceae(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư cây đại bi Blumea balsamifera (L.) DC. và cây ngải cứu Artemisia vulgaris L. thuộc họ Cúc Asteraceae(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư cây đại bi Blumea balsamifera (L.) DC. và cây ngải cứu Artemisia vulgaris L. thuộc họ Cúc Asteraceae(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư cây đại bi Blumea balsamifera (L.) DC. và cây ngải cứu Artemisia vulgaris L. thuộc họ Cúc Asteraceae(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư cây đại bi Blumea balsamifera (L.) DC. và cây ngải cứu Artemisia vulgaris L. thuộc họ Cúc Asteraceae(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư cây đại bi Blumea balsamifera (L.) DC. và cây ngải cứu Artemisia vulgaris L. thuộc họ Cúc Asteraceae(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư cây đại bi Blumea balsamifera (L.) DC. và cây ngải cứu Artemisia vulgaris L. thuộc họ Cúc Asteraceae(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư cây đại bi Blumea balsamifera (L.) DC. và cây ngải cứu Artemisia vulgaris L. thuộc họ Cúc Asteraceae(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư cây đại bi Blumea balsamifera (L.) DC. và cây ngải cứu Artemisia vulgaris L. thuộc họ Cúc Asteraceae(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư cây đại bi Blumea balsamifera (L.) DC. và cây ngải cứu Artemisia vulgaris L. thuộc họ Cúc Asteraceae(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư cây đại bi Blumea balsamifera (L.) DC. và cây ngải cứu Artemisia vulgaris L. thuộc họ Cúc Asteraceae(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư cây đại bi Blumea balsamifera (L.) DC. và cây ngải cứu Artemisia vulgaris L. thuộc họ Cúc Asteraceae(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư cây đại bi Blumea balsamifera (L.) DC. và cây ngải cứu Artemisia vulgaris L. thuộc họ Cúc Asteraceae(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư cây đại bi Blumea balsamifera (L.) DC. và cây ngải cứu Artemisia vulgaris L. thuộc họ Cúc Asteraceae(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư cây đại bi Blumea balsamifera (L.) DC. và cây ngải cứu Artemisia vulgaris L. thuộc họ Cúc Asteraceae(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư cây đại bi Blumea balsamifera (L.) DC. và cây ngải cứu Artemisia vulgaris L. thuộc họ Cúc Asteraceae

TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Mẫu thực vật

Mẫu cây đại bi - B balsamifera được thu hái tại Vĩnh Phúc vào tháng 5 năm

Vào năm 2016, mẫu tiêu bản TPCN-22 đã được giám định bởi TS Nguyễn Thế Cường thuộc Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật Hiện nay, mẫu tiêu bản này đang được lưu giữ tại Viện Hóa sinh biển và Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật.

Cây đại bi (B balsamifera) và mẫu cây ngải cứu (A vulgaris L) được thu hái tại Bắc Từ Liêm, Hà Nội vào tháng 3 năm 2016 Mẫu cây đã được TS Nguyễn Thế Cường, thuộc Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, giám định Mẫu tiêu bản (TPCN-07) hiện đang được lưu trữ tại Viện Hóa sinh biển và Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật.

Các phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp phân lập các hợp chất

Sắc ký lớp mỏng (TLC) là phương pháp tách hỗn hợp chất thông qua việc sử dụng pha động là chất lỏng di chuyển trên bề mặt pha tĩnh là chất rắn Chất hấp phụ được trải đều trên tấm kính hoặc tấm kim loại, thường là nhôm Quá trình di chuyển qua lớp chất hấp phụ giúp phân tách các thành phần trong hỗn hợp nhờ vào sự hấp phụ khác nhau với dung môi phù hợp, tạo ra sắc đồ trên lớp mỏng Sắc ký lớp mỏng thường được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 hoặc RP18 F254S của Merck Các chất được phát hiện bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm hoặc 365 nm, hoặc bằng cách sử dụng dung dịch sulforic acid 10% phun lên bản mỏng, sau đó sấy khô và hơ nóng để hiện màu.

Sắc ký lớp mỏng điều chế được thực hiện trên bản mỏng Silica gel 60G F254 (Merck, ký hiệu 105875) Phương pháp phát hiện vệt chất sử dụng đèn tử ngoại với hai bước sóng 254 nm và 368 nm, hoặc có thể cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử bằng dung dịch H2SO4.

Để phát hiện vệt chất, hãy làm nóng mẫu lên 10% và ghép lại thành bản mỏng như ban đầu nhằm xác định vùng chất Tiếp theo, cạo lớp Silica gel có chứa chất, thực hiện quá trình giải hấp phụ và tinh chế lại bằng cách kết tinh trong dung môi phù hợp.

Sắc ký cột (CC) là một phương pháp phân tích quan trọng, sử dụng chất hấp phụ chủ yếu là Silica gel với hai loại pha thường và pha đảo Silica gel pha thường có kích thước hạt từ 0,040 đến 0,063 mm (240-430 mesh, Merck), trong khi Silica gel pha đảo ODS (ODS-A, 12 nm S-150 µm, YMC Co., Ltd.) cũng được sử dụng Ngoài ra, nhựa trao đổi ion Dianion HP-20 (Supelco) cũng là một lựa chọn phổ biến trong sắc ký cột để nâng cao hiệu quả tách biệt các hợp chất.

Sắc ký lỏng trung áp (MPLC) được thực hiện tại Viện Hóa sinh biển, thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, sử dụng thiết bị Biotage - Isolera One để phân tách các phân đoạn dịch chiết hiệu quả.

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp quan trọng trong việc phân tích và tinh chế các hợp chất Hệ thống HPLC phân tích Agilent được sử dụng để thực hiện các thí nghiệm, đảm bảo độ chính xác và hiệu quả trong quá trình phân tích.

1200 series và Hệ thống sắc ký lỏng điều chế Preparative HPLC-Agilent 1200 series tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2.2 Các phương pháp xác định cấu trúc

Phương pháp phổ hiện đại kết hợp với việc xác định các thông số vật lý là cách hiệu quả để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất.

Phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS) được thực hiện trên máy AGILENT 1260 series single quadrupole LC/MS tại Viện Hóa sinh biển, thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Phổ NMR đo trên máy Bruker AM500

FT-NMR và AVANCE III HD 500 của Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Chất nội chuẩn là TMS (Tetramethyl silan)

Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng bao gồm:

+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1 H-NMR, 13 C-NMR và DEPT + Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: HSQC, HMBC, 1 H- 1 H COSY, NOESY và ROESY

Dung môi CD3OD được sử dụng trong quá trình đo lường, với lựa chọn dung môi phụ thuộc vào tính chất của mẫu Nguyên tắc chính là dung môi phải có khả năng hòa tan hoàn toàn mẫu cần đo.

- Độ quay cực ([] D ): Độ quay cực được đo trên máy Jasco P-2000 polarimeter của Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Phổ lưỡng sắc tròn (CD) được ghi lại bằng máy đo quang phổ Chirascan của Applied Photophysics, Surrey, UK, tại Viện Hóa sinh biển thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.2.3 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào

2.2.3.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro

Các dòng tế bào ung thư được nuôi cấy trong môi trường DMEM với thành phần bổ sung gồm 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, 1,0 mM sodium pyruvate và 10% fetal bovine serum (FBS) từ GIBCO.

- Tế bào được cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37 o C, 5% CO2

2.2.3.2 Phép thử sinh học xác định tính độc tế bào (cytotoxic assay)

Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro, được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (NCI) công nhận, là tiêu chuẩn để sàng lọc và phát hiện các chất có khả năng ức chế sự phát triển hoặc tiêu diệt tế bào ung thư.

34 thư ở điều kiện in vitro Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Monks

Năm 1991, tại Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, một phép thử đã được tiến hành để xác định hàm lượng protein tế bào tổng số Phép thử này dựa vào mật độ quang học (OD - Optical Density) được đo khi protein tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB) Giá trị OD tỷ lệ thuận với lượng SRB gắn với protein, do đó, khi số lượng tế bào và protein tăng lên, giá trị OD cũng sẽ tăng theo Phép thử được thực hiện trong các điều kiện cụ thể.

Chất thử được kiểm tra ở nồng độ 100 µg/mL Các chất có khả năng ức chế hơn 50% sự phát triển của tế bào sẽ được xác định giá trị IC50 tại các nồng độ khác nhau.

100 g/mL, 20 g/mL; 4 g/mL; 0.8 g/mL và 0.16 g/mL

- Chất thử (20 L) pha trong DMSO 1% được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để có nồng độ nồng độ 100 g/mL, 20 g/mL; 4 g/mL; 0.8 g/mL và 0.16

- Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm

- Thêm vào các giếng thí nghiệm lượng tế bào phù hợp (trong 180 L môi trường) và để chúng phát triển trong vòng từ 3-5 ngày

Một khay 96 giếng không chứa chất thử nhưng có tế bào ung thư (180μl) sẽ được sử dụng làm đối chứng vào ngày 0 Sau 1 giờ, tế bào trong đĩa đối chứng ngày 0 sẽ được cố định bằng Trichloracetic acid (TCA).

Phân lập các hợp chất

2.3.1 Phân lập các hợp chất từ cây đại bi – B balsamifera

Mẫu đại bi - B balsamifera sau khi thu hái được phơi trong bóng râm và nghiền mịn thành 2kg bột Bột này được ngâm trong methanol ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ, sau đó chiết xuất mà không sử dụng siêu âm Dịch chiết được rút ra và quay dưới áp suất giảm để loại bỏ dung môi, thu được phần cao chiết methanol Quá trình này được lặp lại 3 lần với mỗi lần 5 lít methanol, thu được tổng cộng 300 gram phần cặn chiết methanol.

Hình 2.1: Sơ đồ tạo dịch chiết mẫu cây đại bi

Bột khô 2kg (cành, lá, thân)

Bổ sung nước và chiết phân bố lần lượt với các dung môi n-hexane, dichloromethane

(3 lần x 2 lít cho mỗi loại dung môi)

Dịch nước Phần không tan

Cặn chiết methanol được hòa vào nước và chiết xuất lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần như n-hexane và dichloromethane Mỗi dung môi được lặp lại 3 lần, mỗi lần 2 lít, thu được các cặn chiết với khối lượng n-hexane là 39 g và dichloromethane là 45 g, cùng với phần dịch nước và phần không tan.

Kiểm tra vết chất trên sắc ký bản mỏng silica gel và RP18 cho thấy phần cặn dichloromethane và dịch nước có vết rõ nét, trong khi phần cặn n-hexane có vết mờ và ít hơn Do đó, cần tiến hành phân lập các hợp chất từ phần cặn dichloromethane và dịch nước.

Sau khi lọc cặn không tan trong dịch nước, chúng tôi đã sử dụng cột diaion HP-20 và tiến hành rửa giải bằng nước để loại bỏ đường và muối vô cơ Tiếp theo, chúng tôi rửa giải bằng hệ dung môi gradient với tỷ lệ methanol: nước là 50/50, 75/25 và 100% methanol, thu được các phân đoạn W1 (650mg), W2 (8,7g) và W3 (16g) Kết quả kiểm tra cho thấy phân đoạn W1 có lượng ít và vết chất mờ nhạt, trong khi W3 có lượng lớn nhưng vết chất kéo dài không thể tách Chỉ có phân đoạn W2 với các vết chất rõ ràng và đậm nét, cho thấy khả năng tách chất tốt Do đó, chúng tôi sẽ tiến hành phân lập các hợp chất từ phân đoạn W2.

Phân đoạn W2 (8,74g) được tiến hành phân tách bằng sắc ký cột pha đảo RP-

Sử dụng dung môi methanol/nước với tỷ lệ 1/4 đến 1/2, đã thu được 6 phân đoạn chính từ W2A đến W2F Phân đoạn W2B (756 mg) được tách bằng sắc ký cột silica gel pha thường, sử dụng dung môi dichloromethane/methanol/nước với tỷ lệ 7/1/0,05 đến 5/1/0,1, tạo ra các phân đoạn W2B1 đến W2B8 Phân đoạn W2B5 (59 mg) tiếp tục được phân tách bằng sắc ký cột pha đảo RP-18 với dung môi methanol/nước tỷ lệ 1/3, thu được hợp chất BB1 (6 mg) Phân đoạn W2D (2 gam) cũng được tách bằng sắc ký cột silica gel pha thường, rửa giải bằng dung môi dichloromethane/methanol/nước với tỷ lệ 6/1/0,1 đến 4/1/0,1, tạo ra các phân đoạn W2D1 đến W2D8 Phân đoạn W2D7 (177 mg) được phân tách tiếp bằng sắc ký cột pha đảo RP-18 với dung môi methanol/nước tỷ lệ 1/2,5, thu được các phân đoạn W2D7A (36 mg) và W2D7B (54 mg) Phân đoạn W2D7A được tách tiếp bằng sắc ký cột sephadex LH-20, sử dụng dung môi methanol/nước tỷ lệ 1/1, tạo ra hai phân đoạn nhỏ hơn là W2D7A1 (16 mg) và W2D7A2 (5 mg).

Phân đoạn W2D7A1 được tách bằng sắc ký cột pha đảo RP-18 và rửa giải bằng dung môi methanol/nước với tỷ lệ 1/2, thu được hợp chất BB2 (7 mg) Phân đoạn W2C được phân tách bằng sắc ký cột silica gel pha thường, sử dụng dung môi dichloromethane/methanol/nước với tỷ lệ 6/1/0,1 đến 4/1/0,1, tạo ra các phân đoạn W2C1 (110 mg), W2C2 (112 mg), W2C3 (222 mg) và W2C4 (34,4 mg) Phân đoạn W2C1 tiếp tục được tách bằng sắc ký cột sephadex LH-20, rửa giải bằng dung môi methanol/nước tỷ lệ 1/1, thu được các phân đoạn W2C1A (17,6 mg), W2C1B (52,8 mg) và W2C1C (11,1 mg) Phân đoạn W2C1B sau đó được tách tiếp bằng sắc ký cột silica gel pha thường với dung môi dichloromethane/axeton tỷ lệ 2,5/1, thu được hợp chất BB7 (3 mg) Phân đoạn W2C3 được tách bằng sắc ký cột silica gel pha thường, rửa giải bằng dung môi dichloromethane/axeton/nước với tỷ lệ 1/1,5/0,05, cho các phân đoạn W2C3A (106 mg), W2C3B (15,9 mg), W2C3C (19,3 mg), W2C3D (15,5 mg) và W2C3E (24,8 mg) Phân đoạn W2C3A được tách tiếp bằng sắc ký cột silica gel pha thường, rửa giải bằng dung môi ethylacetate/methanol/acid fomic tỷ lệ 13/1/0,01, tạo ra W2C3A1 (28 mg), W2C3A2 (30 mg) và W2C3A3 (11,7 mg) W2C3A1 tiếp tục được tách bằng dung môi dichloromethane/methanol/nước tỷ lệ 6/1/0,1, thu được chất BB4 (7 mg), trong khi W2C3A3 cũng được tách bằng cùng dung môi, thu được chất BB5 (2,2 mg) Cuối cùng, phân đoạn W2F (591 mg) được tách bằng sắc ký cột silica gel pha thường, rửa giải bằng dung môi dichloromethane/methanol tỷ lệ 10/1, tạo ra các phân đoạn W2F1 đến W2F5, trong đó W2F5 (43 mg) được tách tiếp bằng sắc ký cột sephadex LH-20, thu được hợp chất BB6 (24 mg).

Cặn dichloromethane (45 gam) được lọc sạch trước khi đưa lên cột silica gel pha thường Quá trình phân cắt sử dụng hệ dung môi dichloromethane/methanol với các tỷ lệ 100% dichloromethane; 50/1; 20/1; 10/1; 5/1; 2/1 và 100% methanol, tạo ra các phân đoạn từ D1 đến D7 Trong số các phân đoạn, D3 cho thấy nhiều vết chất nhất, do đó chúng tôi tiến hành phân lập chất từ phân đoạn này.

Phần phân đoạn D3 (9,89 gam) được tách ra bằng cách sử dụng cột sắc ký silica gel pha thường Quá trình phân tách diễn ra với hệ dung môi n-hexan và axeton theo các tỷ lệ 5/1, 3/1 và 1/1, tạo ra ba phân đoạn D3A, D3B và D3C.

Phân đoạn D3B (3,27 gam) được tách bằng sắc ký cột pha đảo RP-18, sử dụng dung môi methanol/nước với tỷ lệ 1/1, tạo ra các phân đoạn D3B1 đến D3B7 Tiếp theo, phân đoạn D3B3 (280 mg) được tách bằng sắc ký cột silica gel pha thường, rửa giải bằng dung môi dichloromethane/methanol với tỷ lệ 17/1, cho ra các phân đoạn nhỏ hơn từ D3B3A đến D3B3D Cuối cùng, phân đoạn D3B3A (18 mg) tiếp tục được phân tách bằng sắc ký cột silica gel pha thường và rửa giải bằng dung môi n-hexan/ethylacetate.

Phân đoạn D3B3A1 (11 mg) được thu nhận từ quá trình 1/1,5 và tiếp tục được phân giải bằng phương pháp sắc ký cột sephadex LH-20 Sau khi rửa giải bằng dung môi methanol/nước với tỷ lệ 1/1, hợp chất BB3 (2,4 mg) đã được thu được.

Phân đoạn D3A (2,22 gam) đã được tách bằng sắc ký cột pha đảo RP-18, sử dụng dung môi methanol/nước theo tỷ lệ 1/1, từ đó thu được các phân đoạn D3A1 đến D3A4 Tiếp theo, phân đoạn D3A1 (296 mg) được phân tách bằng sắc ký cột silica gel pha thường với dung môi dichloromethane/methanol theo tỷ lệ 30/1, cho ra các phân đoạn nhỏ hơn từ D3A1A đến D3A1D Cuối cùng, phân đoạn D3A1C (24,6 mg) được tiếp tục tách bằng sắc ký cột pha đảo RP-18 và rửa giải bằng dung môi methanol/nước theo tỷ lệ 1/1, tạo ra các phân đoạn D3A1C1 đến D3A1C3.

Phân đoạn D3A1C3 (11 mg) được tiếp tục xử lý trên cột nhồi silica gel pha thường và rửa giải bằng dung môi n-hexan/ethylacetate với tỉ lệ 1/1,5, thu được hợp chất BB8 (1,8 mg) Đồng thời, phân đoạn D3A1B (15 mg) cũng được tách bằng phương pháp sắc ký cột sephadex LH.

Rửa giải phân đoạn D3A1B1 bằng dung môi methanol/nước theo tỷ lệ 1/1, thu được sản phẩm đầu tiên Sau đó, phân tách tiếp bằng sắc ký cột silica gel pha thường với dung môi n-hexan/axeton theo tỷ lệ 3/1, cho ra phân đoạn D3A1B1.1 Cuối cùng, đưa D3A1B1.1 lên cột sắc ký pha đảo RP-18 và rửa giải bằng dung môi methanol/nước theo tỷ lệ 1,5/1, thu được hợp chất BB9 với khối lượng 3,7 mg.

Hình 2.2: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ dịch chiết nước cây đại bi

Dịch nước cây đại bi

LH-20: sephadex RP-18: sắc ký cột pha đảo

Hình 2.3: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết dichloromethane cây đại bi

LH-20: sephadex RP-18: sắc ký cột pha đảo

Sau khi phân lập 9 hợp chất từ các dịch chiết của cây đại bi, chúng tôi nhận thấy số lượng chất này đã đáp ứng đủ yêu cầu cho luận án, vì vậy chúng tôi quyết định dừng việc phân lập hợp chất tại phân đoạn D3.

2.3.2 Phân lập các hợp chất từ cây ngải cứu A vulgaris

Sau khi thu hái mẫu ngải cứu A vulgaris, chúng được phơi trong bóng râm và nghiền thành bột mịn, thu được 2kg Bột này được ngâm trong methanol ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ, thực hiện 3 lần với 5 lít mỗi lần Dịch chiết sau đó được rút ra và quay dưới áp suất giảm để loại bỏ hoàn toàn dung môi, thu được phần cao chiết methanol Quá trình này được lặp lại để đảm bảo hiệu quả chiết xuất.

Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập được

2.4.1 Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập từ cây đại bi – B balsamifera

2.4.1.1 Hợp chất BB1: Balsamiferoside A (Hợp chất mới)

Chất bột màu trắng Độ quay cực [] 𝐷 20 = -61 (c = 0,05, CH3OH)

Số liệu phổ 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 3.1.1

Tính toán lý thuyết cho cation C16H21Na2O10S + là 451,0640

2.4.1.2 Hợp chất BB2: Balsamiferoside B (Hợp chất mới)

Chất bột màu trắng Độ quay cực [] 𝐷 20 = -65 (c = 0,05, CH3OH)

Tính toán lý thuyết cho cation [C16H27Na2O9S] + là 441,1166

2.4.1.3 Hợp chất BB3: Balsamiferine K (Hợp chất mới):

Chất dạng dầu, không màu Độ quay cực [] 𝐷 20 = +25 (c = 0,05, CH3OH)

Tính toán lý thuyết tính toán lý thuyết cho cation [C20H32NaO7] + là 407,2040)

Chất dạng dầu, không màu

Tính toán lý thuyết CTPT C21H22O10 (M = 434)

2.4.1.5 Hợp chất BB5: (-)angelicoidenol 2-O--D-glucopyranoside

Chất dạng dầu, không màu Độ quay cực [] 𝐷 22 = -36,5 0 (c = 1,0, CH3OH)

2.4.1.6 Hợp chất BB6: (1S,2R,4S)-borneol -D-glucopyranoside

Chất tinh thể, màu trắng Độ quay cực [] 𝐷 24 = – 49,5 0 (c = 0,5, CH3OH)

Chất dạng dầu, không màu Độ quay cực [] 𝐷 20 = -9,5 0 (c = 0,55, CH3OH)

2.4.1.8 Hợp chất BB8: 6,15-epoxy-1,4-dihydroxyeudesmane

Chất dạng bột, màu trắng Độ quay cực [] 16 𝐷 = -25 0 (c = 0,1, CHCl3)

Chất dạng dầu, không màu Độ quay cực [] 𝐷 20 = +35 0 (c = 0,06, CH3OH)

2.4.2 Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập từ cây ngải cứu A vulgaris

2.4.2.1 Hợp chất AV1: Vulgarolide A (Hợp chất mới)

Chất dạng dầu, không màu Độ quay cực [] 𝐷 25 = -25 (c = 0,05, CH3OH)

Tính toán lý thuyết cho cation [C15H21O5] + là 281,13835

2.4.2.2 Hợp chất AV2: Vulgarolide B (Hợp chất mới)

Chất dạng dầu, không màu Độ quay cực [] 𝐷 25 = -11 (c = 0,05, CH3OH)

Tính toán lý thuyết CTPT C15H21O5 (M = 281.1383)

Chất dạng dầu, không màu

Chất dạng dầu, không màu Độ quay cực [] 𝐷 20 = -43,5° (c = 0,35, CH3OH)

2.4.2.5 Hợp chất AV5: (3S,5R,6S,9S)-3,6,9-trihydroxymegastigman-7-ene-3-O--D- glucopyranoside

Chất dạng dầu, không màu Độ quay cực [] 𝐷 22 = -34,5° (c = 0,80, CH3OH)

Chất dạng dầu, không màu Độ quay cực [] 𝐷 25 = +61,4 0 (c = 0,08, CH3OH)

Chất dạng dầu, không màu Độ quay cực [] 𝐷 29 = +21,8 0 (c = 0,1, CH3OH)

Số liệu phổ 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13 C-NMR (125MHz, CD3OD): xem Bảng 3.2.7

2.4.2.8 Hợp chất AV8: pinoresinol glucoside

Chất dạng dầu, không màu Độ quay cực [] 𝐷 25 = -84,6 0 ( c = 0.08, CH3OH)

Chất dạng dầu, không màu Độ quay cực cực [] 𝐷 18 = +20,2 0 ( c = 2,3, CH3OH)

2.4.2.10 Hợp chất AV10.: Syringaresinol glucoside

Chất dạng dầu, không màu Độ quay cực cực [] 𝐷 18 = -5,08 0 ( c = 3,8, CH3OH)

Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được

2.5.1 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập từ cây đại bi – B balsamifera

Các hợp chất từ cây đại bi (B balsamifera) đã được nghiên cứu và cho thấy khả năng gây độc đối với năm dòng tế bào ung thư, bao gồm KB (ung thư biểu mô miệng), HepG2 (ung thư gan), MCF7 (ung thư vú), SK-Mel-2 (ung thư da) và LNCaP (ung thư tiền liệt tuyến).

- human prostate carcinoma) theo phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro được thực hiện như mục 2.2.3

Kết quả sàng lọc sơ bộ cho thấy các hợp chất phân lập từ cây đại bi - Blumea balsamifera có hoạt tính gây độc tế bào ở nồng độ 100 àM, được trình bày chi tiết trong bảng dưới đây.

Bảng 2.5.1.a: % Ức chế sự phát triển tế bào của các hợp chất phân lập từ cõy đại bi – B balsamifera tại nồng độ 100 àM

LNCap HepG2 KB MCF7 SK Mel2

Kết quả sàng lọc của cỏc hợp chất cho thấy, ở nồng độ 100 àM, chỉ cú hợp chất

BB5 và BB9 có khả năng ức chế >50% sự phát triển tế bào ung thư KB, HepG2, MCF7,

SK Mel2, LNCap, các hợp chất còn lại đều có khả năng ức chế < 50%, Do đó, các chất

BB5 và BB9 được tiếp tục thí nghiệm ở các nồng độ khác nhau để xác định giá trị IC50,

Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất BB5 và BB9 được thể hiện qua giá trị phần trăm ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ở các nồng độ thử nghiệm, như được trình bày trong bảng dưới đây.

Bảng 2.5.1.b: Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập từ cây đại bi – B balsamifera

LNCap HepG2 KB MCF7 SK Mel2

Ghi chú: ĐC * : chất đối chứng dương (Ellipticine)

2.5.2 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập từ cây ngải cứu A vulgaris

Các hợp chất chiết xuất từ cây ngải cứu A vulgaris đã được khảo sát khả năng gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư như KB, HepG2, MCF7, SK-Mel-2 và LNCaP Phương pháp thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào in vitro được thực hiện theo hướng dẫn trong mục 2.2.3.

Kết quả sàng lọc sơ bộ cho thấy các hợp chất phân lập từ cây ngải cứu A vulgaris có hoạt tính gây độc tế bào ở nồng độ 100 µg/mL, như được trình bày trong bảng dưới đây.

Bảng 2.5.2.a: % Ức chế sự phát triển tế bào của các hợp chất phân lập từ cõy ngải cứu A vulgaris tại nồng độ 100 àg/mL

Hợp chất Dòng tế bào

KB HepG2 MCF7 SK Mel2 LNCap

Kết quả sàng lọc của cỏc hợp chất cho thấy, ở nồng độ 100 àg/mL, chỉ cú hợp chất

AV1 và AV2 có khả năng ức chế >50% sự phát triển tế bào ung thư KB, HepG2, MCF7,

SK Mel2, LNCap, các hợp chất còn lại đều có khả năng ức chế < 50% Do đó, các chất

AV1 và AV2 được tiếp tục thí nghiệm ở các nồng độ khác nhau để xác định giá trị IC50

Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất AV1 và AV2 được thể hiện qua giá trị phần trăm ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ở các nồng độ thử nghiệm, như trình bày trong bảng dưới đây.

Bảng 2.5.2.b: Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập từ cây ngải cứu A vulgaris

Nếu đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các chất AV1 và AV2 theo đơn vị

M ta có giá trị thu được như bảng dưới đây:

Bảng 2.5.2.c: Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập từ cây ngải cứu A vulgaris

THẢO LUẬN KẾT QUẢ

Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập từ cây đại bi - B balsamifera

3.1.1 Hợp chất BB1: Balsamiferoside A (Hợp chất mới)

Hợp chất BB1, được phân lập dưới dạng bột màu trắng, có công thức phân tử đặc trưng Hình 3.1.1.a minh họa cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của BB1 so với hợp chất so sánh BB1A.

BB1 có công thức hóa học là C16H21NaO10S, được xác định qua sự xuất hiện của pic ion giả phân tử [M+Na]+ tại m/z: 451,0644 trong phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS, gần với giá trị tính toán lý thuyết cho ion [C16H21Na2O10S]+ là 451,0645.

Hình 3.1.1.b Phổ HR-ESI-MS của hợp chất BB1

Phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR của hợp chất BB1 cho thấy các tín hiệu của một vòng thơm bị thế 3 vị trí 1,2,4 [C 146,30 (C-1), 150,97 (C-2), 114,42 (C-3), 136,61 (C-4), 122,08 (C-5) và 118,56 (C-6); H 6,84 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-3), 6,74 (1H, dd, J = 8,0, 2,0 Hz, H-5) và 7,11 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-6)], một nhóm methylene [C 40,74 (C-7); H

3,35 (2H, m, H-7)], một liên kết đôi bị thế 1 vị trí [C 138,99 (C-8) và 115,84 (C-9); H

5,97 (1H, m, H-8) và 5,06 (2H, m, H-9)] và một nhóm metoxi [C 56,79 (OMe); 3,85 (3H, s, OMe)], cho thấy hợp chất này là một dẫn xuất của eugenol

Hình 3.1.1.c Phổ 1 H-NMR của BB1

Hình 3.1.1.d Phổ 13 C-NMR của BB1

Bảng 3.1.1: Số liệu phổ NMR của hợp chất BB1 và các chất tham khảo

1δC: số liệu phổ của hợp chất eugenyl O-β-D-glucopyranoside (BB1A)đo trong CD3OD [83];

2δC: số liệu phổ phần đường β-D-(3-O-sodium sulfo)glucopyranose của hợp chất ptilosaponoside B đo trong CD3OD[84]; δC a,b: số liệu phổ của hợp chất BB1: a đo trong CD3OD, b 125MHz, c 500MHz

Hình 3.1.1.e Phổ HSQC của BB1

Các tín hiệu của đường hexose được ghi nhận tại các vị trí C-1' (102,76 ppm), C-2' (73,54 ppm), C-3' (85,32 ppm), C-4' (70,15 ppm), C-5' (77,68 ppm) và C-6' (62,28 ppm) trong phổ 13C-NMR Các tín hiệu H-NMR tương ứng bao gồm H-1' (4,98 ppm), H-2' (3,69 ppm), H-3' (4,36 ppm), H-4' (3,65 ppm), H-5' (3,47 ppm), Ha-6' (3,73 ppm) và Hb-6' (3,88 ppm) So sánh số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR cho thấy sự phù hợp với các vị trí nguyên tử đã được công bố của hợp chất eugenyl O-β-D-glucopyranoside.

Tín hiệu 13 C-NMR tại vị trí C-3 của BB1 cho thấy sự dịch chuyển mạnh về phía vùng trường thấp, điều này tạo ra sự khác biệt đáng kể so với các tín hiệu của đơn vị đường.

Balsamiferoside A, một hợp chất mới, được xác định là eugenyl 1-O-β-D-(3-O-sodium sulfo)glucopyranoside, với vị trí liên kết của nhóm sulphat tại carbon C-1 được chứng minh qua tín hiệu C 79,0, tương tự như ptilosaponoside B tại C 85,8 Sự tương tác HMBC giữa proton anome H-1 (H 4,98) và carbon C-1 (C 146,3) đã xác nhận vị trí liên kết của đơn vị đường (3-O-sodium sulfo)glucopyranose Phân tích chi tiết các tương tác HMBC khác hỗ trợ việc xác định chính xác cấu trúc hóa học của BB1.

Hình 3.1.1.f Phổ HMBC của BB1

3.1.2 Hợp chất BB2: Balsamiferoside B (Hợp chất mới)

Hợp chất BB2 được phân lập dưới dạng bột màu trắng với công thức phân tử C16H27NaO9S Sự hiện diện của pic ion giả phân tử [M+Na]+ tại m/z 441,1167 trên phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS xác nhận công thức này, trong khi tính toán lý thuyết cho ion [C16H27Na2O9S]+ là 441,1166.

Hình 3.1.2.a Cấu trúc hóa học của hợp chất BB2 và hợp chất tham khảo BB2A

Hình 3.1.2.b Phổ HR-ESI-MS của hợp chất BB2

Hợp chất BB2 có các tín hiệu đặc trưng của đơn vị đường β-D-(3-O-sodium sulfo)glucopyranose trên các phổ 1H-NMR và 13C-NMR, tương tự như hợp chất BB1.

4,37 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1), 3,37 (1H, dd, J = 9,0, 8,0 Hz, H-2), 4,25 (1H, t, J = 9,0 Hz, H-3), 3,55 (1H, t, J = 9,0 Hz, H-4), 3,30 (1H, m, H-5), 3,71 (1H, dd, J = 12,0, 5,5 Hz,

Ha-6) và 3,87 (1H, dd, J = 12,0, 2,0 Hz, Hb-6)

Sự tương tác của proton tại δH 1,65 (δC 30,1) với nguyên tử C-5 (δC 46,1) cùng với sự phù hợp hoàn toàn về số liệu phổ 13 C-NMR và giá trị độ quay cực so với các dữ liệu đã công bố cho phép khẳng định cấu hình tương đối của hợp chất BB7 là 1β,4β,7α-trihydroxyeudesmane, được phân lập từ cây.

Homalomena aromatica là một loài thực vật có hoa thuộc họ Ráy (Araceae) Loài này chứa hợp chất sesquiterpene, một thành phần quan trọng trong lớp chất terpene, và lần đầu tiên được phân lập từ cây đại bi.

3.1.8 Hợp chất BB8: 6,15  -epoxy-1  ,4  -dihydroxyeudesmane

Hình 3.1.8 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất BB8

Phổ 1 H-NMR của hợp chất BB8 (Phụ lục 8) cho thấy tín hiệu proton của ba nhóm methyl tại H 1,04 (3H, s), 0,94 (3H, d, J = 7,0 Hz), 1,00 (3H, d, J = 6,5 Hz); một nhóm oximethylene tại H 3,59 (1H, d, J = 8,5 Hz ) và 3,70 (1H, d, J = 9,0 Hz), hai proton của nguyên tử carbon liên kết với nhóm hydroxyl tại H 3,36 (1H, dd, J = 4,0, 11,5 Hz) và 3,86 (1H, dd, J = 11,5, 9,0 Hz) và tín hiệu của ba nhóm methine cùng bốn nhóm methylene khác

Bảng 3.1.8: Số liệu phổ 1 H và 13 C của hợp chất BB8 và chất so sánh

C DEPT H (dạng pic, J = Hz) HBMC (H C)

#C: độ dịch chuyển 13 CNMR của 6,15-epoxy-1,4-dihydroxyeudesmane được đo ở

90 MHz trong dung môi CDCl3 [91]

C: độ dịch chuyển 13 CNMR của BB8 được đo ở 125MHz trong CD3OD

Phổ 13 C-NMR cho thấy 15 nguyên tử carbon, bao gồm ba nhóm methyl (CH3), năm carbon methine (CH), năm carbon methylene (CH2) và hai carbon không liên kết với hydro Dữ liệu phổ proton được liên kết với số liệu carbon thông qua phổ HSQC, cho phép xác định cấu trúc khung sesquiterpene Các tín hiệu đặc trưng gồm ba nhóm methyl tại C 13,4 (C-14)/H 1,04 (3H, s), C 18,7 (C-12)/H 0,94 (3H, d) và C 21,0 (C-13)/H 1,00 (3H, d) Ngoài ra, có hai tín hiệu của carbon không liên kết với hydro, trong đó một carbon chứa liên kết với nhóm hydroxyl tại C 76,8 (C-4) và carbon còn lại tại C 40,4 (C-10), cùng với một nhóm oximethylene.

Trên phổ 13 C-NMR, tín hiệu tại C 81,3 (C-15) và H 3,59 (1H, d) cùng với H 3,70 (1H, d) cho thấy sự hiện diện của một nhóm methine liên kết với nhóm hydroxyl tại C 81,3 (C-1)/H 3,37 (1H, d) và một nhóm oximethine tại C 77,2 (C-6)/H 3,86 (1H, dd) Ngoài ra, phổ cũng ghi nhận ba nhóm methine và bốn nhóm methylene khác Phổ HMBC chỉ ra sự tương tác giữa nguyên tử H-1 tại H 3,37 với các carbon C-14 (C 13,4), C-2 (C 28,7) và C-10.

40,4), tương tác giữa nguyên tử H-5 tại H 1,06 với C-7 (C 52,5)/C-6 (C 77,2) Đồng thời các tương tác trực tiếp HSQC H/C cho phép qui kết các giá trị phổ 1 H-, 13 C- tại các

77 vị trí này cũng như cho phép xác định cấu trúc đóng vòng tại C-5 và C-10 Tương tác

HMBC khác cho thấy có sự tương tác giữa nguyên tử Hb-15 tại H 3,70 với C-5 (C

Các dữ liệu phổ 1H- và 13C-NMR cùng với các tương tác trực tiếp HSQC H/C cho thấy sự tương thích hoàn toàn, khẳng định cấu trúc đóng vòng giữa C-15 và C-6 thông qua tương tác HMBC giữa H-15 với C-6 Hợp chất BB8 được xác định có cấu hình tương đối là 6,15α-epoxy-1β,4β-dihydroxyeudesmane, đã được phân lập từ cây Ageratina saltillensis và Curculigo capitulata BB8 là một sesquiterpene thuộc lớp chất terpene, lần đầu tiên được phân lập từ cây đại bi.

Hình 3.1.9 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất BB9

Phổ 1 H-NMR của hợp chất BB9 (Phụ lục 9) cho thấy tín hiệu proton của năm nhóm methyl (CH3) trong đó có hai nhóm methyl dưới dạng singlet tại H 1,22 (3H, s), 1,35 (3H, s), và ba nhóm methyl khác dưới dạng douplet tại H 0,95 (3H, d, J = 6,5 Hz), 1,05 (3H, d, J = 6,5 Hz) và 1,20 (3H, d, J = 6,5 Hz); tám proton của bốn nhóm methylene (CH2) tại H 1,72 (1H, dd, J = 13,0, 3,5 Hz ), 2,04 (1H, dt, J = 13,5, 5,0 Hz), 2,40 (1H, dt, J = 7,0, 1,5 Hz), 2,53 (1H, ddd, J = 11,5, 5,0, 2,5 Hz), 1,88 (1H, dd, J = 8,0, 2,0 Hz), 2,15 (1H, dt, J = 7,5, 2,0 Hz ), 4,89 (1H, s), 5,20 (1H, s); năm proton của năm nhóm

78 methine (CH) tại H 3,04 (1H, s), 1,88 (1H, dd, J = 8,0; 2,0 Hz), 4,78 (1H, dt, J = 11,5, 2,0 Hz), 1,91 (1H, m) và 3,90 (1H, dt, J = 13,0, 6,5 Hz)

Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập từ cây ngải cứu A vulgaris

3.2.1 Hợp chất AV1: Vulgarolide A (Hợp chất mới)

Hình 3.2.1.a Cấu trúc hóa học của hợp chất AV1 và chất so sánh AV1A

Hợp chất AV1 được phân lập dưới dạng dầu không màu với công thức phân tử C15H20O5, xác định qua pic ion giả phân tử [M+H]+ tại m/z 281,13868 trên phổ khối lượng HR-ESI-MS Giá trị tính toán lý thuyết cho cation [C15H21O5]+ là 281,13835 Các phổ NMR của AV1 cho thấy đây là một sesquiterpene lactone, thuộc lớp chất chính của các loài trong chi Artemisia.

Hình 3.2.1.b Phổ HR-ESI-MS của hợp chất AV1

Hình 3.2.1.c Phổ 1 H-NMR của AV1

Hình 3.2.1.d Phổ 13 C-NMR của AV1

Bảng 3.2.1 Số liệu phổ 1 H và 13 C của hợp chất AV1 và chất so sánh

C DEPT H (dạng pic, J = Hz) HBMC (H C)

*C: độ chuyển dịch 13 CNMR của chất so sánh 3,4,10-trihidroxy-8-acetoxyguai-1,11(13)- dien-6,12-olide (AV1A) được đo ở 125 MHz trong CDCl3 [97];

C: độ chuyển dịch 13 CNMR của AV1 được đo ở 125MHz trong CD3OD

Hình 3.2.1.e Phổ HSQC của AV1

Hình 3.2.1.f Phổ HMBC của AV1

Phổ NMR 1H và 13C của AV1 cho thấy các tín hiệu đặc trưng của một liên kết đôi bị thế 3 vị trí với các giá trị C 152,5 (C, C-1) và 129,2 (CH, C-2)/H 5,85 (1H, t, J = 2,0 Hz, H-2) Ngoài ra, có một liên kết đôi bị thế 2 vị trí ở đầu mạch với C 141,9 (C, C-11) và 119,2 (CH2, C-13)/H 5,54 và 6,10 (H-13, mỗi 1H, d, J = 3,0 Hz) Hai nhóm oxi methine được xác định với C 81,1 (C-3) và 83,6 (C-6)/H 4,18 (1H, dd, J = 2,0, 1,0 Hz, H-3) và 4,07 (1H, dd, J = 11,5, 9,5 Hz, H-6) Thêm vào đó, có hai carbon bậc 4 liên kết trực tiếp với oxy với C 80,4 (C-4) và 73,1 (C-10), một carbon lacton carbonyl tại C 172,3 (C-12) và hai nhóm methyl vạch đơn với C 31,2 (C-14) và 22,5 (C-15)/H 1,45 (H-14) và 1,40 (H-15), mỗi tín hiệu 3H, s Cuối cùng, các tín hiệu còn lại thuộc về hai nhóm methine với C 59,6 (C-5) và 46,6 (C-7)/H 3,20 (1H, dt, J = 11,5, 1,5 Hz, H-5) và 3,31 (1H, m, H-7), cùng với hai nhóm methylene với C 24,5 (C-8) và 39,1 (C-9)/H 1,51 (1H, m, Ha-8), 2,24 (1H, m, Hb-8), 1,75 (1H, m, Ha-9) và 1,99 (1H, m, Hb-9).

Hình 3.2.1.g Phổ COSY của AV1

Hình 3.2.1.h Phổ NOESY của AV1

Hình 3.2.1.i Các tương tác COSY( ), HMBC ( ) và NOESY ( ) chính của AV1

Hình 3.2.1.j Phổ lưỡng sắc tròn (CD) của AV1

Phân tích chi tiết các tương tác trên phổ COSY giúp ghép nối các hydro H-2/H-3 và H-5/H-6/H-7/H2-8/H2-9, cùng với các tương tác HMBC của H-2 với C-10, H-13 với C-7, C-11 và C-12, H-14 với C-1, C-9 và C-10, cũng như H-15 với C-3, C-4 và C-5, cho phép xác định cấu trúc phẳng của AV1 Cấu hình vòng lacton được xác định qua phổ lưỡng sắc tròn (CD) với hiệu ứng Cotton âm tại 252 nm, tương ứng với chuyển vị n* của cấu trúc -methylene -1actone Sự phù hợp về số liệu phổ 1H và 13C NMR tại các vị trí C-3, C-4 và C-15 với các số liệu của 3,4,10-trihydroxy-11H-guai-1-en-12,6-olide và 3,4,10-trihydroxy-8-acetoxyguai-1,11(13)-dien-6,12-olide cũng được ghi nhận.

Các số liệu từ 88 liệu tại C-10 và C-14 liên quan đến 3,4--epoxy-8-deoxycumambrin B cho thấy cấu hình  của các nhóm OH tại C-3, C-4 và C-10 Nhận định này được xác nhận thêm thông qua phổ NOESY, cho thấy sự tương tác giữa H-15 với H-3 và H-.

Proton H-5 có tương tác NOESY với H-7, xác nhận cấu hình α của proton này Qua các phân tích, cấu trúc hóa học của AV1 được xác định là 3α,4α,10α-trihydroxyguai-1,11(13)-diene-6α,12-olide Hợp chất này thuộc nhóm sesquiterpene, một trong những nhóm chất chính trong lớp terpene của cây ngải cứu, và được đặt tên là vulgarolide A.

3.2.2 Hợp chất AV2: Vulgarolide B (Hợp chất mới)

Hình 3.2.2.a Cấu trúc hóa học của hợp chất AV2 và chất so sánh AV1

Hình 3.2.2.b Phổ HR-ESI-MS của hợp chất AV2

Hợp chất AV2 được phân lập dưới dạng dầu không màu với công thức phân tử C15H20O5 Sự xuất hiện của pic ion giả phân tử [M+H]+ tại m/z: 281,13882 trên phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS cho thấy công thức này, gần với giá trị tính toán lý thuyết cho cation [C15H21O5]+ là 281,13835.

Hình 3.2.2.c Phổ 1 H- NMR của AV2

Hình 3.2.2.d Phổ 13 C- NMR của AV2

Hình 3.2.2.e Phổ HSQC của AV2

Hình 3.2.2.f Phổ HMBC của AV2

Bảng 3.2.2: Số liệu phổ 1 H và 13 C của hợp chất AV2 và chất so sánh

C DEPT H (dạng pic, J = Hz) HBMC (H  C)

#C: độ chuyển dịch 13 CNMR của AV1 được đo 125MHz trong CD3OD

Hình 3.2.2.g Phổ COSY của AV2

Các phổ 1H và 13C NMR của AV2 tương tự như của AV1, với sự xuất hiện các tín hiệu đặc trưng cho liên kết đôi bị thế 3 vị trí tại C 150,6 (C, C-1) và 129,6 (CH, C-2)/H 5,79 (1H, s, H-2), cùng với một liên kết đôi bị thế 2 vị trí ở đầu mạch.

Bài viết mô tả cấu trúc hóa học với các tín hiệu NMR quan trọng: hai nhóm oxi methine tại C 83,7 (C-3) và 84,4 (C-6) với các tín hiệu H-3 (4,41 ppm) và H-6 (4,14 ppm) Ngoài ra, có hai carbon bậc 4 liên kết trực tiếp với oxy tại C 85,1 (C-4) và 73,0 (C-10), cùng với một carbon lacton carbonyl tại C 172,3 (C-12) Hai nhóm methyl với tín hiệu tại C 31,2 (C-14) và 18,3 (C-15) có các tín hiệu H-14 (1,46 ppm) và H-15 (1,37 ppm) Các tín hiệu còn lại thuộc về hai nhóm methine tại C 60,6 (C-5) và 46,6 (C-7).

3,04 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-5) và 3,37 (1H, m, H-7)] và 2 nhóm methylene [C 24,5 (C-

8) và 39,1 (C-9)/H 1,53 (1H, m, Ha-8), 2,25 (1H, m, Hb-8), 1,79 (1H, m, Ha-9) và 1,99 (1H, m, Hb-9)]

Hình 3.2.2.h Phổ NOESY của AV2

Hình 3.2.2.i Các tương tác COSY( ), HMBC ( ) và NOESY ( ) chính của AV2

Hình 3.2.2.j Phổ lưỡng sắc tròn (CD) của AV2

So sánh chi tiết số liệu phổ 13 C-NMR của AV2 với các số liệu phổ tương ứng của

AV1 cho thấy sự phù hợp ngoại trừ sự thay đổi lớn ở các tín hiệu tại C-3, C-4 và C-15

(xem bảng 3,2,2) So sánh số liệu phổ 13 C-NMR tại các vị trí này của AV2 với các số liệu tương ứng của 3,4,10-trihydroxy-8-acetoxyguai-1,11(13)-dien-6,12-olide tại

Các giá trị NMR 81,4 (C-3), 84,9 (C-4) và 17,1 (C-15) cho phép xác định cấu hình  của H-3, điều này được xác nhận qua việc mất tín hiệu tương tác NOESY giữa H-3 và H-15, cùng với sự xuất hiện tương tác yếu giữa H-3 và H-5 Do đó, cấu trúc hóa học của AV2 được xác định là 3,4,10-trihydroxyguai-1,11(13)-diene.

Vulgarolide B, một hợp chất mới được xác định là 6α,12-olide, thuộc nhóm sesquiterpene, là một trong những thành phần chính trong lớp chất terpene của cây ngải cứu.

Phổ 1 H-NMR của hợp chất AV3 (Phụ lục 12) cho thấy tín hiệu proton của nhóm oxymethyl tại H 3,85 (3H, s); tín hiệu proton của một vòng thơm bị thế ở vị trí 1,3,4,5 với tín hiệu dạng singlet tại H 6,60 (s), tín hiệu này có giá trị lớn chứng tỏ vòng thơm có cấu tạo đối xứng Ngoài ra phổ 1 H NMR còn xuất hiện tín hiệu của một đơn vị đường với proton anome tại δ 4,81 (d, J = 7,5 Hz), hằng số tương tác của proton này lớn chứng tỏ cấu hình của liên kết đường có dạng β.

Hình 3.2.3 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất AV3

Phân tích phổ 13 C-NMR cho thấy sự hiện diện của 17 nguyên tử carbon, với các tín hiệu proton được xác định thông qua phổ HSQC Dữ liệu cho thấy sự tồn tại của một hợp chất Phenolic glycoside, với các tín hiệu đặc trưng như hai nhóm oxymethyl tại C 57,0 (H 3,85, s) và các tín hiệu của vòng thơm tại các vị trí 1,3,4,5 với các số liệu cụ thể: C 140,5 (C-1), C 107,5 (C-2/C-6)/H 6,60 (2H, s), C 154,1 (C-3/C-5) và C 134,5 (C-4) Ngoài ra, phổ 13 C-NMR còn ghi nhận các tín hiệu tại C 105,7 (C-1’’)/H 4,81 (1H, d, J = 7,5Hz), C 75,7 (C-2’’)/H 3,49 (1H, dd, J = 9,0, 7,5 Hz), và các tín hiệu khác từ C-3’’ đến C-6’’.

3,69 (1H, dd, J = 11,5, 5,5Hz) và H 3,81 (1H, t, J = 11,5, 2,5Hz) Ngoài ra còn có ba nhóm methylene còn lại tại C 33,4 (C-1’)/H 2,66 (2H, t, J = 15,0Hz), C 35,4 (C-2’)/H

Bảng 3.2.3 Số liệu phổ 1 H và 13 C của hợp chất AV3 và chất so sánh

#C: độ chuyển dịch 13 CNMR của dihydrosyringin được đo ở 125MHz trong CD3OD [99]

Trên phổ HMBC (Phụ lục 12) cho thấy có sự tương tác giữa nguyên tử H-1’’ tại

Các tương tác trực tiếp trong phổ HSQC cho thấy mối liên hệ giữa H-1’/C-1’ và H-4/C-4, cho phép xác định các giá trị phổ 1H và 13C tại các vị trí này là phù hợp Ngoài ra, một số tương tác khác cũng được xác định qua phổ HMBC, như giữa nguyên tử H-2’’ tại H 3,49 tới C-3’’ (C 77,8) và C-1’’ (C 105,7), cũng như giữa nguyên tử H-3’’.

Các giá trị hóa học của H-3,43 tại C-4’’ (δC 71,3) và H-4’’ tại C-5’’ (δC 78,3) cho thấy sự tương tác rõ ràng giữa các nguyên tử Các dữ liệu từ phép đo HSQC H/C xác nhận rằng các giá trị phổ 1H và 13C tại các vị trí trên đường là phù hợp Thêm vào đó, các tương tác HMBC giữa nguyên tử H-2 cũng được thể hiện rõ ràng.

H 6,60 tới C-1 (C 140,5)/C-3 (C 154,1)/C-4 (C 134,5), giữa nguyên tử Hcủanhóm OCH3 tại H 3,85 tới C-3/C-5 (C 154,1), giữa nguyên tử H-1’ tại H 2,66 tới C-1 (C

35,4) Đồng thời các tương tác trực tiếp HSQC H/C cho phép qui kết các giá trị phổ 1 H-,

13C- tại các vị trí là phù hợp (Bảng 3.2.3) Từ các dữ kiện đã nêu, cùng với sự phù hợp

Hợp chất AV3, được xác định là dihydrosyringin, đã được chiết suất từ cây Stixis suaveolens và có số liệu phổ 13 C-NMR hoàn toàn khớp với các số liệu đã công bố Đặc biệt, hợp chất này lần đầu tiên được phân lập từ cây ngải cứu.

Tiêu đề	Nghiên Cứu Thành Phần Hóa Học Và Hoạt Tính Gây Độc Tế Bào Ung Thư Cây Đại Bi - Blumea Balsamifera (L.) Dc. Và Cây Ngải Cứu - Artemisia Vulgaris L. Thuộc Họ Cúc - Asteraceae
Tác giả	Lê Thị Thúy Hằng
Người hướng dẫn	TS. Nguyễn Văn Thanh, TS. Nguyễn Xuân Cường
Trường học	Học viện khoa học và công nghệ
Chuyên ngành	Hóa hữu cơ
Thể loại	luận án tiến sĩ
Năm xuất bản	2021
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	146
Dung lượng	14,07 MB