TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
Phân bố tự nhiên và khả năng sinh trưởng của đối tượng nghiên cứu
1.1.1 Bạch đàn uro (Eucalyptus urophylla S.T.Blake)
Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla) là loài cây có nguồn gốc tự nhiên từ các quần đảo của Indonesia và Đông Timor, đặc biệt là trên các đảo như Flores (Egon và Lewotobi), Adona, Pantar, Wetar và Timor Loài cây này phân bố chủ yếu trong khoảng vĩ độ từ 7°30' đến 10° Nam và kinh độ từ 122°.
Bạch đàn urô phân bố tại các dốc núi và thung lũng ở độ cao từ 300 đến 2960 m so với mực nước biển, chủ yếu trong khoảng 1000 – 2000 m, trên các loại đất bazan, diệp thạch và phiến thạch, thỉnh thoảng xuất hiện ở núi đá vôi Loài cây này phát triển tốt trong điều kiện khí hậu có lượng mưa trung bình hàng năm từ 600 đến 2200 mm, với 2 – 8 tháng khô, nhiệt độ trung bình tối cao đạt 29 °C và tối thấp từ 8 – 12 °C Tại nơi nguyên sản, Bạch đàn urô có thể cao từ 25 đến 45 m, thậm chí lên đến 55 m, với đường kính đạt 1 – 2 m Ở các vùng thấp, Bạch đàn urô thường mọc chung với Bạch đàn E alba (Lê Đình Khả, 2005).
Bạch đàn urô là loài cây có khả năng thích nghi cao với nhiều dạng lập địa và được trồng rộng rãi trên toàn thế giới, bao gồm Indonesia, Malaysia, Australia, Brazil, Nam Phi, Congo và Trung Quốc Tại Việt Nam, cây thích hợp với các vùng đất sâu ẩm ở miền Bắc, Bắc Trung Bộ và Tây Nguyên Các nguồn giống triển vọng cho miền Bắc là Lewotobi và Egon Flores, trong khi Egon Flores cũng là giống tốt cho Tây Nguyên Đối với Bắc Trung Bộ, giống Lembata là lựa chọn phù hợp Sau 8,5 năm canh tác thông thường, các giống này có thể đạt chiều cao 13,2 m, đường kính ngang ngực 11,4 cm và thể tích thân cây lên đến 154,4 dm³.
Hình 1.1 Phân bố tự nhiên của bạch đàn uro (nguồn: Eldridge et al, 1993)
1.1.2 Bạch đàn pellita (Eucalyptus pellita F Muell)
Bạch đàn pellita (Eucalyptus pellita) có 3 vùng phân bố chính, đó là
Bạch đàn pellita phân bố chủ yếu ở các khu vực ven biển từ Irian Jaya của Indonesia, Keru của Papua New Guinea đến Đông bắc Queensland (Qld) của Australia, với độ vĩ tuyến từ 7 đến 19 độ Bắc, tập trung chủ yếu ở 14 – 15 độ Bắc Loài cây này phát triển tốt trong những vùng có lượng mưa hàng năm từ 1200 đến 2300 mm (Harwood, 1998).
Bạch đàn pellita là cây gỗ lớn, có thể cao từ 25 đến 40 m và đường kính vượt quá 1 m ở nơi nguyên sản Trên đất nghèo dinh dưỡng, cây chỉ phát triển thành cây bụi không quá 10 m, trong khi ở các điều kiện tốt có thể đạt chiều cao 30 m Trong rừng trồng, Bạch đàn pellita sinh trưởng nhanh và cho chất lượng gỗ cao, đáp ứng nhu cầu cho nhiều sản phẩm như đồ gỗ trong nhà, đồ gỗ ngoài trời, gỗ xây dựng và ván sàn Loài cây này đã được trồng thành công tại nhiều quốc gia nhiệt đới như Indonesia, Malaysia và Brazil.
Bạch đàn pellita, theo khảo nghiệm ở Việt Nam, cho thấy khả năng sinh trưởng nhanh hơn E tereticornis, đặc biệt tại Đông Hà (Quảng Trị) với các xuất xứ Kuranda và Helenvale (Qld) Ở Lang Hanh (Lâm Đồng), Helenvale (Qld) cũng đạt tốc độ phát triển nhanh Tại vùng Đông Nam Bộ, các xuất xứ này không chỉ sinh trưởng tốt mà còn chưa bị nhiễm bệnh như các loài bạch đàn khác ở giai đoạn 8 - 9 tuổi Vì vậy, Bạch đàn pellita được xem là một trong những loài bạch đàn tiềm năng cho trồng rừng thuần loài gỗ lớn hoặc lai với các loài khác để tận dụng ưu điểm nổi bật của nó.
Khả năng lai giống và tiềm năng sử dụng giống lai giữa Bạch đàn
Bạch đàn pellita có khả năng lai giống với các loài Bạch đàn như E brassiana, E urophylla và E camaldulensis, tạo ra các giống lai ưu việt với tốc độ sinh trưởng nhanh, chất lượng gỗ tốt và khả năng chống chịu sâu bệnh cũng như điều kiện hạn hán hiệu quả (Harwood, 1998).
Nghiên cứu của Glori (1993) cho lai giống giữa các loài Bạch đàn
Eucalyptus pellita, E degluptus và E urophylla đã cho thấy rằng sau 4 năm, các tổ hợp lai E degluptus × E pellita và E pellita × E urophylla có thể đạt chiều cao từ 18,0 đến 19,9 m và đường kính từ 16,0 đến 16,5 cm.
E degluptus là 10,6 m và 9,0 cm; của E pellita 11,0 – 12,3 m và 9,0 - 10,2 cm; của E urophylla là 10,0 m và 8,1 cm
Tại Congo và Philippines, chương trình lai giống E pellita từ Queensland đã được triển khai Công ty PICOP ở Philippines đang thử nghiệm một số tổ hợp lai như E deglupta × E pellita và E urophylla × E pellita (Siarot, 1986 - dẫn từ Harwood, 1998).
E urophylla cũng được quan tâm tại Congo Kết quả khảo nghiệm sau 4 năm thu được chiều cao trung bình tổ hợp lai E pellita × E urophylla đạt 20 m, gia đình tốt nhất của E.urophylla đạt 17 m, trong khi đó xuất xứ Queensland của E pellita tốt nhất là 15 m (Bouvet và Vigneron, 1995)
Nghiên cứu của Mulawarman và cộng sự (2007) tại Indonesia cho thấy giống lai giữa Bạch đàn uro và Bạch đàn grandis với Bạch đàn pellita có tốc độ sinh trưởng nhanh, vượt 20-25% so với các giống bố mẹ Giống lai này được kỳ vọng sẽ tăng tỷ trọng gỗ hơn 10-15% so với rừng trồng E urophylla hay E grandis thuần loài, từ đó nâng cao sản lượng bột giấy Tại Việt Nam, nghiên cứu lai giống Bạch đàn bắt đầu từ những năm 1990, với việc lai giữa Bạch đàn uro, Bạch đàn trắng (E camaldulensis) và Bạch đàn liễu (E exserta) cho năng suất cao gấp 1,5-3 lần so với giống bố mẹ, tùy thuộc vào điều kiện lập địa (Lê Đình Khả, Nguyễn Việt Cường, 2001) Gần đây, giống lai giữa Bạch đàn uro và Bạch đàn pellita cũng cho thấy ưu thế sinh trưởng rõ rệt (Nguyễn Việt Cường, 2005) Đến năm 2000, trong khuôn khổ đề tài “Nghiên cứu lai tạo giống một số loài Bạch đàn, Tràm, Thông và Keo” giai đoạn 2001-2005, Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng đã tạo ra hơn 40 tổ hợp lai giữa các loài Bạch đàn uro, Bạch đàn camal và Bạch đàn tere với Bạch đàn pellita, chủ yếu sử dụng Bạch đàn pellita làm cây bố (Nguyễn Việt Cường và cs, 2006) Kết quả khảo nghiệm cho thấy một số giống lai CP có sinh trưởng nhanh tại miền Đông Nam Bộ và một tổ hợp PU có tốc độ sinh trưởng nhanh nhất tại Ba Vì, Hà Nội.
Trong khuôn khổ dự án Sida-SAREC về cải thiện giống cây rừng, Viện đã thực hiện nghiên cứu lai giữa Bạch đàn uro và Bạch đàn pellita Từ năm 2005 đến 2006, hơn 60 tổ hợp lai UP và PU đã được tạo ra, với nhiều khảo nghiệm hậu thế giống lai được thực hiện tại Hà Nội, Nghệ An, Quảng Trị và Bình Dương Đặc biệt, nhiều tổ hợp lai UP vẫn duy trì sức sống mạnh mẽ và tán lá khỏe trong điều kiện mùa đông lạnh và khô ở Ba Vì, nhờ khả năng chịu hạn tốt từ bộ rễ ăn sâu của Bạch đàn pellita.
Bạch đàn pellita là loài cây có tiềm năng lớn trong việc trồng rừng tại Việt Nam, đặc biệt là ở các vùng trung du miền Bắc, duyên hải miền Trung và Đông Nam Bộ Việc lai giống giữa Bạch đàn pellita với các loài khác có thể mang lại nhiều lợi ích cho ngành lâm nghiệp.
Bạch đàn có khả năng thích nghi tốt với nhiều loại lập địa và thể hiện ưu thế lai lớn về sinh trưởng Đặc biệt, Bạch đàn pellita có tỷ trọng gỗ cao, rất phù hợp cho việc sản xuất gỗ xẻ Do đó, giống lai giữa Bạch đàn pellita và các loài Bạch đàn khác hứa hẹn mang lại ưu thế lai về sinh trưởng và tính chất gỗ tốt, phục vụ cho nhiều mục đích sử dụng khác nhau.
Ưu thế lai thường thể hiện rõ ở đời F1 và có sự phân ly đa dạng ở các đời sau (F2 trở đi) Để sử dụng giống lai hiệu quả, cần chọn lọc cẩn thận các cây lai và tiến hành nhân giống sinh dưỡng, khảo nghiệm dòng vô tính nhằm chọn dòng có ưu thế lai cao nhất Nhân giống sinh dưỡng bằng phương pháp nuôi cấy mô (tissue culture) là giải pháp công nghệ hàng đầu để duy trì ưu thế lai và đảm bảo tính đồng đều về di truyền Quy trình này bao gồm việc nuôi cấy vô trùng các bộ phận thực vật, đặc biệt là mô phân sinh, thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện in vitro Từ một mẫu nuôi cấy, có thể tạo ra hàng triệu cây con đồng nhất về kiểu gen, và cây được tạo ra thường sạch bệnh, trẻ hóa cao, với bộ rễ phát triển tốt Phương pháp nuôi cấy mô đã được áp dụng sớm tại các nước tiên tiến như Pháp, Đức, Brazil, Trung Quốc và ngày càng phổ biến tại Việt Nam.
Khái niệm và cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
Vi nhân giống (micropropagation) là kỹ thuật nuôi cấy mô (tissue culture) được sử dụng để nhân giống thực vật từ các bộ phận nhỏ trong điều kiện vô trùng Quá trình này diễn ra trong ống nghiệm hoặc bình nuôi cấy, giúp tạo ra cây hoàn chỉnh.
Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật là quá trình điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào trong điều kiện nhân tạo vô trùng Quá trình này dựa vào sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào, tận dụng tính toàn năng của tế bào thực vật để đạt được kết quả mong muốn.
1.3.2.1 Tính toàn năng của tế bào
Tất cả các tế bào trong cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi, thể hiện tính toàn năng của tế bào Điều này được nêu rõ bởi Gottlied Haberlandt trong cuốn “Thực nghiệm về nuôi cấy mô tế bào tách rời”.
1.3.2.2 Sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào
Cơ thể sinh vật trưởng thành được cấu thành từ nhiều cơ quan với chức năng đa dạng, tất cả đều bắt nguồn từ một tế bào phôi sinh duy nhất Trong giai đoạn đầu, tế bào phôi sinh trải qua quá trình phân chia để hình thành các tế bào của các mô chuyên hoá, mỗi mô đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể Quá trình phân hoá tế bào này là một bước quan trọng trong sự phát triển của sinh vật.
Quá trình này gồm có các giai đoạn:
(i) Sự phân chia tế bào: Quá trình phân chia tế bào xảy ra trong mô phân sinh làm cho số lượng tế bào tăng lên một cách đáng kể
Sự giãn tế bào là quá trình mà tế bào mở rộng cả theo chiều ngang lẫn chiều dọc, dẫn đến việc tăng kích thước của từng cơ quan cụ thể và toàn bộ cơ thể.
Khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào chuyên biệt, chúng vẫn giữ khả năng biến đổi trong điều kiện thích hợp Chúng có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ, quá trình này được gọi là phản phân hóa tế bào.
Sự phân hoá và phản phân hoá là quá trình điều hoà hoạt hoá gen, trong đó một số gen bị ức chế có thể được kích hoạt để tạo ra tính trạng mới, trong khi một số gen khác ngừng hoạt động Khi tế bào nằm trong một khối mô, chúng thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh Tuy nhiên, khi tế bào được tách ra và gặp điều kiện thuận lợi, các gen sẽ được kích hoạt theo một chương trình đã được mã hoá trong cấu trúc phân tử ADN của mỗi tế bào.
Môi trường dinh dưỡng đóng vai trò then chốt trong sự thành công của quá trình nuôi cấy Các môi trường dinh dưỡng nhân tạo thường được sử dụng cho nuôi cấy mô và tế bào thực vật bao gồm nhiều thành phần thiết yếu.
Các nguyên tố muối khoáng
Các chất điều hoà sinh trưởng (ví dụ: auxin, cytokinin…)
Nghiên cứu về quá trình hình thành cơ quan in vitro đã chỉ ra rằng có ba yếu tố chính ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả: môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy và mẫu được sử dụng trong quá trình nuôi cấy.
Nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.4.1 Ưu nhược điểm của nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.4.1.1 Ưu điểm
Sử dụng mô nuôi cấy có kích thước nhỏ
Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen hiếm, làm vật liệu cho chọn giống Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao
Sản phẩm cây giống đồng nhất dù xuất phát từ cây mẹ có kiểu gen dị hợp hay đồng hợp
Hệ thống sản xuất hoàn toàn trong phòng thí nghiệm giúp tiết kiệm không gian hiệu quả, với mật độ cây trồng trên mỗi đơn vị diện tích cao hơn nhiều so với phương pháp sản xuất truyền thống trên đồng ruộng và trong nhà kính.
Để tạo ra cây con sạch bệnh, cần phải chọn lọc vật liệu ban đầu một cách cẩn thận hoặc xử lý vật liệu này để loại bỏ virus và nấm khuẩn từ các cây giống đã nhiễm bệnh.
Cây con có kích thước nhỏ và dễ dàng vận chuyển, đồng thời được sản xuất trong điều kiện vô trùng, đảm bảo sạch bệnh, mang lại lợi thế lớn trong việc vận chuyển.
Do vậy đáp ứng các qui định về vệ sinh thực vật quốc tế
Sản xuất quanh năm do quá trình sản xuất có thể tiến hành vào bất kỳ thời gian nào, không phụ thuộc vào điều kiện thời tiết, mùa vụ…
Trong bối cảnh kỹ thuật hiện nay, việc nhân giống thương phẩm bằng vi nhân giống vẫn gặp hạn chế về chủng loại sản phẩm Nhiều loại cây trồng có giá trị kinh tế cao hoặc quý hiếm chỉ được áp dụng phương pháp này nhằm bảo tồn nguồn gen.
Chi phí sản xuất cao chủ yếu do yêu cầu về lao động kỹ thuật thành thạo và đầu tư cơ sở vật chất lớn Vì vậy, giá thành sản phẩm vẫn cao hơn so với các phương pháp truyền thống như nhân giống bằng hom hoặc hạt.
1.4.2 Các giai đoạn trong quy trình nuôi cấy mô
Giai đoạn thuần hoá vật liệu nuôi cấy là bước quan trọng giúp cây giống thích nghi với môi trường mới, giảm nguy cơ nhiễm bệnh và tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình nuôi cấy Việc đưa vật liệu nuôi cấy ra khỏi môi trường tự nhiên không chỉ giúp nâng cao khả năng sinh trưởng mà còn đảm bảo an toàn cho mẫu nuôi cấy.
1.4.2.2 Giai đoạn khử trùng mẫu và cấy khởi động
Giai đoạn này nhằm mục đích tạo ra các chồi mới từ mô nuôi cấy Sau khi có nguồn nguyên liệu nuôi cấy, cần tiến hành lấy mẫu và xử lý trong điều kiện vô trùng.
Để khử trùng mẫu cấy, người ta thường sử dụng các hóa chất như HgCl2, Ca(OCl)2, H2O2, tùy thuộc vào loại vật liệu, nồng độ và thời gian khử trùng phù hợp Mô nuôi cấy có thể lấy từ bất kỳ bộ phận nào của cây như thân, rễ, lá hay hoa quả, nhưng theo Bhatt, mô từ các phần non của cây có tỷ lệ thành công cao hơn so với các bộ phận trưởng thành Do đó, chồi đỉnh và chồi nách thường được lựa chọn để nuôi cấy in vitro.
Khi lựa chọn mô nuôi cấy, cần chú ý rằng tuổi sinh lý của mô càng thấp thì khả năng trẻ hóa và tỷ lệ thành công càng cao Mô lấy từ cây trong giai đoạn sinh trưởng mạnh sẽ có khả năng tái sinh tốt hơn Đối với các mẫu dễ bị hoá nâu, có thể bổ sung than hoạt tính hoặc Poly Vinyl Pyrroline (PVP) vào môi trường nuôi cấy Giai đoạn nuôi cấy này cần đảm bảo tỷ lệ mô nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, và mô phải tồn tại và sinh trưởng tốt, thường kéo dài từ 4 đến 6 tuần.
Giai đoạn này là giai đoạn then chốt trong quá trình nhân giống cây trồng, với hệ số nhân dao động từ 5 đến 50 lần tùy thuộc vào loài cây, môi trường và phương pháp nhân Để đạt được hệ số nhân cao, cần lựa chọn môi trường và điều kiện ngoại cảnh phù hợp Vai trò của các chất điều hòa sinh trưởng như auxin và cytokinin là rất quan trọng, giúp sản sinh lượng cây con tối đa mà vẫn đảm bảo sức sống và bản chất di truyền của cây Trong giai đoạn nhân chồi, thường tăng cường cytokinin và giảm auxin để tối ưu hóa quá trình phát triển.
Tỷ lệ auxin/ cytokinin < 1 → tăng cường quá trình tạo chồi
Tỷ lệ auxin/ cytokinin = 1→ cân bằng hai quá trình tạo rễ và chồi
Tỷ lệ auxin/ cytokinin > 1→ tăng cường quá trình tạo rễ
Giai đoạn này yêu cầu tạo ra số lượng cây con tối đa trong thời gian ngắn, đồng thời đảm bảo sức sống và giữ nguyên bản chất di truyền của cây.
1.4.2.4 Tạo cây hoàn chỉnh (cho ra rễ) Đây là giai đoạn chuẩn bị cho cây con chuyển ra ngoài hệ thống vô trùng khi đạt được kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ môi trường nhân chồi sang môi trường tạo rễ Khi tạo rễ cần loại bỏ các chất kích thích tạo chồi, phân chia chồi và thay vào đó là một số loại auxin kích thích tạo rễ
1.4.2.5 Giai đoạn chuyển cây in vitro ra ngoài vườn ươm
Cây con đạt tiêu chuẩn hình thái như số lá, số rễ và chiều cao sẽ được chuyển từ ống nghiệm sang nhà kính hoặc nhà lưới, sau đó tiếp tục được đưa ra vườn ươm.
Vườn ươm cây cấy mô cần có môi trường mát mẻ, ánh sáng thấp và độ ẩm cao Cây con thường được trồng trong luống ươm với cơ chất thoát nước tốt, tơi xốp và giữ ẩm hiệu quả Trong 7-10 ngày đầu sau khi cấy, cần phủ nilon để giảm thiểu quá trình thoát nước ở lá, giúp cây con phát triển khỏe mạnh.
1.4.3 Các nhân tố ảnh hưởng tới quá trình nuôi cấy mô
Trong nuôi cấy in vitro, môi trường nuôi cấy và điều kiện bên ngoài được xem là vấn đề quyết định sự thành bại của quá trình nuôi cấy
Thời gian đầu các nhà cấy mô sử dụng các môi trường tự nhiên có nguồn gốc thực vật (dịch chiết lá, nước nội nhũ )
Việc xây dựng môi trường nuôi cấy cho cây trồng cần xem xét các thành phần thiết yếu cho sự sinh trưởng và phát triển, vì chỉ sử dụng nước chiết là không đủ Kể từ những năm 1920, đã có nhiều nghiên cứu áp dụng môi trường dinh dưỡng tổng hợp Bên cạnh muối khoáng và nguồn carbon, môi trường còn cần bổ sung vitamin và một số chất dinh dưỡng khác để đảm bảo hiệu quả tối ưu cho sự phát triển của cây.
Thành tựu của công nghệ nuôi cấy mô trong công tác nhân giống cây lâm nghiệp
Trong những năm gần đây, nhiều quốc gia trên thế giới như Thụy Điển, Úc, Brazil, Trung Quốc và Thái Lan đã áp dụng công nghệ tế bào thực vật tiên tiến trong công tác giống cây rừng.
Số lượng loài Bạch đàn được nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy in vitro ngày càng gia tăng, với hơn 20 loài thành công vào năm 1987 Các nhà khoa học Ấn Độ đã tạo ra cây mô từ các cây trội như Eucalyptus camandulensis, E globulus, E tereticornis và E torelliana Cây mô có nguồn gốc từ cây ưu việt có tốc độ sinh trưởng nhanh gấp 3 lần và đồng đều hơn so với cây mọc từ hạt cùng mẹ.
Trung Quốc đã đạt được thành công lớn trong việc nhân giống cây thân gỗ bằng phương pháp nuôi cấy mô in vitro, với hơn 100 loài như Dương, Bạch đàn, Tếch và Bao đồng Kể từ năm 1991, quốc gia này đã triển khai rộng rãi kỹ thuật nuôi cấy mô, sản xuất hơn 1 triệu cây mô từ các giống cây và dòng lai được chọn lọc tại vùng Nam Trung Quốc Những cây mô này không chỉ được sử dụng để tạo giống cây đầu dòng tại các vườn ươm địa phương mà còn được trực tiếp trồng rừng, góp phần quan trọng vào việc phát triển rừng bền vững.
Tác giả Darus H Ahmas, thuộc Viện nghiên cứu Lâm nghiệp Malaysia đã nuôi cấy in vitro cây Keo tai tượng (Acacia mangium) bằng môi trường
MS được bổ sung 3% sucrose, 0,6% agar và 0,5 mg/l BAP cho giai đoạn nhân chồi Chồi có chiều cao trên 0,5 cm được cấy vào môi trường tạo rễ, trong đó chất điều hòa sinh trưởng tốt nhất cho quá trình này là IBA 1000 ppm, đạt tỷ lệ ra rễ 40%.
Các biện pháp nuôi cấy mô đã được áp dụng thành công cho cây Tếch (Tectona grandis), với Gupta và các cộng sự (1979) mô tả khả năng hình thành cụm chồi từ phần cắt của cây non và mầm cây 100 tuổi Họ đã tạo ra 500 cây in vitro từ một chồi của cây trưởng thành và 3000 cây từ một cây non trong một năm Năm 1986, Thái Lan cũng phát triển thành công kỹ thuật nuôi cấy mô cho cây Tếch, cho phép sản xuất 500.000 chồi từ một chồi trong một năm (Ikemori, Y.K., 1987).
(1991) đã thử nghiệm và nuôi cấy mô thành công đối với loài Tếch và một vài cây mô đã được đem trồng thử
W Nitiwattanachai và cộng sự (1990) đã nuôi cấy thành công cây keo lá tràm (Acacia auriculiformis) Môi trường nhân nhanh chồi là MS (1962) +
10 μM BAP + 0,5 μM IBA, môi trường sử dụng cho ra rễ là White (1963) + 2 μM IBA + 1 μM NAA
Nhiều loài cây lá rộng Châu Âu như Acer, Beluta, Fagus, Quercus, và Carpinus đã được nhân giống thành công bằng phương pháp nuôi cấy mô Các cây mô này đã được trồng ra thực địa và cho thấy kiểu hình tương đối giống nhau Tỷ lệ sống ở rừng trồng sau khi cây được huấn luyện đạt khá cao, có thể lên tới 90% đến 100% cho một số loài.
Nuôi cấy in vitro là một phương pháp nhân giống hiệu quả cho các loài cây lá kim, hỗ trợ các chương trình trồng rừng vô tính Một số loài Thông như Pinus nigra, P caribaea, và P pinaster đã được nuôi cấy thành công Đến nay, có khoảng 30 loài cây lá kim được nghiên cứu nuôi cấy mô, trong đó nổi bật là các loài Bách tán (Araucaria), Liễu sam (Cryptomeria japonica), và Bách xanh Trong số này, bốn loài đã được đưa vào sản xuất rộng rãi, bao gồm Cù tùng (Sequoia sempevirens) tại Pháp và Thông P radiata tại Viện nghiên cứu Lâm nghiệp New.
Dilân, bao gồm Thông P taeda và Pseudotsuga menziesii, đã được nghiên cứu tại Mỹ Phi lao là một trong những loài cây thành công trong việc nhân giống qua phương pháp nuôi cấy mô, được so sánh với cây hạt trong nhà kính Mục tiêu là tạo ra cây mô Phi lao có khả năng sinh trưởng nhanh, kháng bệnh tốt và khả năng cố định đạm cao, phục vụ cho việc trồng rừng hiệu quả.
Hiện nay, nhiều cơ sở đang tiến hành nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô quy mô lớn trong lĩnh vực Lâm nghiệp tại Việt Nam Các cơ sở tiêu biểu bao gồm Viện nghiên cứu Giống và Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy Phù Ninh, Công ty giống Lâm nghiệp Trung ương, Trung tâm khoa học sản xuất Lâm nghiệp Quảng Ninh, Xí nghiệp giống Thành phố Hồ Chí Minh và Trường đại học Lâm nghiệp.
Hiện nay, nhiều tỉnh và địa phương đã thành lập phòng nuôi cấy mô nhằm hỗ trợ công tác giống cây trồng, qua đó đạt được những thành công bước đầu trong lĩnh vực này.
Nuôi cấy mô đã trở thành phương pháp phổ biến trong nhân giống các giống Bạch đàn nhập nội, Bạch đàn lai và Keo lai với năng suất cao tại Việt Nam Viện nghiên cứu Giống và công nghệ sinh học Lâm nghiệp đã thành công trong việc phát triển kỹ thuật nuôi cấy in vitro cho Keo lai, Bạch đàn và nhiều giống cây rừng khác, góp phần cải thiện chất lượng giống cây trồng.
Dương Mộng Hùng (1993) đã nghiên cứu nuôi cấy mô cho hai loài Bạch đàn E camaldulensis và E urophylla, tạo ra một số cây mô với hệ số nhân chồi từ 1-2 lần Đoàn Thị Mai và cộng sự (2000) cũng thành công trong việc nuôi cấy mô giống Bạch đàn lai U29C3, với kết quả cho thấy thời kỳ mẫu bị nhiễm ít nhất và tỷ lệ bật chồi cao nhất từ tháng 5 đến tháng 8 Môi trường MS bổ sung 0,5mg/l BAP đạt số chồi trung bình cao nhất là 16,6 chồi/cụm, trong khi môi trường ra rễ thích hợp là môi trường MS bổ sung 1,0mg/l IBA, cho tỷ lệ ra rễ lên tới 83,8%.
Vũ Ngọc Phượng và cộng sự (Viện sinh học nhiệt đới) năm 2002 đã công bố nghiên cứu nhân giống in vitro thành công cho cây Tre tàu
Nghiên cứu về Sinocalamus latiflorus và Dendrocalamus asper cho thấy mẫu vật được khử trùng bằng Ca(OCl)2 và HgCl2, sau đó tạo chồi tốt trên môi trường MS bổ sung BAP 3 mg/l và Kinetin 1 mg/l Môi trường nhân chồi tối ưu là MS với BAP 2 mg/l và Kinetin 1 mg/l, trong khi môi trường ra rễ hiệu quả nhất là MS bổ sung IBA 10 mg/l Đoàn Thị Mai và cộng sự (2005) đã phát triển môi trường nhân chồi cho cây Trầm với 1,0 mg/l BAP và 0,5 mg/l Kinetin, cùng với môi trường ra rễ tối ưu là MS cải tiến bổ sung 2,0 mg/l IBA Đoàn Thị Ái Thuyền và cộng sự (2005) đã thành công trong nhân giống cây Hông bằng nuôi cấy mô tế bào, sử dụng môi trường MS cải tiến với 30 g/l đường, 8 g/l Agar, 5 mg/l BAP và 0,1 mg/l NAA cho tạo chồi, trong khi môi trường ra rễ tối ưu là MS + 20 g/l đường + 0,1 mg/l NAA + 1,0 g/l than hoạt tính Cuối cùng, Đoàn Thị Nga từ viện nghiên cứu nguyên liệu giấy Phù Ninh - Phú Thọ đã nghiên cứu nuôi cấy mô cây bạch đàn dòng PN2, với môi trường nhân nhanh là MS + 0,5 mg/l BAP + 0,25 mg/l NAA và môi trường ra rễ tối ưu là 1/4MS + 1 mg/l IBA.
Hồ Văn Giảng và cộng sự (2006) đã phát triển quy trình nhân giống cây Dó bầu thông qua kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào Môi trường tối ưu cho việc nhân chồi được xác định là MS cải tiến kết hợp với 0,3 mg/l BAP, 20 g đường và 6 g/l agar, cho hệ số nhân chồi đạt 4,2 chồi mỗi cụm.
Nghiên cứu của Đoàn Thị Mai và cộng sự (2010) đã chỉ ra rằng việc sử dụng môi trường WPM kết hợp với 0,3 mg/l NAA, 20 g/l đường và 6 g/l agar giúp tỷ lệ ra rễ đạt 88,7% và tỷ lệ cây mô sống đạt 98% khi đưa ra ngoài Đặc biệt, quy trình nhân giống cho Keo lai (bao gồm Keo lai tự nhiên và Keo lai nhân tạo), Bạch đàn và Lát hoa đã được thực hiện thành công Đối với Keo lai, môi trường nhân chồi được sử dụng là MS* với 1,5 mg/l BAP; môi trường tiền ra rễ là MS* với 1,5 mg/l BAP và 0,5 mg/l NAA; và môi trường ra rễ tối ưu là 1/2MS với 1,5 mg/l IBA.
Với Bạch đàn có môi trường nhân chồi là MS* + 0,5 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA; môi trường ra rễ tối ưu là: 1/2MS + 1,5 mg/l IBA + 0,1 mg/l
Mục tiêu nghiên cứu
Để nâng cao quy trình nhân giống bạch đàn lai mới được công nhận là giống tiến bộ kỹ thuật, việc áp dụng nuôi cấy mô tế bào là rất cần thiết Điều này sẽ tạo nền tảng vững chắc cho việc phát triển và mở rộng trồng trọt bạch đàn ở các vùng sinh thái phù hợp trên toàn quốc.
- Xác định được môi trường phù hợp để nhân giống hai dòng Bạch đàn lai: UP54 và UP99 bằng phương pháp nuôi cấy mô
- Tạo ra cây con hoàn chỉnh cho hai dòng Bạch đàn lai: UP54 và UP99 bằng phương pháp nuôi cấy mô.
Đối tƣợng nghiên cứu
Hai dòng bạch đàn lai sinh trưởng nhanh là: UP54 và UP99
Nội dung nghiên cứu
Để đạt được mục tiêu nghiên cứu trên, đề tài thực hiện các nội dung nghiên cứu sau:
- Nghiên cứu phương pháp khử trùng: loại hóa chất, nồng độ, thời gian và mùa vụ thích hợp
- Nghiên cứu môi trường nuôi cấy cơ bản và chế độ nuôi thích hợp
- Nghiên cứu môi trường nhân chồi thích hợp
- Nghiên cứu môi trường ra rễ tối ưu và phương pháp huấn luyện, mùa vụ thích hợp để đưa cây từ nuôi cấy mô ra vườn ươm.
Phương pháp nghiên cứu
Chồi bánh tẻ được thu từ cây vật liệu gốc từ 1 đến 1,5 tuổi, có khả năng sinh trưởng tốt và không bị sâu bệnh Những chồi này đã được xử lý để tạo chồi tại vườn ươm của Viện Nghiên cứu Giống và Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp, P Đức Thắng, Q Bắc Từ Liêm.
2.4.2 Địa điểm và điều kiện bố trí thí nghiệm Địa điểm nghiên cứu: Tại Bộ môn Công nghệ tế bào thực vật- Viện nghiên cứu Giống và CNSH lâm nghiệp, thuộc Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam Điều kiện thí nghiệm:
+ Số giờ chiếu sáng 10 - 12h/ngày
+ Cường độ chiếu sáng khoảng 2000- 3000Lux
+ Các dụng cụ sử dụng và môi trường nuôi cấy được hấp khử trùng ở điều kiện áp suất 1,2atm, nhiệt độ 120 – 130 0 C trong thời gian 20 – 40 phút
+ Độ pH của môi trường nuôi cấy 5,6 – 5,8
2.4.3 Phương pháp tiến hành Áp dụng có cải tiến quy trình nhân giống bằng nuôi cấy mô bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cho các đối tượng cây rừng khác như các loài Bạch đàn, các loài Keo, Xoan, Tếch… đã được thực hiện thành công bởi nhóm cán bộ nghiên cứu thuộc Viện NC Giống và CNSH lâm nghiệp từ nhiều năm qua (theo Lê Đình Khả, Hà Huy Thịnh, Nguyễn Ngọc Tân, Đoàn Thị Mai) Phương pháp này bao gồm các bước được mô tả sau đây:
+ Vật liệu ban đầu là các đoạn chồi dài 10 -15cm được cắt vào buổi sáng và ngâm ngay vào trong nước để tránh hiện tượng mất nước
Để chuẩn bị mẫu vật, trước tiên, bạn cần cắt bỏ lá và rửa sạch dưới vòi nước chảy bằng chổi lông mềm Sau đó, hãy sử dụng chất tẩy nhẹ như nước rửa chén hoặc xà phòng để làm sạch vật liệu, rồi rửa lại lần nữa dưới vòi nước chảy để đảm bảo không còn bụi bẩn.
+ Tráng mẫu vật bằng cồn 70% trong khoảng 1phút sau đó tráng lại nước cất khử trùng 2 - 3 lần
+ Ngâm trong dung dịch khử trùng ở các khoảng thời gian khác nhau từ
2 – 20 phút tùy loại hóa chất tiếp đó dùng nước cất tráng lại 3 - 5 lần bằng nước cất đã được hấp khử trùng
+ Dùng panh và dao cắt vật liệu thành các đoạn mẫu dài 2 - 4cm, có ít nhất 1 mắt ngủ rồi cấy vào môi trường tái sinh chồi ban đầu
2.4.3.2 Tái sinh chồi ban đầu từ mẫu nuôi cấy
Để nuôi cấy mô hiệu quả, cần sử dụng các môi trường nuôi cấy phổ biến như WPM, MS và B5, với thành phần bổ sung 7g/l agar và 30g đường Đồng thời, pH của các môi trường này được điều chỉnh trong khoảng 5,6 - 5,8.
Sau khi lựa chọn môi trường tái sinh chồi ban đầu tối ưu, tiến hành các thí nghiệm để đánh giá ảnh hưởng riêng lẻ và kết hợp của Cytokinin và Auxin, nhằm xác định môi trường nhân chồi lý tưởng cho từng đối tượng nghiên cứu.
2.4.3.4 Tạo rễ và huấn luyện
Giai đoạn chuyển mẫu nuôi cấy từ môi trường nhân nhanh chồi sang môi trường tạo rễ là bước quan trọng để phát triển cây hoàn chỉnh Những chồi đạt tiêu chuẩn sẽ được nuôi cấy trong môi trường ra rễ, sau đó được huấn luyện để thích nghi với điều kiện sống bên ngoài.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
Xác định phương pháp khử trùng thích hợp
Để quy trình nhân giống in vitro đạt hiệu quả, việc lấy mẫu là bước quan trọng Mẫu cần được thu thập từ môi trường bên ngoài và phải được khử trùng kỹ lưỡng để loại bỏ các vi sinh vật như nấm mốc và vi khuẩn có trên bề mặt, đảm bảo mẫu sạch trước khi đưa vào nuôi cấy vô trùng.
Hiện nay, phương pháp hóa học là cách phổ biến để vô trùng mẫu cấy, sử dụng các hóa chất diệt khuẩn như NaClO, Ca(OCl)2, HgCl2, H2O2, AgNO3 và các loại kháng sinh trong nuôi cấy mô tế bào thực vật.
Để chọn hóa chất cho quá trình vô trùng mẫu cấy, cần đảm bảo hai yếu tố chính: khả năng diệt vi sinh vật hiệu quả và độc tính thấp đối với mẫu cấy Ngoài ra, hóa chất cũng phải giúp giảm tỷ lệ nhiễm và tăng tỷ lệ mẫu sống cũng như tỷ lệ bật chồi hữu hiệu.
Theo nghiên cứu của Đoàn Thị Mai và cộng sự (2011), hóa chất HgCl2 và Ca(OCl)2 là hai loại có hiệu quả khử trùng tốt nhất Do đó, nghiên cứu này áp dụng hai loại hóa chất này để khử trùng mẫu vật, đồng thời điều chỉnh thời gian và nồng độ nhằm xác định phương pháp khử trùng phù hợp nhất cho từng đối tượng nghiên cứu.
Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu nhiễm và tỷ lệ mẫu bật chồi hữu hiệu Trong số đó, tỷ lệ bật chồi hữu hiệu là chỉ tiêu quan trọng nhất, ảnh hưởng đến quyết định về hóa chất, nồng độ và thời gian khử trùng được lựa chọn.
3.1.1 Ảnh hưởng của hóa chất, nồng độ và thời gian tới kết quả khử trùng
Kết quả thí nghiệm khử trùng mẫu từ tháng 4 – 6 trong năm cho bạch đàn lai UP54 và UP99 được tổng hợp ở bảng 3.1 sau đây:
Tỷ lệ bật chồi hữu hiệu (%)
Tỷ lệ bật chồi hữu hiệu (%)
TB Sd TB Sd TB Sd TB Sd TB Sd TB Sd
Các công thức thí nghiệm ảnh hưởng không đồng đều đến kết quả khử trùng của hai dòng UP54 và UP99 (Ftính > F05) (Bảng 3.1)
Cả 2 dòng bạch đàn lai UP54 và UP99 khi khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 7 phút cho hiệu quả cao nhất, với tỷ lệ bật chồi hữu hiệu lần lượt là là
9,75% và 11,2%; thấp nhất khi khử trùng bằng Ca(OCl) 2 5 % trong 5 phút với tỷ lệ bật chồi hữu hiệu chỉ là 6,12 % cho UP54 và 6,11 % cho UP99
Tỷ lệ bật chồi hữu hiệu là chỉ tiêu quan trọng nhất để đánh giá hiệu quả khử trùng Trong một số trường hợp, dù mẫu có tỷ lệ nhiễm thấp nhưng tỷ lệ bật chồi hữu hiệu không cao nên không được chọn Tuy nhiên, có những trường hợp mà kết quả này vẫn có thể chấp nhận, chẳng hạn như với 4 công thức: HgCl2 0,05 % trong 9 phút, HgCl2 0,1 % trong 9 phút, Ca(OCl)2 5 % trong 20 phút và Ca(OCl)2 10 % trong 20 phút, bởi tỷ lệ bật chồi hữu hiệu đạt trên 7 %, mặc dù tỷ lệ mẫu nhiễm không dưới 30 %.
Dựa trên kết quả thí nghiệm về ảnh hưởng của hóa chất, nồng độ và thời gian đến hiệu quả khử trùng cho hai dòng bạch đàn lai UP54 và UP99, nghiên cứu đã rút ra một số nhận xét quan trọng.
Khử trùng bằng HgCl2 cho thấy hiệu quả cao nhất đối với bạch đàn lai UP54 và UP99, cũng như một số loại cây rừng khác như keo lai Nghiên cứu của Đoàn Thị Mai và cộng sự (2011) đã chỉ ra rằng HgCl2 có tác dụng rõ rệt trong quá trình khử trùng mẫu vật.
Nồng độ hóa chất khử trùng càng cao thì tỷ lệ mẫu nhiễm bệnh càng giảm, cho thấy việc sử dụng nồng độ hóa chất phù hợp sẽ nâng cao hiệu quả loại trừ nguồn bệnh.
Thời gian khử trùng đóng vai trò quan trọng trong thành công của mẫu thí nghiệm; nếu thời gian không đủ, hóa chất không thể tiêu diệt hoàn toàn nguồn bệnh, trong khi thời gian quá dài có thể làm hư hại cấu trúc tế bào và giảm khả năng tái sinh chồi Ngoài ra, yếu tố như tuổi và vị trí lấy mẫu cũng ảnh hưởng đáng kể đến kết quả khử trùng Do đó, việc lựa chọn chế độ khử trùng phù hợp cho từng đối tượng nghiên cứu là rất cần thiết, vì mỗi loại mẫu sẽ có phản ứng khác nhau với các hóa chất khử trùng.
Hình 3.1 Cây vật liệu dùng để vào mẫu, sau khi đã được tuyển chọn dẫn giống về trồng ở vườn ươm
Hình 3.2 Các chồi bất định Bạch đàn lai UP54 và UP99 sau 25 ngày khử trùng
3.1.2 Ảnh hưởng của thời điểm lấy mẫu trong năm tới kết quả khử trùng
Thời điểm lấy mẫu trong năm ảnh hưởng lớn đến khả năng tái sinh chồi ban đầu Do đó, nghiên cứu đã tiến hành thí nghiệm khử trùng vào các mùa: xuân, hạ, thu và đông để xác định thời điểm thích hợp cho việc lấy mẫu ở các đối tượng Bạch đàn.
Kết quả thí nghiệm cho thấy, trong khoảng thời gian từ tháng 7 đến tháng 9 (hạ - thu), hai dòng UP54 và UP99 đạt hiệu quả khử trùng và bật chồi tốt nhất với tỷ lệ mẫu bật chồi là 15,76% và tỷ lệ mẫu nhiễm dưới 43%, thời gian bật chồi là 28 ngày Tháng 4 đến tháng 6 (xuân – hạ) có tỷ lệ bật chồi là 12,53%, nhưng tỷ lệ mẫu nhiễm tương đối cao 52,56%, mặc dù thời gian bật chồi nhanh hơn một ngày (27 ngày) Ngược lại, các mẫu thu thập vào mùa đông đến mùa xuân năm sau cho kết quả kém hơn rõ rệt, với tỷ lệ nảy chồi chỉ đạt từ 3,24 đến 4,25%, do mùa khô làm cây sinh trưởng chậm và các chồi thường ở trạng thái ngủ nghỉ sinh lý, cùng với sự xuất hiện của bệnh bạc lá và một số nấm bệnh khác, ảnh hưởng đến quá trình khử trùng mẫu vật.
Bảng 3.2 Ảnh hưởng của mùa vụ đến khả năng tái sinh chồi cho bạch đàn lai
UP54 và UP99 (sau 25 ngày khử trùng)
Tháng Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ bật chồi hữu hiệu (%) Thời gian bật chồi
Việc chọn thời điểm vào mẫu trong năm phụ thuộc vào quá trình sinh trưởng và sinh lý của cây giống, điều này quyết định hiệu quả của khử trùng và khả năng phân hoá tế bào, từ đó hình thành các cụm chồi hữu hiệu đạt tiêu chuẩn nhân giống.
Kết luận: Từ kết quả hai thí nghiệm trên đề tài đã xác định được phương pháp khử trùng tối ưu cho bạch đàn lai UP54 và UP99 là:
- Hóa chất khử trùng thích hợp là: HgCl2 0,1% trong 7 phút
- Mùa vụ vào mẫu thích hợp là: Từ tháng 4 – 9 trong năm
Xác định môi trường nuôi cấy cơ bản
Để nhân giống các đối tượng Bạch đàn lai mới, việc xác định môi trường nuôi cấy phù hợp cho từng giai đoạn là rất quan trọng Nghiên cứu sử dụng ba loại môi trường phổ biến trong nuôi cấy mô cây gỗ là B5, WPM và MS, nhằm tìm ra môi trường cơ bản thích hợp cho quá trình nhân nhanh Các chỉ tiêu được theo dõi để đánh giá sự phù hợp của môi trường bao gồm hệ số nhân chồi (HSNC) và chiều cao trung bình của chồi.
Kết quả thí nghiệm được tổng hợp tại bảng 3.3 sau đây:
Bảng 3.3 Ảnh hưởng của loại môi trường đến khả năng nhân chồi bạch đàn lai UP54 và UP99 (sau 15 ngày cấy chuyển)
Chiều cao TB chồi HSNC (lần)
TB Sd TB Sd TB Sd TB Sd
Bảng tổng hợp số liệu cho thấy môi trường MS có hệ số nhân chồi cao nhất cho cả hai đối tượng nghiên cứu, tiếp theo là môi trường WPM và thấp nhất là môi trường B5 Cụ thể, trong môi trường MS, dòng UP54 đạt hệ số nhân chồi 1,18 lần với chiều cao trung bình chồi 2,21 cm, trong khi dòng UP99 đạt hệ số 1,21 lần và chiều cao 2,17 cm Ngược lại, môi trường B5 ghi nhận kết quả thấp nhất, với dòng UP54 chỉ đạt 0,79 lần và chiều cao 1,57 cm, còn dòng UP99 đạt 0,95 lần và chiều cao 1,54 cm.
Môi trường MS là môi trường phổ biến được sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, đặc biệt cho các loài cây rừng, nhờ vào thành phần và tỷ lệ các chất khoáng, vitamin phù hợp với nhu cầu dinh dưỡng của đối tượng nghiên cứu Ngược lại, môi trường B5 lại thiếu dinh dưỡng và không chứa vitamin, dẫn đến kết quả nuôi cấy thấp hơn.
Kết luận từ kết quả thí nghiệm cho thấy môi trường nuôi cấy cơ bản thích hợp nhất cho hai dòng bạch đàn lai UP54 và UP99 là môi trường MS.
Ảnh hưởng của chế độ nuôi sáng – tối tới kết quả nhân chồi
Bạch đàn là loài cây trồng có khả năng tái sinh nhanh, với phương thức cấy hiệu quả nhất là cấy dập, trong khi Keo sử dụng phương pháp cấy thẳng (Đoàn Thị Mai và cộng sự, 2011) Ánh sáng là yếu tố sinh lý quan trọng, ảnh hưởng đến quá trình ra hoa, sự tạo lá và hiện tượng ngủ nghỉ của thực vật, từ đó tác động lớn đến quá trình nhân giống in vitro Nghiên cứu gần đây cho thấy chế độ chiếu sáng ảnh hưởng đáng kể đến kết quả nhân chồi Bạch đàn (Đoàn Thị Mai và cộng sự, 2011) Để xác định chế độ chiếu sáng tối ưu cho Bạch đàn, môi trường nuôi cấy tốt nhất được xác định là MS, với 5 công thức khác nhau để theo dõi ảnh hưởng của ánh sáng đến quá trình nhân chồi.
CĐ1 : Chiếu sáng hoàn toàn
CĐ2(1:1:1) : 5 ngày sáng : 5 ngày tối : 5 ngày sáng
CĐ3( 1:2:2) : 3 ngày sáng : 6 ngày tối : 6 ngày sáng
CĐ4(1 :2 :1): 4 ngày sáng : 8 ngày tối : 4 ngày sáng
Kết quả thí nghiệm được được tổng hợp ở bảng 3.4 sau đây:
Bảng 3.4 Ảnh hưởng của chế độ nuôi sáng – tối tới kết quả nhân chồi Bạch đàn lai UP54 và UP99(sau 15 ngày cấy)
Kết quả thí nghiệm cho thấy chế độ chiếu sáng ảnh hưởng đáng kể đến sự sinh trưởng chiều cao của cây, đặc biệt là ở các dòng Bạch đàn lai Sự tác động của chế độ chiếu sáng đến khả năng nhân chồi của cây cũng rất rõ ràng.
Công thức CĐ1 cho hệ số nhân chồi và chiều dài chồi thấp nhất trong các thí nghiệm cho thấy dòng UP54 chỉ đạt 6,05 chồi/cụm, trong khi dòng UP99 đạt 7,5 chồi/cụm Thân chồi có lóng ngắn, thấp và lá to do thời gian chiếu sáng nhiều Nếu để lâu, sẽ xuất hiện nhiều rễ ở thân chồi.
Theo công thức CĐ2, cả chiều cao chồi và số chồi/cụm đều có xu hướng tăng lên Tuy nhiên, chiều cao chồi chỉ tăng không đáng kể do thời gian nuôi chưa đủ dài để tạo ra sự khác biệt rõ rệt trong sự sinh trưởng của chồi.
Trong công thức CĐ5, số lượng chồi/cụm tối thiểu được ghi nhận là 7,05 chồi/cụm cho UP54 và 7,12 chồi/cụm cho UP99 Thân chồi trong điều kiện này có lóng kéo dài và mảnh do quá trình nuôi tối kéo dài Khi được nuôi trong môi trường thiếu ánh sáng, auxin hoạt động mạnh mẽ hơn, dẫn đến hiện tượng ưu thế ngọn trong mô nuôi cấy Sự sinh tổng hợp xenlulo trong tế bào bị hạn chế, khiến cho các chồi tạo thành thường có hình dạng mảnh, lóng dài và giòn.
Mặc dù CĐ3 có thời gian nuôi tối ưu, nhưng thời gian nuôi sáng chưa đủ, dẫn đến việc số lượng chồi được tạo ra với hệ số nhân cao Tuy nhiên, chiều cao của chồi vẫn chưa đạt tiêu chuẩn cần thiết cho quá trình ra rễ.
CĐ4 là chế độ nuôi sáng – tối tối ưu cho việc nhân chồi, với dòng UP54 đạt chiều cao chồi 2,5cm, gấp 1,77 lần so với CĐ1 (1,41cm), trong khi dòng UP99 có chiều cao chồi 2,32cm, gấp 2 lần so với CĐ1 (1,15cm) và vẫn duy trì hệ số nhân chồi Tỷ lệ sáng/tối trong công thức này phù hợp với quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào, giúp các chồi phát triển đồng đều cả về số lượng lẫn chất lượng.
Kết luận từ thí nghiệm cho thấy chế độ nuôi sáng – tối tối ưu cho bạch đàn lai UP54 và UP99 là: cấy nhân chồi nuôi sáng 4 ngày, sau đó chuyển sang nuôi tối 8 ngày, và cuối cùng là nuôi sáng thêm 4 ngày trước khi cấy chuyển vòng tiếp theo.
Hình 3.3 Ảnh hưởng của chế độ nuôi sáng- tối tới hiệu quả nhân chồi UP99
3.4 Xác định môi trường nhân nhanh số lượng chồi
Một trong ba yếu tố quan trọng đảm bảo thành công trong nuôi cấy mô là lựa chọn và chuẩn bị môi trường phù hợp Giai đoạn này đóng vai trò quyết định trong việc đánh giá hiệu quả của phương pháp nhân giống in vitro, ảnh hưởng trực tiếp đến hệ số nhân của toàn bộ quy trình.
Môi trường MS là môi trường nuôi cấy cơ bản giàu dinh dưỡng và khoáng, nhưng trong các thí nghiệm nhân chồi cho hai dòng Bạch đàn UP54 và UP99, đã có sự điều chỉnh về thành phần và tỷ lệ các chất, tạo ra môi trường cải tiến MS* (Đoàn thị Mai và cộng sự, 2009 & 2011) Nghiên cứu trước đây cũng chỉ ra rằng việc bổ sung vitamin C và PVP vào môi trường nuôi cấy Bạch đàn là cần thiết để hạn chế hiện tượng tiết tanin, gây hóa nâu môi trường và làm giảm tốc độ phát triển chồi sau mỗi lần cấy chuyển.
Trong giai đoạn nhân nhanh, nghiên cứu đã tập trung vào ảnh hưởng của BAP và Kn, cả riêng lẽ và phối hợp, ở các nồng độ khác nhau đến chỉ tiêu HSNC và tỷ lệ chồi hữu hiệu (TLCHH) Chỉ tiêu HSNC được xác định là quan trọng nhất trong thí nghiệm này.
3.4.1 Ảnh hưởng của BAP đến hệ số nhân chồi (HSNC) và tỷ lệ chồi hữu hiệu (TLCHH)
Theo Vuglteke (1989), môi trường nuôi cấy mô có bổ sung Cytokinin giúp kích thích quá trình tạo chồi Trong số các Cytokinin, BAP và Kinetin được biết đến với hoạt tính sinh học cao, thường được sử dụng để thúc đẩy sự phân chia tế bào và phát triển chồi trong các mô nuôi cấy.
Thí nghiệm được thực hiện nhằm xác định ảnh hưởng của BAP ở 4 nồng độ khác nhau: 0,5; 1,0; 1,5 và 2,0 mg/l, bổ sung vào môi trường nuôi cấy MS* Các chỉ tiêu theo dõi trong nghiên cứu bao gồm hệ số nhân chồi, tỷ lệ chồi hữu hiệu và chất lượng chồi.
Kết quả thí nghiệm cho thấy nồng độ BAP ảnh hưởng không đồng đều đến HSNC và TLCHH (Ftính > F05) Ở công thức đối chứng không có BAP, dòng UP54 có HSNC và TLCHH lần lượt là 1,18 lần và 15,11%, trong khi dòng UP99 đạt 1,31 lần và 14,51% Khi nồng độ BAP là 0,5 mg/l, dòng UP54 tăng lên 1,59 lần và 18,12%, còn dòng UP99 đạt 1,72 lần và 17,89% Ở nồng độ BAP 1,0 mg/l, dòng UP54 có HSNC cao nhất 1,61 lần và TLCHH 22,35%, trong khi dòng UP99 đạt hiệu quả cao nhất ở nồng độ 1,5 mg/l với HSNC 2,24 lần và TLCHH 21,36% Tuy nhiên, khi tăng nồng độ từ 1,5 - 2,0 mg/l, HSNC và TLCHH của cả hai dòng đều giảm mạnh, xuất hiện những chồi nhỏ, mảnh và không rõ rệt, không có tác dụng cho các lần nhân chồi tiếp theo, dẫn đến hình thành khối mô sẹo lớn ở gốc.
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của BAP đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu
Bạch đàn lai UP54 và UP99 (sau 15 ngày nuôi cấy)
Hệ số nhân chồi (lần)
Tỷ lệ chồi hữu hiệu (%) Chất lƣợng chồi
++ : Chồi sinh trưởng ở mức độ trung bình
Các dòng khác nhau phản ứng khác nhau với cùng một môi trường khi bổ sung BAP ở các nồng độ khác nhau Việc sử dụng nồng độ BAP cao có thể gây ức chế sự sinh trưởng và phát triển của chồi.
3.4.2 Ảnh hưởng phối hợp của BAP + Kinetin (Kn) đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu
Xác định môi trường nâng cao chất lượng chồi
Trong giai đoạn nâng cao chất lượng chồi, sự phối hợp hợp lý giữa Auxin và Cytokinin sẽ tăng cường tỷ lệ chồi chất lượng cho giai đoạn ra rễ, từ đó cải thiện hiệu quả tạo rễ và huấn luyện cây con Theo nghiên cứu của Miller và Skoog (1963), tỷ lệ thấp của Auxin/Cytokinin sẽ kích thích sự phát sinh chồi Đồng thời, Das (1958) và Nistach (1968) cũng chỉ ra rằng sự tác động đồng thời của Auxin và Cytokinin là cần thiết để kích thích mạnh mẽ tổng hợp ADN trong quá trình phân chia tế bào.
Thí nghiệm được thực hiện bằng cách bổ sung các Auxin (NAA, IAA) với nồng độ khác nhau vào môi trường nhân chồi tối ưu đã xác định từ các thí nghiệm trước, nhằm nâng cao chất lượng chồi và chuẩn bị cho quá trình tạo rễ Trong thí nghiệm này, chỉ tiêu TLCHH là yếu tố quyết định, khác với HSNC trong các thí nghiệm trước Mục tiêu chính là tạo ra nhiều chồi hiệu quả để chuẩn bị cho giai đoạn ra rễ tiếp theo.
3.5.1 Ảnh hưởng phối hợp của BAP + Kn + NAA đến HSNC và TLCHH
NAA là một loại chất điều hòa sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm Auxin, có tác dụng kích thích sự phát triển rễ trong nuôi cấy mô thực vật Khi được bổ sung vào môi trường nhân chồi, NAA có khả năng thúc đẩy quá trình hình thành chồi nhờ vào việc gia tăng tỷ lệ Auxin/cytokinin Do đó, để xác định sự kết hợp tối ưu giữa BAP + Kn và Auxin cho việc nhân nhanh chồi, cần tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến quá trình này.
Thí nghiệm được thực hiện bằng cách bổ sung NAA với các nồng độ 0,25; 0,5; 0,75 và 1,0 mg/l vào môi trường MS* kết hợp với 1 mg/l BAP cho dòng UP54, và môi trường MS* với 1,5 mg/l BAP và 0,5 mg/l Kn cho dòng UP99 Kết quả thí nghiệm được tổng hợp trong bảng 3.7.
Bảng 3.7 Ảnh hưởng phối hợp của BAP + Kn + NAA đến HSNC và
TLCHH Bạch đàn lai UP54 và UP99 (sau 15 ngày cấy)
Kết quả thí nghiệm cho thấy, môi trường bổ sung nồng độ NAA 0,25mg/l mang lại tỷ lệ chồi hữu hiệu cao nhất, với chồi mập, thân và lá phát triển rõ rệt Dòng UP54 đạt hiệu suất sinh trưởng cao nhất với HSNC 2,05 lần và TLCHH 26,14%, trong khi dòng UP99 có HSNC 2,22 lần và TLCHH 25,56% Tuy nhiên, khi nồng độ NAA tăng từ 0,5 đến 1mg/l, cả HSNC và TLCHH đều giảm, cho thấy nồng độ NAA cao gây ức chế sự hình thành chồi và làm giảm chiều cao của chồi cũng như sự phát triển rễ ở gốc thân chồi.
3.5.2 Ảnh hưởng phối hợp của BAP + Kn + IAA đến HSNC và TLCHH Để xác định ảnh hưởng của IAA tới khả năng nhân chồi của các đối tượng nghiên cứu, đề tài tiến hành bổ sung thêm IAA ở các nồng độ khác nhau vào môi trường nhân nhanh chồi tốt nhất đã tìm ra ở các thí nghiệm trước
Bảng 3.8 Ảnh hưởng phối hợp của BAP + Kn + IAA đến HSNC và TLCHH
Bạch đàn lai UP54 và UP99 (sau 15 ngày cấy)
Phân tích cho thấy, việc bổ sung IAA ở nồng độ 0,25 mg/l không làm tăng hiệu quả nhân chồi nhưng đã cải thiện đáng kể tỷ lệ chất lượng chồi (TLCHH), giúp chồi sinh trưởng và phát triển tốt hơn Ngược lại, khi nồng độ IAA tăng lên 0,5 – 1 mg/l, cả hiệu quả nhân chồi (HSNC) và TLCHH đều giảm mạnh, với TLCHH của UP54 giảm từ 24,92% xuống còn 18,53% và UP99 giảm từ 25% xuống còn 20,21% Sự sinh trưởng của chồi cũng kém hơn, lá trở nên xoăn và dày, xuất hiện nhiều rễ ở thân chồi Do đó, nồng độ IAA 0,25 mg/l là mức tối ưu để nâng cao chất lượng chồi.
Kết quả thí nghiệm cho thấy, khi bổ sung NAA và IAA với cùng nồng độ, NAA mang lại hiệu quả cao hơn trong việc nâng cao chất lượng chồi, cả về hệ số nhân chồi (HSNC) và tỷ lệ chồi hữu hiệu (TLCHH) Cây sinh trưởng và phát triển đồng đều, với số lượng chồi hữu hiệu nhiều hơn.
Kết luận từ thí nghiệm cho thấy môi trường tối ưu nhất để nâng cao chất lượng chồi, chuẩn bị cho quá trình ra rễ của bạch đàn lai UP54 và UP99 đã được xác định.
- Với dòng UP54 là môi trường: MS* + 1mg/l BAP + 0,25mg/l NAA
- Với dòng UP99 là môi trường: MS* + 1,5 mg/l BAP + 0,5mg/l Kn + 0,25mg/l NAA
Hình 3.5 Chồi Bạch đàn lai UP54 (trái) và UP99 (phải) trong các môi trường nâng cao chất lượng chồi
MS*+ BAP+ Kn + IAA MS*+ BAP+ Kn + NAA MS*+ BAP+ Kn + IAA MS*+ BAP+ Kn + NAA
Xác định môi trường ra rễ
Giai đoạn tạo cây ra rễ là bước cuối cùng trong quá trình vi nhân giống, nhằm sản xuất cây con hoàn chỉnh với bộ rễ khỏe mạnh Điều này giúp cây có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt khi được chuyển ra ngoài vườn ươm hoặc vườn sản xuất.
Auxin là một phytohormon quan trọng trong quá trình sinh trưởng của tế bào, ảnh hưởng đến hoạt động của tầng phát sinh và sự hình thành rễ Để tạo rễ cho chồi, nồng độ và sự hiện diện của Auxin như IBA, IAA, NAA và ABT (chất kích thích ra rễ của Trung Quốc) là rất cần thiết Những chất kích thích này thường được sử dụng trong nuôi cấy mô, có thể bổ sung riêng lẻ hoặc kết hợp, nhằm nâng cao chất lượng chồi Các thí nghiệm trước đây đã chỉ ra rằng việc giảm nồng độ đường và các chất dinh dưỡng khác trong môi trường nuôi cấy xuống một nửa có thể cải thiện hiệu quả sinh trưởng.
3.6.1 Ảnh hưởng của IBA đến quá trình ra rễ của Bạch đàn lai UP54 và UP99
IBA là một chất điều hòa sinh trưởng quan trọng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nổi bật với khả năng kích thích sự phát triển của rễ Nồng độ IBA được điều chỉnh linh hoạt tùy thuộc vào từng loại cây trồng cụ thể Đoàn Thị Mai và các cộng sự đã nghiên cứu và áp dụng hiệu quả chất này trong quá trình nuôi cấy.
Năm 2000, môi trường ra rễ bạch đàn U29C3 được cải tiến bằng cách bổ sung 1,0 mg/l IBA vào môi trường 1/2MS Năm 2005, môi trường ra rễ của Trầm hương cũng được áp dụng 2,0 mg/l IBA trong môi trường 1/2MS Đoàn Thị Nga từ Viện nghiên cứu Cây nguyên liệu giấy đã đề xuất môi trường ra rễ cho bạch đàn PN2 là môi trường MS với 1 mg/l IBA.
Các thí nghiệm sẽ được thực hiện để xác định ảnh hưởng của IBA đến hiệu quả ra rễ bằng cách bổ sung IBA với các nồng độ khác nhau, bao gồm 0mg/l (đối chứng), 1mg/l, 1.5mg/l, 2mg/l và 2.5mg/l vào môi trường MS*.
Hai chỉ tiêu quan trọng trong ba chỉ tiêu theo dõi là tỷ lệ ra rễ và số rễ trung bình, vì chúng ảnh hưởng trực tiếp đến tỷ lệ sống và chất lượng cây con tại vườn ươm, như thể hiện trong Bảng 3.9.
Bảng 3.9 Ảnh hưởng của IBA đến quá trình ra rễ Bạch đàn lai UP54 và
Tỷ lệ chồi ra rễ (%)
Số rễ TB (rễ/cây)
Chiều dài TB của rễ (cm)
Tb Sd Tb Sd Tb Sd
F tính = 174,12 > F 05 = 3,47 (Tỷ lệ chồi ra rễ)
F tính = 149,51 > F 05 = 3,47 (Tỷ lệ chồi ra rễ)
Nồng độ IBA ảnh hưởng khác nhau đến tỷ lệ ra rễ và số rễ trung bình của hai dòng bạch đàn lai UP54 và UP99 Cụ thể, nồng độ 1,5 mg/l IBA mang lại hiệu quả ra rễ tốt nhất cho cả hai dòng, với dòng UP54 có tỷ lệ ra rễ đạt 64,86%, gấp 1,99 lần so với đối chứng, và số rễ trung bình là 2,41, cao gấp 1,25 lần đối chứng Đối với dòng UP99, tỷ lệ ra rễ là 68,80%, gấp 2,4 lần đối chứng, và số rễ trung bình cũng là 2,41, gấp 1,26 lần đối chứng Rễ được hình thành trong môi trường này có cấu trúc dạng chùm và phát triển hệ lông hút tốt.
Nghiên cứu về bạch đàn lai UP54 và UP99 cho thấy, khi bổ sung nồng độ IBA từ 0 đến 1,5mg/l, tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình và chiều dài rễ trung bình đều tăng Tuy nhiên, khi nồng độ IBA tiếp tục tăng từ 1,5 lên 2,5mg/l, cả ba chỉ tiêu này đều giảm, đặc biệt là ở nồng độ 2,5mg/l Mặt cắt phần gốc chồi cấy xuất hiện mô sẹo lớn và rễ hình thành không dài Nguyên nhân có thể do hàm lượng auxin ngoại sinh cao đã kìm hãm quá trình trao đổi chất và ức chế sự phát triển tế bào sinh rễ, dẫn đến rễ ngắn và đầu rễ thâm đen.
Như vậy, môi trường ra rễ thích hợp nhất cho hai dòng Bạch đàn lai UP
54 và UP99 nếu chỉ bổ sung IBA là:
+ Dũng UP54 là mụi trường: ẵ MS* + 1,5 mg/l IBA
+ Dũng UP99 là mụi trường : ẵ MS* + 1,5 mg/l IBA
Hình 3.6 Ảnh hưởng của IBA đến hiệu quả ra rễ của bạch đàn lai UP99
3.6.2 Ảnh hưởng phối hợp của IBA và ABT1 đến hiệu quả ra rễ của Bạch đàn lai UP54 và UP99
ABT1 là chất điều hòa sinh trưởng có nguồn gốc từ Trung Quốc, nổi bật với khả năng kích thích hình thành rễ bất định Hiện nay, ABT1 được ứng dụng rộng rãi trong quy trình nhân giống cây trồng, đặc biệt là khi kết hợp với môi trường nuôi cấy 1/2MS* và IBA, nhằm tạo ra cây hoàn chỉnh thông qua phương pháp nuôi cấy mô tế bào Sản phẩm này đang được sử dụng phổ biến tại nhiều đơn vị chuyên về nhân giống cây rừng.
Mục tiêu của nghiên cứu là xác định môi trường tối ưu cho việc tạo rễ, trong đó ABT1 được thử nghiệm ở các nồng độ 0,25; 0,5; 0,75 và 1, kết hợp với môi trường 1/2MS * + 1,5 mg/l IBA + 15 g/l đường + 4,1g/l agar, trong khi công thức không có ABT1 được sử dụng làm đối chứng Kết quả thí nghiệm được trình bày chi tiết trong Bảng 3.10.
Bảng 3.10 Ảnh hưởng phối hợp của IBA và ABT1 đến hiệu quả ra rễ Bạch đàn lai UP54 và UP99 (sau 15 ngày)
Tỷ lệ chồi ra rễ (%)
Số rễ TB (rễ/cây)
Chiều dài TB của rễ (cm)
Tb Sd Tb Sd Tb Sd
Ftính = 85,71 > F05 = 3,47 (Tỷ lệ chồi ra rễ)
Ftính = 162,81 > F05 = 3,47 (Tỷ lệ chồi ra rễ)
Kết quả thí nghiệm cho thấy nồng độ ABT1 ảnh hưởng không đồng đều đến hiệu quả ra rễ của hai dòng bạch đàn lai UP Khi kết hợp ABT1 với IBA, hiệu quả ra rễ tốt hơn so với việc sử dụng IBA đơn lẻ Đối với dòng UP54, nồng độ ABT1 tối ưu là 0,25 mg/l, đạt tỷ lệ chồi ra rễ 90,18%, trung bình 2,86 rễ/cây và chiều dài trung bình 1,15 cm Trong khi đó, dòng UP99 có hiệu quả cao nhất ở nồng độ 0,5 mg/l với tỷ lệ chồi ra rễ 91,25%, trung bình 3,21 rễ/cây và chiều dài 1,17 cm Rễ phát triển đồng đều, to mập và màu trắng, nhưng khi nồng độ ABT1 tăng lên, các chỉ tiêu theo dõi đều giảm, và ở nồng độ 1 mg/l, rễ bị thâm đen, rất ngắn và sùi to ở gốc chồi.
Như vậy, môi trường ra rễ thích hợp cho hai dòng Bạch đàn lai UP54 và UP99 nếu phối hợp IBA và ABT1 là:
+ Dũng UP54 là mụi trường: ẵ MS* + 1,5mg/l IBA + 0,25mg/lABT1 + Dũng UP99 là mụi trường: ẵ MS* + 1,5mg/l IBA + 0,5mg/lABT1
3.6.3 Ảnh hưởng phối hợp của IBA + NAA đến hiệu quả ra rễ bạch đàn lai UP54 và UP99
NAA là chất điều hòa sinh trưởng quan trọng, có khả năng kích thích sự hình thành rễ bất định, thường được áp dụng để tạo ra cây con hoàn chỉnh Nghiên cứu của Đoàn Thị Ái Thuyền và cộng sự vào năm 2005 đã chỉ ra hiệu quả của NAA trong môi trường ra rễ cho cây Hông, với công thức 1/2MS* + 0,1mg/l NAA.
2006 đưa ra môi trường ra rễ cho cây Dó trầm: WPM + 0,3mg/l NAA…
Thí nghiệm tiến hành bổ sung NAA theo thang nồng độ: 0mg/l(ĐC), 0.25mg/l, 0.5mg/l, 0.75mg/l và 1mg/l vào mụi trường ra rễ ẵ MS* + 1,5mg/lIBA
Kết quả thí nghiệm cho thấy nồng độ NAA ảnh hưởng không đồng đều đến hiệu quả ra rễ của hai dòng bạch đàn lai UP Dòng UP54 đạt kết quả ra rễ tốt nhất với nồng độ NAA 0,25mg/l, tỷ lệ ra rễ đạt 78,54%, số rễ trung bình 2,65 và chiều dài rễ trung bình 1,09cm Trong khi đó, dòng UP99 cho kết quả tối ưu với nồng độ NAA 0,5mg/l, tỷ lệ ra rễ đạt 80,11%, số rễ trung bình 2,81 và chiều dài trung bình 1,03cm Tuy nhiên, khi tăng nồng độ NAA, các chỉ tiêu theo dõi đều giảm rõ rệt Đặc biệt, với nồng độ NAA 1mg/l, tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình và chiều dài trung bình đều có xu hướng giảm do hàm lượng auxin ngoại sinh cao có thể ức chế sự ra rễ, làm cho rễ sinh ra mảnh, ngắn và thâm đen.
Bảng 3.11 Ảnh hưởng phối hợp của IBA + NAA đến hiệu quả ra rễ Bạch đàn lai UP54 và UP99 (sau 15 ngày cấy)
Tỷ lệ chồi ra rễ
Số rễ TB (rễ/cây)
Tb Sd Tb Sd Tb Sd
Ftính = 160,32 > F05 = 3,47 (Tỷ lệ chồi ra rễ)
F tính = 90,24 > F 05 = 3,47 (Tỷ lệ chồi ra rễ)
Như vậy, môi trường ra rễ thích hợp cho hai dòng Bạch đàn lai UP54 và UP99 nếu phối hợp IBA và NAA là:
+ Dũng UP54 là mụi trường: ẵ MS* + 1,5mg/l IBA + 0,25mg/l NAA + Dũng UP99 là mụi trường: ẵ MS* + 1,5mg/l IBA + 0,5mg/l NAA
3.6.4 Ảnh hưởng phối hợp của IBA và IAA đến hiệu quả ra rễ bạch đàn lai UP54 và UP99
IAA là một trong ba loại Auxin phổ biến trong nuôi cấy tế bào thực vật, cùng với IBA và NAA, có khả năng kích thích sự hình thành rễ bất định Một thí nghiệm đã được thực hiện để xác định ảnh hưởng của IAA đến hiệu quả ra rễ với các nồng độ khác nhau: 0 mg/l (đối chứng), 0,25 mg/l, 0,5 mg/l, 0,75 mg/l và 1,0 mg/l trong môi trường có IBA Kết quả của thí nghiệm được tổng hợp trong Bảng 3.12.
Bảng 3.12 Ảnh hưởng phối hợp của IBA và IAA đến hiệu quả ra rễ Bạch đàn lai UP54 và UP99 (sau 15 ngày cấy)
Tỷ lệ chồi ra rễ (%)
Số rễ TB (rễ/cây)
Chiều dài TB của rễ (cm)
Tb Sd Tb Sd Tb Sd
Ftính = 178,2 > F05 = 3,47 (Tỷ lệ chồi ra rễ)
F tính = 119,92 > F 05 = 3,47 (Tỷ lệ chồi ra rễ)
Kết quả phân tích cho thấy dòng UP54 đạt hiệu quả ra rễ cao nhất với 0,25 mg/l IAA, tỷ lệ ra rễ đạt 75,86%, số rễ trung bình 2,85 rễ/cây, chiều dài trung bình 1,12 cm; tuy nhiên, khi nồng độ IAA tăng lên, các chỉ tiêu này giảm do auxin cao ức chế quá trình ra rễ Đối với dòng UP99, hiệu quả ra rễ cao nhất đạt được với 0,5 mg/l IAA, tỷ lệ ra rễ là 77,48%, số rễ trung bình 2,89 rễ/cái, chiều dài trung bình 1,19 cm; tương tự như dòng UP54, khi nồng độ IAA tăng, các chỉ tiêu đo đếm cũng giảm.
Như vậy, môi trường ra rễ thích hợp cho hai dòng Bạch đàn lai UP54 và UP99 nếu phối hợp IBA và IAA là:
+ Dũng UP54 là mụi trường: ẵ MS* + 1,5mg/l IBA + 0,25mg/l IAA
+ Dũng UP99 là mụi trường: ẵ MS* + 1,5mg/l IBA + 0,5mg/l IAA
Hình 3.7 Bình ra rễ của Bạch đàn lai UP54 và UP99
Từ kết quả các thí nghiệm ảnh hưởng của Auxin đến hiệu quả ra rễ cho bạch đàn lai UP54 và UP99 trên, đề tài rút ra nhận xét:
Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ cây sống và chiều
Cây con được ra rễ in vitro trong điều kiện nhân tạo cần được đưa vào nhà huấn luyện để tiếp xúc với ánh sáng tự nhiên trước khi cấy vào giá thể ngoài vườn ươm Giai đoạn này rất quan trọng trong quy trình sản xuất cây giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào, thể hiện ý nghĩa thiết thực của việc ứng dụng vi nhân giống vào thực tiễn sản xuất.
Nghiên cứu về ảnh hưởng của 5 công thức thời gian huấn luyện cây con với sự kết hợp của 1/2MS*+ IBA + IAA cho thấy hai phương pháp: (i) không huấn luyện và (ii) huấn luyện trong 4, 8, 12 và 16 ngày đã được áp dụng để theo dõi tỷ lệ sống và sinh trưởng của cây con tại vườn ươm Sau khi huấn luyện, cây con được cấy vào giá thể cát và bầu đất, được chăm sóc tương tự như các đối tượng Bạch đàn khác (Đoàn Thị Mai và cộng sự, 2011) Kết quả thu được sau 4 tuần cấy vào giá thể được trình bày chi tiết trong Bảng 3.13.
Bảng 3.13 Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ cây sống và chiều cao của cây con ở vườn ươm (sau 1 tháng cấy vào giá thể)
Dòng Thời gian huấn luyện ( ngày)
Tỷ lệ cây sống (%) Chiều cao TB (cm)
F tính = 25,35 > F 05 = 4,07 (Tỷ lệ cây sống)
F tính = 24,46 > F 05 = 4,07 (Tỷ lệ cây sống)
Kết quả thí nghiệm cho thấy thời gian huấn luyện ảnh hưởng rõ rệt đến tỷ lệ sống của cây con tại vườn ươm Cụ thể, cây không được huấn luyện chỉ đạt tỷ lệ sống 45,6% với dòng UP54 và 42,3% với dòng UP99 Khi kéo dài thời gian huấn luyện, tỷ lệ sống của cây tăng lên, đạt cao nhất khi huấn luyện trong khoảng 8–12 ngày, với dòng UP54 đạt 93,3% (gấp 2,04 lần) và dòng UP99 đạt 90,4% (gấp 2,08 lần) so với cây được huấn luyện từ 0–4 ngày Thời gian huấn luyện này giúp bộ rễ phát triển cân đối, rễ mập và cây khỏe mạnh Tuy nhiên, tỷ lệ sống bắt đầu giảm nếu thời gian huấn luyện kéo dài đến 16 ngày, với dấu hiệu rễ cây con bị đen và xuất hiện nhiều rễ chết.
Hình 3.9 Bạch đàn ra rễ được huấn luyện trước khi cấy vào giá thể
Hình 3.10 Cây con UP54 và UP99 ngoài vườn ươm
Như vậy, thời gian huấn luyện đến tỷ lệ cây sống và chiều cao cây con ở vườn ươm hiệu quả nhất là khoảng thời gian từ 8 – 12 ngày.
Thảo luận chung
Trong quy trình nhân giống in vitro, khâu vào mẫu là bước quan trọng để tạo ra vật liệu nuôi cấy khởi đầu Việc lựa chọn chế độ khử trùng phù hợp sẽ giúp thuận lợi cho các bước tiếp theo Thông thường, các hóa chất như NaClO, Ca(OCl)2, HgCl2 và H2O2 được sử dụng với nồng độ và thời gian khác nhau Nghiên cứu này sử dụng hai loại hóa chất: HgCl2 (nồng độ 0,1% và 0,05%) và Ca(OCl)2 (nồng độ 5% và 10%) Kết quả cho thấy HgCl2 có hiệu quả khử trùng cao hơn, với nồng độ và thời gian khử trùng tối ưu cho hai dòng Bạch đàn lai UP54 và UP99 là HgCl2 0,1% trong khoảng thời gian nhất định.
Thời điểm lấy mẫu trong năm có ảnh hưởng lớn đến kết quả khử trùng, với khoảng thời gian lý tưởng từ tháng 4 đến tháng 9 Đây là giai đoạn cây phát triển mạnh, vì vậy việc chọn đúng hóa chất và nồng độ khử trùng phù hợp là rất quan trọng để đạt hiệu quả tối ưu.
Nuôi cấy in vitro mang lại lợi ích vượt trội với hệ số nhân giống cao, do đó việc xác định môi trường nuôi cấy cơ bản và môi trường nhân nhanh là rất quan trọng để nâng cao chất lượng chồi Bắt nguồn từ môi trường nuôi cấy cơ bản MS, đề tài đã tiến hành điều chỉnh và bổ sung một số chất điều hòa sinh trưởng, vitamin, PVP, nhằm tạo ra môi trường MS cải tiến (MS*).
Thí nghiệm xác định môi trường nhân nhanh chồi cho thấy BAP đóng vai trò chủ đạo, kết hợp với các Cytokine khác Sự phối hợp giữa BAP và Kn ảnh hưởng lớn đến HSNC và TLCHH Tuy nhiên, đặc điểm di truyền của từng dòng tạo ra phản ứng khác nhau với cùng một môi trường và nồng độ nuôi cấy, dẫn đến sự khác biệt trong HSNC Ngoài việc xác định loại môi trường thích hợp, nghiên cứu cũng chỉ ra rằng phương pháp cấy ảnh hưởng đến kết quả nhân nhanh chồi, với cấy dập cho kết quả cao hơn so với cấy thẳng nhờ diện tích tiếp xúc lớn hơn giữa tế bào và môi trường Hơn nữa, việc cắt chồi thành nhiều đoạn (mỗi đoạn gồm 1 đốt lá có mắt ngủ) giúp tạo ra nhiều cụm chồi nhỏ từ mỗi mắt.
Trong môi trường nâng cao chất lượng chồi thì việc bổ sung NAA có hiệu quả hơn so với IAA ở cả hai dòng Bạch đàn UP nghiên cứu
Trong môi trường ra rễ, sự kết hợp giữa IBA và ABT1 mang lại hiệu quả ra rễ tốt hơn so với tổ hợp IBA và NAA Mặc dù tổ hợp IBA và NAA cũng cho kết quả ra rễ cao, nhưng tốc độ ra rễ chậm hơn khi có sự bổ sung của ABT1.
Nghiên cứu cho thấy rằng trong môi trường nhân chồi và ra rễ, việc sử dụng BAP (hoặc IBA) làm yếu tố chính là rất quan trọng Các Auxin và Cytokin phối hợp thường chỉ phát huy hiệu quả tốt nhất khi được bổ sung ở nồng độ thấp (0 – 0,5 mg/l) Nếu nồng độ bổ sung cao hơn, sẽ dẫn đến ức chế quá trình nhân chồi và ra rễ, làm giảm chất lượng của chồi và cây.
Chế độ nuôi trong phòng và huấn luyện cây trước khi trồng vào giá thể có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của cây Thời gian huấn luyện lý tưởng từ 8 đến 12 ngày giúp cây cứng cáp và bộ rễ phát triển cân đối, từ đó giúp cây làm quen và thích nghi với môi trường tự nhiên bên ngoài.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Từ các kết quả nghiên cứu nhân giống bằng nuôi cấy mô cho 2 dòng bạch đàn lai UP54 và UP99, đề tài rút ra một số kết luận sau:
1 Loại hóa chất, nồng độ và thời gian khử trùng có ảnh hưởng đến kết quả khử trùng mẫu vật: Phương thức khử trùng tốt nhất cho Bạch đàn lai UP54 và UP99 là sử dụng dung dịch HgCl 2 0,1% trong 7 phút
2 Thời điểm lấy mẫu trong năm có ảnh hưởng tới kết quả khử trùng mẫu vật: Thời điểm lấy mẫu thích hợp cho Bạch đàn lai UP54 và UP99 là từ tháng 4 – 9 trong năm
3 Chế độ nuôi sáng – tối có ảnh hưởng rõ rệt đến kết quả nhân chồi: Chế độ nuôi 4 ngày sáng : 8 ngày tối : 4 ngày sáng là tốt nhất cho Bạch đàn lai UP54 và UP99
4 Cho dù cùng là Bạch đàn lai UP song phản ứng với môi trường nuôi cấy của từng dòng là không giống nhau:
* Môi trường nhân nhanh chồi thích hợp
+ Dòng UP54 là: MS* + 30 g/l đường + 3,7 g/l agar + 1,0 mg/l BAP + Dòng UP99 là: MS* + 30 g/l đường + 3,7 g/l agar + 1,5 mg/l BAP + 0,5 mg/l Kn
* Môi trường nâng cao chất lượng chồi thích hợp
+ Dòng UP54 là: MS* + 1,0 mg/l BAP + 0,25 mg/l NAA
+ Dòng UP99 là: MS* + 1,5 mg/l BAP + 0,5 mg/l Kn + 0,25 mg/l NAA
* Môi trường ra rễ thích hợp:
+ Dũng UP54 là : ẵ MS* +15 g/l đường + 4,1 g/l agar + 1,5 mg/l IBA + 0,25 mg/l ABT1
+ Dũng UP99 là: ẵ MS* +15 g/l đường + 4,1 g/l agar + 1,5 mg/l IBA + 0,5 mg/l ABT1
5 Thời gian huấn luyện để cây ra rễ thích nghi dần với điều kiện tự nhiên có ảnh hưởng đến tỷ lệ sống và sinh trưởng cây con trong giai đoạn vườn ươm: Với hai dòng Bạch đàn lai UP54 và UP99 chồi non sau khi ra rễ được huấn luyện 8 -12 ngày trước khi cấy vào giá thể cho tỷ lệ sống cao nhất
1 Tiếp tục nghiên cứu nhân giống in vitro cho các dòng Bạch đàn lai khác nữa để hoàn thiện quy trình nhân giống cho các dòng Bạch đàn lai mới được công nhận là giống TBKT
2 Tiếp tục nghiên cứu cải tiến phương pháp nhân giống, rút ngắn công đoạn để giảm bớt giá thành cây con in vitro => Người dân dễ tiếp nhận giống đưa vào trồng rừng sản xuất
