Dịch tễ học bệnh viêm não Nhật Bản
1.1.1 Lịch sử xuất hiện bệnh trên thế giới và Việt Nam
1.1.1.1 Lịch sử xuất hiện bệnh viêm não Nhật Bản trên thế giới
Bệnh viêm não Nhật Bản (VNNB) đã được ghi nhận lần đầu bởi các nhà khoa học Nhật Bản vào năm 1871, với các triệu chứng xuất hiện ở ngựa và con người Sau đại dịch lớn năm 1924, khi hơn 6.000 người mắc bệnh và tỷ lệ tử vong lên đến 60%, VNNB được công nhận là một thể lâm sàng riêng biệt Futaki (1924) đã đặt tên cho bệnh này là viêm não mùa hè, hay viêm não B, nhằm phân biệt với viêm não ngủ Von Economo loại A, đã được phát hiện trước đó Sự khác biệt này dựa trên các đặc điểm dịch tễ và lâm sàng của bệnh.
Từ năm 1932, Hayashi và cộng sự đã thành công trong việc xác định tác nhân gây bệnh viêm não Nhật Bản (VNNB) bằng cách lấy chất não từ tử thi bệnh nhân và gây bệnh cho 5 thế hệ khỉ Macacus Đến năm 1935, Mitamura, Takagi, Takenouchi và cộng sự đã phân lập thành công virus từ não tử thi của một bệnh nhân VNNB, đặt tên chủng đầu tiên là Nakayama Chủng virus này đã trở thành nền tảng để phát triển vắc xin phòng ngừa và kháng nguyên trong xét nghiệm chẩn đoán VNNB tại Nhật Bản, cả trong quá khứ và hiện tại.
Theo ước tính, khoảng ba tỷ người trên thế giới đang sống trong các khu vực có sự lưu hành của virus viêm não Nhật Bản (VNNB) và đang đối mặt với nguy cơ nhiễm virus do muỗi Culex truyền.
Cx.tritaeniorhynchus và Cx.vishnui có mối liên hệ với canh tác lúa nước và chăn nuôi lợn ở Châu Á Kể từ năm 1873, Nhật Bản đã ghi nhận nhiều trường hợp bệnh lưu hành và dịch bệnh hàng năm Tỷ lệ tử vong trong các đợt dịch từ năm 1924 đến 1959 dao động từ 24% đến 91,7% Từ năm 1972 đến nay, theo thống kê của Bộ Y tế và Phúc lợi Nhật Bản, số ca bệnh hàng năm đã giảm xuống còn dưới mức đáng kể.
100 trường hợp mắc VNNB do tác động của vắc xin dự phòng bệnh [17;49].
Tình hình bệnh viêm não Nhật Bản ở Triều Tiên trong năm 1949 ghi nhận 5.616 trường hợp mắc, với tỷ lệ 27,8 trên 100.000 dân và 2.729 ca tử vong Từ 1949 đến 1958, dịch bệnh thường tái diễn cách ba năm một lần, mỗi lần ghi nhận trên 1.000 ca trong suốt chín năm Đặc biệt, trong dịch năm 1958, có tới 6.897 bệnh nhân, tỷ lệ mắc là 29,7 trên 100.000 dân và 2.117 ca tử vong, tương đương 9,4 trên 100.000 dân Giai đoạn 1958-1969, trung bình hàng năm vẫn có khoảng 1.000 trường hợp mắc, nhưng hiện nay con số này đã giảm xuống dưới 100 trường hợp, mặc dù có những năm gia tăng đột biến như năm 1973 với 769 ca và năm 1982 với 1.197 ca.
Hình 1.2 Tình hình bệnh viêm não Nhật Bản ở Hàn Quốc
Vắc xin VNNB đã giúp kiểm soát bệnh VNNB ở một số nước Bắc Á như Nhật Bản và Triều Tiên, nhưng tình hình ở Trung Quốc và một số nước Nam Á vẫn nghiêm trọng, với tỷ lệ mắc bệnh từ 15-20/100.000 người và tỷ lệ tử vong khoảng 30% Tại Malaysia, từ 1997-2006, các trường hợp VNNB vẫn tiếp tục được ghi nhận Ở Ấn Độ, trước năm 1970, bệnh chủ yếu xuất hiện ở miền Nam, nhưng từ năm 1973, dịch đã lan ra nhiều khu vực khác, với tần số mắc bệnh tăng mạnh từ 31 trường hợp ở Goa năm 1983 lên 3.451 trường hợp ở Uttar Pradesh năm 1978, tỷ lệ tử vong dao động từ 25%-45% Điều này cho thấy sự cần thiết phải có một chiến lược hiệu quả để kiểm soát bệnh VNNB tại Ấn Độ.
Hình 1.3 Phân bố vùng lưu hành vi rút viêm não Nhật Bản trên thế giới
Từ năm 1978 đến 1984, Nepal ghi nhận 2.508 trường hợp mắc VNNB, với 886 ca tử vong, tỷ lệ tử vong đạt 35,32% tại các bệnh viện Đặc biệt, trẻ em dưới 14 tuổi chiếm 33% số ca mắc và có tỷ lệ tử vong lên tới 28,7% Trong vụ dịch năm 1985, cả nước ghi nhận 595 trường hợp mắc bệnh và 146 ca tử vong, trong khi năm 1986, số ca mắc tăng lên 1.299 và 357 ca tử vong.
Tại miền Bắc Thái Lan năm 1969 tỷ lệ mắc bệnh là 20,3 trên 100.000 dân, riêng đối với trẻ em dưới 15 tuổi, tỷ lệ mắc VNNB hàng năm thường vượt mức
Vi rút VNNB đã được phát hiện ở hầu hết các quốc gia châu Á, trải dài từ vùng biển Xibêri ở phía Bắc cho đến các đảo Indonesia ở phía Nam Các khu vực đảo và quần đảo trong biển châu Á, bao gồm Nhật Bản, Triều Tiên, Guam, Đài Loan, Philippines, Myanma, Singapore, Malaysia, Thái Lan, Indonesia, Bangladesh, Sri Lanka, Pakistan, Ấn Độ và Nepal, đều nằm trong vùng ảnh hưởng của vi rút này.
Vi rút VNNB hiện chỉ được ghi nhận lưu hành tại châu Á và miền Bắc nước Úc, trong khi các khu vực như châu Mỹ, châu Âu và châu Phi vẫn chưa phát hiện sự xuất hiện của vi rút này.
Bệnh viêm não Nhật Bản (VNNB) thường bùng phát vào mùa hè ở các nước cận nhiệt đới, với nhiều đợt dịch lớn được ghi nhận Trong khi đó, tại các vùng nhiệt đới, bệnh xảy ra rải rác quanh năm Trẻ em dưới 15 tuổi và những người chưa có miễn dịch tự nhiên hoặc chưa được tiêm vắc xin phòng bệnh VNNB là những đối tượng có nguy cơ mắc bệnh cao.
1.1.1.2 Lịch sử xuất hiện bệnh viêm não Nhật Bản ở Việt Nam, Tây Nguyên Ở Việt Nam, lần đầu tiên bệnh VNNB được ghi nhận vào năm 1953 với báo cáo sơ bộ của hai nhà khoa học người Pháp là Puyuelo H và Pre'vot M về
Tại miền Bắc Việt Nam, đã ghi nhận 98 trường hợp mắc virus VNNB trong quân đội viễn chinh Pháp Các nhà khoa học Việt Nam sau đó đã tiến hành nghiên cứu về sự lưu hành của virus VNNB và tình hình dịch tễ học của bệnh, chủ yếu tập trung vào các tỉnh vùng đồng bằng gần.
Hà Nội đã xác định nguyên nhân gây HCVNC ở miền Bắc Việt Nam là do vi rút VNNB, với muỗi Cx tritaeniorhynchus đóng vai trò truyền bệnh, được khẳng định qua việc phân lập vi rút từ loài muỗi này Nghiên cứu dịch tễ học và lâm sàng đã chỉ ra vi rút VNNB là nguyên nhân chính trong các vụ dịch HCVNC xảy ra vào mùa hè Theo thống kê, tỷ lệ mắc HCVNC ở miền Bắc dao động từ 1,77 (1962) đến 22,07 (1970), trong khi tỷ lệ tử vong từ 0,477 (1962) đến 4,982 (1970) không có xu hướng giảm cho đến khi vắc xin VNNB được đưa vào chương trình tiêm chủng mở rộng cho trẻ em từ 1-5 tuổi, góp phần làm giảm tỷ lệ mắc bệnh.
Từ năm 2011 đến 2013, tỷ lệ mắc bệnh VNNB ở các tỉnh trung du và đồng bằng Bắc Bộ giảm xuống còn khoảng 2-5 trên 100.000 dân, trong khi tỷ lệ trung bình toàn quốc là 0,9-1,4 trên 100.000 dân Tại các tỉnh phía Nam, bệnh VNNB chỉ ghi nhận sporadic, như vào mùa hè năm 1968 tại Long Bình - Sài Gòn với 57 trường hợp trong quân đội Hoa Kỳ và 1 ca tử vong Từ 1978 đến 1997, virus VNNB đã được phân lập từ bệnh nhân ở ngoại thành TP Hồ Chí Minh và các tỉnh Đồng Tháp, Sông Bé, Đồng Nai, cũng như từ muỗi Culex quiquefasciatus tại TP Hồ Chí Minh và Long An Giai đoạn 1999-2001, các ca VNNB xuất hiện rải rác tại Đồng Nai và Vĩnh Long.
Từ năm 1979 đến 1990, theo Viện VSDTTW, tỷ lệ mắc "hội chứng viêm não cấp" tại Tây Nguyên dao động từ 1,62 đến 5,96 trên 100.000 dân, với tỷ lệ tử vong từ 0,18 đến 0,76 Trong giai đoạn này, chẩn đoán huyết thanh VNNB ở trẻ em có tỷ lệ dương tính từ 50-70% Từ năm 2000-2001, ghi nhận 21 trường hợp VNNB tại Gia Lai, Kon Tum và Đắk Lắk Giai đoạn 2002-2005, Tây Nguyên phát hiện trên 283 trường hợp viêm não, trong đó có 50 ca tử vong, và riêng Gia Lai phát hiện 46 ca VNNB từ 74 mẫu bệnh phẩm.
Đặc điểm muỗi Culex và vai trò truyền vi rút viêm não Nhật Bản
Đến nay, đã có hơn 30 loài muỗi Culex được xác định có khả năng truyền vi rút VNNB, bao gồm Cx tritaeniorhynchus, Cx vishnui, và Cx gelidus Những loài muỗi này thường sinh sản ở đồng ruộng, mặc dù có thể bay xa đến 1,5 km, như Cx tritaeniorhynchus, và có thể xuất hiện ở độ cao 13-15m, nơi chim trú ngụ, tạo điều kiện cho vi rút lây lan từ muỗi sang chim Muỗi hút máu từ động vật nhiễm vi rút, đặc biệt là lợn và chim trong thời kỳ nhiễm vi rút huyết, và có khả năng truyền bệnh suốt đời, thậm chí truyền vi rút qua trứng cho thế hệ sau Vi rút VNNB phát triển tốt trong cơ thể muỗi ở nhiệt độ 27-30 o C, trong khi sự phát triển của vi rút sẽ dừng lại nếu nhiệt độ dưới 20 o C, lý do khiến bệnh/dịch VNNB thường xảy ra vào mùa hè ở các vùng cận nhiệt đới.
1.2.1 Véc tơ truyền vi rút viêm não Nhật Bản
Muỗi Culex, đặc biệt là loài Cx tritaeniorhynchus, đóng vai trò quan trọng trong việc truyền bệnh viêm não Nhật Bản (VNNB) tại Việt Nam Virus VNNB có chu kỳ tự nhiên "chim-muỗi", nhưng vào mùa hè, chu kỳ này mở rộng thành "muỗi-lợn", dẫn đến chu kỳ "muỗi-người" Chu trình "người-muỗi" là giai đoạn cuối cùng, vì virus VNNB không lây truyền từ người sang người qua muỗi Điều này cho thấy sự phức tạp trong chu trình sinh thái của virus VNNB trong tự nhiên.
CHIM CHIM MUỖI LỢN LỢN
Hình 1.6 Chu trình lây truyền của vi rút viêm não Nhật Bản
1.2.2 Nghiên cứu về muỗi Culicinae
1.2.2.1 Nghiên cứu về muỗi Culicinae trên thế giới Đã có nhiều công trình nghiên cứu về muỗi Culicinae trong đó có nhiều loài muỗi Culex được xác định là trung gian truyền bệnh VNNB Việc điều tra nghiên cứu về khu hệ, sinh thái học, vai trò truyền bệnh và các biện pháp phòng chống những loài muỗi Culex là trung gian truyền bệnh VNNB đã được nhiều tác giả, công bố với những nghiên cứu ở một số nước khu vực Đông Nam Á như Thái Lan, Singapore, Indonesia, Philippines, Malaysia, v.v [56;61;67;69;120]; hoặc Bắc Á như Trung Quốc [88]; hoặc Nam Á như Ấn Độ [93], v.v Những loài muỗi Culex đã được nhiều tác giả xác định là véc tơ truyền vi rút VNNB bao gồm: a) Cx gelidus Đây là loài muỗi thích hút máu gia súc hơn là máu người, nó được phát hiện ở nhiều nước châu Á như Malaysia, Thái Lan, Taipang, Perak, Ấn Độ, v.v theo công bố trước đây, loài muỗi này còn có tên khác là Cx bipunctata khi được phát hiện ở châu Á Thái Bình Dương từ các nước như: Myanmar, Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia, Nhật Bản, Malaysia, Nepal, New Guinea, Pakistan,
Muỗi Culex tritaeniorhynchus là véc tơ chính truyền vi rút VNNB ở châu Á, đã được phát hiện ở nhiều quốc gia như Ấn Độ, Philippines và Thái Lan Loài muỗi này phân bố rộng rãi trên toàn cầu, bao gồm các nước châu Phi, Nam Á và một số nước châu Âu Chúng thường sống ở các môi trường nước như đầm lầy và ao tù, với muỗi cái chủ yếu hút máu gia súc và lợn Tương tự, Culex vishnui cũng là véc tơ chính của vi rút VNNB và có mặt ở hầu hết các nước Châu Á Thái Bình Dương, với loăng quăng được tìm thấy trong các khu vực nước đọng Muỗi cái của loài này chủ yếu hút máu từ chim và lợn, nhưng cũng có thể hút máu người.
Loài muỗi này có khả năng truyền vi rút VNNB và giun chỉ ở Thái Lan, được thu thập tại nhiều địa điểm như Makessar, Celebes với tên gọi Cx impellens, ở Úc là Cx annulirostris, và ở Malaya là Cx somaliensis Loăng quăng và bọ gậy của loài muỗi này thường xuất hiện trong các dụng cụ chứa nước mặn, nước lợ và nước ngọt ven biển Muỗi cái chủ yếu hút máu từ các loài chim và lợn, nhưng cũng hút máu người.
1.2.2.2 Nghiên cứu về muỗi Culicinae ở Việt Nam
Trước năm 1954, nghiên cứu về muỗi Culicinae ở Việt Nam chủ yếu do người nước ngoài thực hiện, đặc biệt trước thập niên 1940 Từ thập niên 1950 trở đi, các nghiên cứu chủ yếu được thực hiện bởi người Việt Nam, tập trung vào véc tơ truyền bệnh sốt rét và bệnh VNNB ở miền Bắc Những công trình này thường được kết hợp với các công tác điều tra cơ bản khác.
Kết quả giám sát véc tơ truyền bệnh và phân lập vi rút từ muỗi tại các vùng dịch như Việt Yên Bắc Thái, Đông Anh Hà Nội, Gia Lương Hà Bắc (cũ) cho thấy các loài muỗi Cx tritaeniorhynchus, Cx vishnui và Cx gelidus là véc tơ truyền bệnh VNNB phổ biến ở miền Bắc.
Hình 1.7 Mật độ một số loài muỗi Culex ở Cát Quế, Hoài Đức,
Hà Tây (cũ) đã thu thập để phân lập vi rút viêm não Nhật Bản,
Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để khảo sát đặc điểm phân bố và sinh thái của muỗi truyền bệnh VNNB tại miền Bắc Việt Nam Các tác giả trong nước đã đóng góp đáng kể vào việc xác định sự phân bố của một số loài muỗi, cung cấp thông tin quý giá cho việc kiểm soát và phòng ngừa bệnh tật.
Nghiên cứu về muỗi Culex tại Cát Quế, Hà Tây (cũ) trong giai đoạn 2001-2003 cho thấy Cx tritaeniorhynchus xuất hiện quanh năm với mật độ cao vào tháng 4 và tháng 9 Cx vishnui có mặt từ tháng 3 đến tháng 4 và từ tháng 7 đến tháng 11, với đỉnh cao trùng với Cx tritaeniorhynchus Cx gelidus chỉ được phát hiện từ tháng 5 đến tháng 12, đạt đỉnh vào tháng 10, trong khi Cx quinquefaciatus chỉ xuất hiện vào tháng 1, 2 và tháng 11 Tại miền Bắc, vi rút VNNB đã được phát hiện chủ yếu từ ba loài muỗi này, cho thấy mối liên hệ giữa mật độ muỗi, đặc biệt là Cx tritaeniorhynchus và Cx vishnui, với tần suất ca bệnh VNNB ở người.
Nghiên cứu về khu hệ và sinh thái muỗi Culicinae, cùng với vai trò dịch tễ học của chúng như véc tơ truyền bệnh VNNB, là rất quan trọng Đánh giá sự nhạy cảm của các véc tơ này đối với hóa chất đang sử dụng tại Việt Nam sẽ góp phần tích cực vào công tác phòng chống các bệnh do muỗi truyền, đặc biệt trong bối cảnh chưa có vắc xin dự phòng.
Hình 1.8 Mật độ muỗi Culex tại tỉnh Sơn La, Điện Biên, Lào Cai, 2018
Nghiên cứu gần đây tại ba tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam, bao gồm Sơn La, Điện Biên và Lào Cai, đã phát hiện ra bốn loài muỗi thuộc chi Culex.
Cx tritaeniorhynchus chiếm tỷ lệ cao nhất 72,98%, tiếp theo là Cx vishnui
Trong nghiên cứu này, tỷ lệ muỗi Culex truyền bệnh VNNB được xác định là 24,91% Mặc dù không thực hiện phân lập vi rút VNNB từ muỗi, nhưng hai loài Culex đã được công nhận là véc tơ chính của bệnh này ở Việt Nam theo các nghiên cứu trước Ngoài ra, hai loài muỗi Cx quinquefasciatus và Cx fuscocephala cũng được phát hiện tại hai tỉnh, nhưng tỷ lệ của chúng chỉ dao động từ 0,48% đến 1,63%.
1.2.2.3 Nghiên cứu về muỗi Culicinae ở Tây Nguyên
Tây Nguyên hiện vẫn giữ nhiều diện tích rừng tự nhiên của Việt Nam, với sự đa dạng sinh học phong phú và nhiều khu bảo tồn động vật, bao gồm cả những loài có mầm bệnh nguy hiểm Nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng vào năm 1993, các nhà khoa học đã xác định được 41 loài muỗi thuộc phân họ Culicinae tại khu vực này, trong đó có 16 loài Aedes, 8 loài Armigeres và 1 loài Mansonia.
Orthopodomya 10 loài, Malaya 01 loài, Toxorhynchites 3 loài, Tripteroides 2 loài, và đặc biệt giống Culex có 9 loài [10] Một số công trình nghiên cứu ở khu vực Tây Nguyên như trên đã phản ánh khái quát về thành phần, phân bố của muỗi Culex, tuy nhiên việc cập nhật số liệu thành phần, sự phân bố và vai trò truyền bệnh VNNB của Culex ở Tây Nguyên trong những năm gần đây và hiện tại chưa được nghiên cứu một cách hệ thống đầy đủ Do vậy rất cần có những nghiên cứu hiện tại và tương lai về lĩnh vực này, góp phần vào việc chăm sóc và bảo vệ sức khỏe cho cộng đồng các dân tộc ở Tây Nguyên.
Đặc điểm phân tử/dịch tễ sinh học phân tử vi rút viêm não Nhật Bản 23 1.4 Vài nét tổng quan khu vực Tây Nguyên
Đặc điểm phân tử và dịch tễ sinh học phân tử liên quan đến nghiên cứu di truyền thông qua việc so sánh trình tự nucleotide hoặc axit amin của gen đích và toàn bộ genome của các chủng vi sinh vật Những nghiên cứu này được thực hiện trên các mẫu vi sinh vật được phân lập từ nhiều nguồn và khu vực địa lý khác nhau, nhằm tìm hiểu quá trình lan truyền của tác nhân gây bệnh Đồng thời, chúng cũng giúp xác định số lượng các loại huyết thanh, nhóm genotype, phân nhóm genotype (clade) và tiểu phân nhóm genotype (cluster) đang tồn tại trong một khu vực cụ thể trong những khoảng thời gian nhất định.
Trong lĩnh vực vi sinh y học, đặc điểm phân tử/dịch tễ sinh học phân tử là phương pháp hiện đại nhất để xác định đặc điểm và nguồn gốc của tác nhân gây bệnh, cũng như sự lan truyền của chúng theo không gian và thời gian Phương pháp này đã trở thành công cụ chính xác và cần thiết trong giám sát dịch tễ học.
- Xác định được nguồn gốc, sự mới xuất hiện và sự lan rộng của tác nhân gây bệnh;
- Theo dõi được sự thay đổi các chủng gây bệnh ở mức phân tử theo thời gian và phân vùng địa lý;
- Theo dõi sự tiến hóa của các chủng vi sinh gây bệnh;
- Xác định được xu hướng của bệnh dịch liên quan đối với những tác nhân gây bệnh mang gene độc lực ở mức độ cao hoặc thấp;
- Trong một số trường hợp là cơ sở để phân biệt chủng phân lập có nguồn gốc từ vắc xin hay trong tự nhiên (hoang dại).
1.3.2 Sự phát triển và ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gen
1.3.2.1 Giải trình tự nucleotide a) Thế hệ thứ nhất (Phương pháp Sanger)
Phương pháp Sanger, được phát minh bởi Frederick Sanger vào năm 1977, hiện vẫn được coi là "chuẩn vàng" trong giải trình tự nucleotide Phương pháp này cho phép xác định chính xác trình tự ADN của các mẫu phân tích và so sánh sự tương đồng về trình tự nucleotide giữa chúng.
Phương pháp này dựa trên cơ chế tổng hợp ADN của vi sinh vật, sử dụng dideoxynucleotide (ddNTP) với nhóm –OH bị thiếu ở vị trí cacbon 2’ và 3’ Trong quá trình tổng hợp ADN, ADN polymerase ngẫu nhiên gắn một ddNTP vào sợi ADN đang được tổng hợp, dẫn đến việc ngừng quá trình do thiếu nhóm –OH ở vị trí 3’, nơi nucleotide tiếp theo cần gắn vào để hình thành cầu nối phosphodiester.
Mẫu vi rút đã sàng lọc
Tách chiết ARN của vi rút
Thực hiện phản ứng RT-PCR để nhân đoạn gen đích hiệu
Tinh sạch sản phẩm PCR
Thực hiện phản ứng PCR giải trình tự
Tinh sạch sản phẩm của phản ứng
Xác định độ tinh sạch và nồng độ Điện di kiểm tra
Vào cuối thế kỷ XX, công nghệ giải trình tự gen đã tiến bộ với việc sử dụng máy đọc tự động (Sequenser) dựa trên nguyên lý sắc ký lỏng, cho phép xác định trình tự nucleotide dài hơn so với các phương pháp trước đó Phương pháp này được áp dụng để phát hiện các genotype mới, thông qua việc thiết kế các mồi dựa trên trình tự của các chủng "consensus" Một ví dụ điển hình là nghiên cứu phát hiện genotype I và genotype V của vi rút VNNB trong nhiều thập kỷ qua tại các nước châu Á và Bắc Á Tiếp theo, thế hệ thứ hai của công nghệ giải trình tự, được gọi là Next Generation Sequencing (NGS), đã mở ra nhiều cơ hội mới trong nghiên cứu gen.
Phương pháp sequencing thế hệ thứ hai vượt trội hơn phương pháp của Senger với bốn điểm chính: tốc độ nhanh hơn, chi phí thấp hơn, khả năng xử lý nhiều mẫu cùng lúc và độ chính xác cao hơn ngay cả khi lượng ADN hạn chế.
NGS, hay giải trình tự với sản lượng cao, là công nghệ tiên tiến cho phép giải trình tự ADN và ARN nhanh chóng và tiết kiệm chi phí hơn so với kỹ thuật Sanger Công nghệ này đã tạo ra một cuộc cách mạng trong nghiên cứu genome và sinh học phân tử, nhờ vào sự phát triển của nhiều công nghệ hiện đại khác nhau.
1.3.2.2 Giải trình tự acid amine a) Giới thiệu chung về các phương pháp giải trình tự acid amine
Giải trình tự protein là kỹ thuật xác định trình tự các acid amin trong protein, giúp hiểu rõ cấu trúc và chức năng của chúng trong cơ thể sống Việc khám phá này đóng vai trò quan trọng trong việc nghiên cứu các chu trình tế bào, từ đó tìm ra con đường chuyển hóa và mục tiêu cho các loại thuốc.
Có hai phương pháp chính để giải trình tự protein: (1) khối phổ và (2) phản ứng Edman sequencing Tuy nhiên, hiện nay, phương pháp giải trình tự acid nucleic đã trở nên phổ biến hơn, vì nó đơn giản hơn và cho phép dự đoán trình tự protein từ trình tự ADN một cách dễ dàng.
Xác định thành phần acid amin trong protein giúp tìm ra trình tự protein, từ đó phát hiện sai sót trong quá trình giải trình tự và phân biệt các kết quả không rõ ràng Hiểu biết về tần suất các acid amin là cơ sở để lựa chọn protease phù hợp cho việc phân cắt protein.
Hình 1.10 Mô phỏng từ trình tự peptide đến giải mã genome
(Nguồn ảnh: http://www.peptideatlas.org/) b) Ứng dụng của các kỹ thuật giải trình tự acid amine
Xác định mức biểu hiện protein tại các thời điểm khác nhau là quan trọng trong nghiên cứu biệt hoá, tăng sinh và truyền tín hiệu của tế bào Thuật ngữ proteomics xuất hiện sau năm 1970 nhằm xây dựng cơ sở dữ liệu protein Tuy nhiên, việc xác định protein gặp khó khăn do thiếu phương pháp phân tích nhanh và nhạy, như PCR Sự ra đời của kỹ thuật khối phổ vào năm 1990 đã trở thành công cụ phân tích hữu hiệu cho protein Proteomics không chỉ phân tích chức năng của sản phẩm gene mà còn nghiên cứu sự tương tác giữa các protein, góp phần quan trọng trong việc khám phá và phát triển thuốc, vì hầu hết thuốc điều trị tác động trực tiếp lên protein.
1.3.2.3 Đặc điểm dịch tễ sinh học phân tử của vi rút viêm não Nhật Bản
Hình 1.11 Phân bố địa lý và sự lan truyền của các kiểu gen vi rút viêm não Nhật Bản
Vi rút VNNB chỉ có một type huyết thanh duy nhất, nhưng có 5 genotype.
Sự phân bố của các genotype vi rút VNNB thay đổi theo vùng địa lý và thời gian, với tần suất tiến hóa di truyền rất thấp, dưới 3,2% Điều này cho thấy mối liên hệ giữa độc lực của vi rút và các genotype khác nhau, ảnh hưởng đến khả năng lây lan và mức độ nghiêm trọng của bệnh.
Phân tích genotype vi rút VNNB dựa trên trình tự nucleotide cho thấy có 5 genotype khác nhau, với tỷ lệ phân biệt là 12% Vi rút VNNB genotype III, được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1935 tại Nhật Bản với chủng Nakayama, đã được sử dụng để sản xuất vắc xin bất hoạt cho con người trong hơn 50 năm qua Chủng SA 14-14-2, cũng thuộc genotype III, đã được giảm độc lực để phát triển vắc xin sống giảm độc lực tại Trung Quốc Ngược lại, vi rút VNNB genotype I chủ yếu thích ứng với muỗi và lợn, với chỉ 5 chủng được phát hiện từ người trong những năm 1970 Genotype II đã được phân lập từ người và muỗi ở Malaysia, Indonesia và Bắc Úc nhưng chưa có báo cáo tái xuất hiện gần đây Đối với genotype IV và V, vai trò gây bệnh vẫn chưa rõ ràng, trong khi genotype IV cho thấy độc lực thấp hơn so với genotype I và III.
Các nghiên cứu về dịch tễ sinh học phân tử của virus VNNB cho thấy cả năm genotype của virus này đã được phát hiện ở Malaysia, Indonesia và New Guinea Tuy nhiên, tại Nhật Bản, chỉ có genotype III lưu hành, được cho là tiến hóa từ virus tổ tiên ở châu Phi Giả thuyết cho rằng virus VNNB xuất hiện đầu tiên ở Malaysia và Indonesia, từ đó lan rộng ra các nước châu Á, và dự đoán rằng trong tương lai, genotype III sẽ xuất hiện ở Úc, trong khi genotype II có thể lưu hành tại Bắc Á, bao gồm Trung Quốc và Nhật Bản.
Trong những thập kỷ qua, không có sự xuất hiện mới của vi rút VNNB genotype II tại các nước Bắc Á, cũng như vi rút VNNB genotype III ở Úc Điều này cho thấy vi rút VNNB genotype II, được phát hiện lần đầu ở Úc, vẫn không có sự biến đổi hay lan rộng mới trong khu vực này.
Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.1.1.1 Đối tượng nghiên cứu cho mục tiêu 1
Các trường hợp HCVNC nghi ngờ do vi rút và VNNB có phiếu điều tra (Phụ lục 1) ở 4 tỉnh của khu vực Tây Nguyên, 2005-2018.
Tiêu chuẩn lựa chọn ca bệnh HCVNC được xác định dựa trên chẩn đoán lâm sàng và nghi ngờ nhiễm virus HCV theo quy định của Bộ Y tế, cụ thể là Quyết định 4283/QĐ-BYT ban hành ngày 08 tháng.
Bệnh nhân viêm não Nhật Bản (VNNB) thường có các triệu chứng như sốt đột ngột (nhiệt độ ≥37,8 o C), đau đầu, buồn nôn, nôn, và có thể xuất hiện rối loạn ý thức từ nhẹ đến nặng, bao gồm ngủ gà, sững sờ, lú lẫn, mất phương hướng, li bì, lơ mơ hoặc hôn mê Ngoài ra, bệnh nhân có thể có dấu hiệu thần kinh như co cứng cơ, cổ cứng, co giật, liệt nửa người hoặc tứ chi, cùng với các cử động bất thường Dịch não tuỷ của bệnh nhân thường trong, không màu Để xác định ca bệnh VNNB, cần xét nghiệm tìm kháng thể IgM kháng virus VNNB trong dịch não tuỷ hoặc huyết thanh bệnh nhân bằng kỹ thuật MAC-ELISA.
Trong nghiên cứu này, ca bệnh viêm não Nhật Bản (VNNB) được xác định qua kết quả xét nghiệm IgM kháng virus VNNB dương tính bằng kỹ thuật MAC-ELISA, thực hiện tại các phòng xét nghiệm của Trung tâm Y tế dự phòng tỉnh và Viện VSDT Tây Nguyên.
2.1.1.2 Đối tượng nghiên cứu cho mục tiêu 2
Một số loài muỗi Culex thu thập ở 4 tỉnh của khu vực Tây Nguyên, 2005- 2018;
Vi rút VNNB được phân lập từ muỗi Culex ở Tây Nguyên, 2005-2018.
2.1.1.3 Đối tượng nghiên cứu cho mục tiêu 3
Trình tự nucleotide và acid amin vùng gen E của các chủng vi rút VNNB được phân lập từ muỗi Culex ở 4 tỉnh của Tây Nguyên.
Nghiên cứu được thực hiện tại 4 tỉnh thuộc khu vực Tây Nguyên: Kon Tum, Gia Lai, Đắk Lắk và Đắk Nông.
Tây Nguyên là một vùng núi cao rộng lớn nằm ở Trung Bộ Việt Nam, thuộc sườn phía Tây dãy Trường Sơn, tọa độ khoảng 11°44' vĩ độ Bắc và 107°15' đến 108°50' độ kinh Đông Khu vực này bao gồm 5 tỉnh: Kon Tum, Gia Lai, Đắk Lắk, Đắk Nông và Lâm Đồng, nổi bật với địa hình chủ yếu là cao nguyên.
Hình 2.1 Bản đồ hành chính khu vực Tây Nguyên
Nghiên cứu được thực hiện từ năm 2017 đến 2018.
Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu mô tả cắt ngang (cross-sectional study).
2.2.2 Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu
2.2.2.1 Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu cho mục tiêu 1
Thu thập toàn bộ số liệu, 2005-2018 liên quan đến HCVNC và ca bệnh VNNB được xác định ở 4 tỉnh của khu vực Tây Nguyên.
Từ năm 2005 đến 2018, đã thực hiện phiếu điều tra đối với 713 bệnh nhân mắc HCVNC do vi rút tại 4 tỉnh khu vực Tây Nguyên, trong đó xác định được 168 trường hợp viêm gan nhiễm virus B (VNNB).
2.2.2.2 Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu cho mục tiêu 2
1) Thu thập toàn bộ số mẫu muỗi Culex được xét nghiệm xác định khả năng nhiễm vi rút VNNB trong giai đoạn 2005-2016 Trên thực tế, nghiên cứu chỉ thu thập và sử dụng được số mẫu muỗi Culex vào 2 giai đoạn 2005-2007 và 2012-2014 để mô tả và phân lập vi rút Riêng giai đoạn 2008- 2011, nghiên cứu không thu thập được số liệu, vì đây là số liệu hồi cứu nên phụ thuộc vào các địa phương trong giai đoạn này không tiến hành hoạt động giám sát véc tơ VNNB.
Trong nghiên cứu, mỗi mẫu muỗi Culex được bảo quản ở nhiệt độ -70°C cho đến khi tiến hành phân lập virus Kết quả thu được 138 mẫu với 5.368 cá thể muỗi từ giai đoạn 2005-2007 và 236 mẫu với 8.351 cá thể muỗi từ giai đoạn 2012-2014, nhằm mô tả và kiểm tra khả năng nhiễm virus VNNB.
2) Mẫu muỗi Culex thu thập tại thực địa trong 2 năm (2017-2018): cá thể muỗi/nhà x 15 nhà/điểm x 10 điểm x 2 đợt, như vậy tổng số muỗi thu thập được tối thiểu là 300 cá thể muỗi.
Nghiên cứu đã thu thập 372 cá thể muỗi, trong đó có các cá thể muỗi Culex cái trưởng thành Tất cả muỗi được thu thập từ thực địa, sau đó được định loại, xử lý và bảo quản trong Nitơ lỏng trước khi chuyển đến phòng thí nghiệm của Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương để phân lập vi rút.
Mỗi mẫu phân lập vi rút tương ứng với một cá thể muỗi, với dự kiến 100 mẫu muỗi Culex được phân lập Tuy nhiên, kết quả thực tế cho thấy đã phân lập được 166 mẫu vi rút.
2.2.2.3 Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu cho mục tiêu 3
Chọn mẫu theo phương pháp thuận tiện, toàn bộ chủng vi rút VNNB phân lập từ muỗi Culex ở khu vực Tây Nguyên trong thời gian nghiên cứu từ 2005-
Năm 2018, các mẫu vi rút đã được xác định dương tính bằng kỹ thuật RT-PCR và được bảo quản ở nhiệt độ âm sâu -70 độ C tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương cho đến khi tiến hành nghiên cứu Nghiên cứu này đã được thực hiện với các chủng vi rút này.
1) Số liệu hồi cứu: 04 chủng vi rút phân lập từ muỗi Culex, 2007 trong giai đoạn thu thập mẫu muỗi Culex, 2005-2007.
2) Số liệu thực hiện tại thực địa trong 2 năm (2017-2018): 05 chủng vi rút phân lập từ muỗi Culex trong năm 2018.
Nội dung nghiên cứu
2.3.1 Các biến số, chỉ số nghiên cứu
TT Các biến số/chỉ số Loại biến pháp thu thập thông tin Mục tiêu 1
1 Giới Nhị phân Hồi cứu;
2 Tuổi Liên tục Hồi cứu;
3 Dân tộc Phân loại Hồi cứu;
4 Nghề nghiệp Phân loại Hồi cứu;
5 Nơi thường trú Địa danh Hồi cứu;
6 Thời gian mắc bệnh Liên tục Hồi cứu;
7 Nơi mắc bệnh, lấy mẫu xét nghiệm và điều trị Địa danh Hồi cứu;
8 Kết quả xét nghiệm về chẩn đoán VNNB Phân loại Hồi cứu;
9 Ca bệnh Phân loại Hồi cứu;
1 Thành phần loài muỗi Culex Phân loại Hồi cứu;
2 Phân bố từng loài muỗi Culex Phân loại Hồi cứu;
3 Tỷ lệ nhiễm tối thiểu của một loài muỗi Culex Liên tục Hồi cứu; với vi rút VNNB Cắt ngang
1 Vi rút VNNB và xác định genotype Phân loại Hồi cứu;
2 Cây di truyền phả hệ Định danh Hồi cứu;
3 So sánh về sự tương đồng trình tự nucleotide Phân loại Hồi cứu;
4 Đột biến acid amin Phân loại Hồi cứu;
2.3.2 Kỹ thuật và công cụ thu thập thông tin
2.3.2.1 Kỹ thuật và công cụ thu thập thông tin, cách tiến hành, đánh giá kết quả cho mục tiêu 1
Tỷ lệ mắc HCVNC, VNNB/100.00 dân của từng tỉnh và khu vực theo năm, theo giai đoạn.
Tỷ lệ chết VNNB trên 100.000 dân của từng tỉnh và khu vực theo năm, theo giai đoạn.
Phân bố số mắc HCVNC, VNNB theo huyện của từng tỉnh và khu vực theo năm, theo giai đoạn.
Phân bố số mắc HCVNC, VNNB theo tháng tại của từng tỉnh và khu vực theo năm, theo giai đoạn.
Phân bố số mắc HCVNC, VNNB theo nhóm tuổi tại của từng tỉnh và khu vực theo năm, theo giai đoạn.
Trong thời gian từ năm 2017 đến ngày 31 tháng 12 năm 2018, chúng tôi đã tiến hành điều tra và thu thập số liệu tại Viện Vệ sinh dịch tễ Tây Nguyên cùng với các Trung tâm y tế dự phòng tại các tỉnh Kon Tum, Gia Lai, Đắk Lắk và Đắk Nông.
Hệ thống báo cáo và giám sát dịch bệnh tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Tây Nguyên và Trung tâm Y tế Dự phòng đã thu thập dữ liệu từ các tỉnh Gia Lai, Kon Tum, Đắk Lắk, Đắk Nông Các mẫu xét nghiệm của bệnh nhân HCVNC chủ yếu là mẫu huyết thanh hoặc dịch não tủy, được hồi cứu từ kết quả xét nghiệm VNNB bằng phương pháp MAC-ELISA tại Phòng thí nghiệm Viện VSDTTN.
Thu thập thông tin bệnh nhân VNNB bao gồm các yếu tố như tuổi, giới tính, nghề nghiệp, dân tộc và kết quả xét nghiệm VNNB Dữ liệu được thu thập theo phương pháp hồi cứu từ các số liệu đã ghi nhận, thông qua quan sát và ghi chép các thông tin có sẵn theo phiếu điều tra trong phụ lục 1.
Các trường hợp nghi ngờ nhiễm virus HCVNC sẽ được lấy mẫu huyết thanh hoặc dịch não tủy để xác định bệnh VNNB Kỹ thuật MAC-ELISA sẽ được sử dụng để phát hiện kháng thể IgM, dựa trên nguyên lý của kỹ thuật ELISA gián tiếp, thông qua bộ sinh phẩm chẩn đoán VNNB.
- Kỹ thuật MAC-ELISA chẩn đoán VNNB từ huyết thanh/DNT
Sử dụng bộ sinh phẩm MAC-ELISA từ Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, thực hiện quy trình và đánh giá kết quả theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Hình 2.3 Sơ đồ kỹ thuật MAC-ELISA chẩn đoán VNNB
Kỹ thuật MAC-ELISA dựa trên nguyên lý sử dụng IgG kháng IgM người đặc hiệu, được gắn trên bản nhựa 96 giếng hoặc thanh nhựa 2 x 8 giếng Khi mẫu xét nghiệm có IgM, nó sẽ kết hợp với IgG kháng IgM người Nếu mẫu có IgM đặc hiệu kháng vi rút viêm não Nhật Bản, nó sẽ tương tác với kháng nguyên viêm não Nhật Bản khi tiếp xúc.
Kháng thể IgG kháng vi rút VNNB gắn enzyme sẽ kết hợp với kháng nguyên, tạo thành phức hợp với cơ chất không màu Tetramethylbenzidine (TMB) và Hydrogen Peroxide Dưới tác động của Hydrogen Peroxide, cơ chất này sẽ chuyển từ không màu sang màu xanh Khi phản ứng được dừng lại bằng axít, màu xanh sẽ chuyển thành màu vàng.
Sự hiện diện của IgM đặc hiệu kháng vi rút VNNB trong mẫu được xác định qua hiện tượng chuyển màu Trong khi đó, mẫu chứng âm và các mẫu thử không có IgM đặc hiệu kháng vi rút VNNB sẽ không có sự xuất hiện của màu sắc.
- Tiêu chuẩn nhận định một trường hợp bị VNNB :
Phát hiện được IgM trong dịch não tuỷ, nhưng không phát hiện được IgM trong mẫu máu lấy cùng ngày: Bị HCVNC do vi rút VNNB (tiêu chuẩn vàng).
Trong giai đoạn cấp, không phát hiện IgM trong dịch não tuỷ và mẫu huyết thanh lấy cùng ngày, nhưng IgM được phát hiện trong mẫu huyết thanh lấy lần thứ hai Điều này cho thấy bệnh nhân mắc HCVNC do vi rút VNNB, với sự chênh lệch hiệu giá kháng thể.
Không phát hiện IgM trong dịch não tuỷ, nhưng có IgM trong huyết thanh lấy cùng ngày và mẫu huyết thanh thứ hai, không có sự chênh lệch hiệu giá kháng thể giữa hai mẫu Điều này cho thấy bệnh nhân bị HCVNC do nguyên nhân khác.
2.3.2.2 Kỹ thuật và công cụ thu thập thông tin, cách tiến hành, đánh giá kết quả cho mục tiêu 2
Thành phần loài muỗi Culex bao gồm các cá thể thuộc giống Culex đã được thu thập và định loại, nhằm mục đích xét nghiệm khả năng nhiễm vi rút VNNB.
Phân bố của từng loài muỗi Culex được xác định dựa trên số lượng cá thể phát hiện và thu thập tại các điểm nghiên cứu ở các địa phương khác nhau.
Tỷ lệ nhiễm vi rút VNNB ở muỗi Culex được tính bằng cách chia số lượng mẫu muỗi dương tính (được xác nhận qua Sequencing) cho tổng số cá thể muỗi trong các mẫu, sau đó nhân với 1000.
Từ năm 2005 đến 2016, nghiên cứu đã thu thập và khai thác toàn bộ số liệu về thành phần, phân bố và vai trò truyền bệnh của muỗi Culex Trong năm 2018, Viện Vệ sinh dịch tễ Tây Nguyên và Viện Vệ sinh dịch tễ Trung Ương đã phân lập vi rút VNNB từ các mẫu muỗi trong giai đoạn này.
Tiến hành điều tra bắt muỗi tại thực địa nhằm định loại và thống kê các loài muỗi Culex, đồng thời phân loại mẫu để gửi về Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương xét nghiệm khả năng nhiễm virus VNNB Các địa điểm điều tra được lựa chọn dựa trên sinh địa cảnh thuận lợi cho sự phát triển của muỗi, như gần ruộng lúa, vườn cây ăn quả và khu vực chăn nuôi gia súc, đặc biệt là những nơi có bệnh nhân VNNB ghi nhận trong giai đoạn 2015-2018 Tiêu chí lựa chọn điểm điều tra không chỉ dựa vào sinh cảnh mà còn tham khảo theo vùng địa lý, phân khu hành chính và khả năng nhân lực, vật lực.
Hình 2.4 Bản đồ vị trí các điểm thu thập muỗi Culex , 2017-2018
