Dịch tễ học bệnh viêm não Nhật Bản
1.1.1 Lịch sử xuất hiện bệnh trên thế giới và Việt Nam
1.1.1.1 Lịch sử xuất hiện bệnh viêm não Nhật Bản trên thế giới
Lịch sử nghiên cứu bệnh viêm não Nhật Bản (VNNB) bắt đầu từ năm 1871 khi các nhà khoa học Nhật Bản ghi nhận triệu chứng viêm não ở ngựa và con người Sau đại dịch lớn năm 1924 với hơn 6.000 ca mắc và tỷ lệ tử vong khoảng 60%, VNNB được xác định là một thể lâm sàng riêng biệt Futaki (1924) đã gọi bệnh này là viêm não mùa hè, phân loại nó là viêm não B, nhằm phân biệt với viêm não ngủ Von Economo, loại A đã được phát hiện trước đó tại Nhật Bản.
Crucher và Von Economo vì có những đặc điểm dịch tễ, lâm sàng khác hẳn bệnh viêm não ngủ lịm của Von Economo [1;17;52;62;118;133]
Từ năm 1932, Hayashi và cộng sự đã thành công trong việc xác định tác nhân gây bệnh VNNB bằng cách lấy chất não từ tử thi bệnh nhân và gây bệnh cho 5 thế hệ khỉ Macacus Đến năm 1935, Mitamura, Takagi, Takenouchi và cộng sự đã phân lập được chủng vi rút đầu tiên từ não tử thi bệnh nhân VNNB, được gọi là chủng Nakayama Chủng này không chỉ là nền tảng để phát triển vắc xin dự phòng mà còn là kháng nguyên trong xét nghiệm chẩn đoán bệnh VNNB đầu tiên tại Nhật Bản và hiện nay.
Theo ước tính, khoảng ba tỷ người trên thế giới đang sinh sống trong các khu vực có sự lưu hành của virus viêm não Nhật Bản (VNNB) và đang đối mặt với nguy cơ nhiễm virus do muỗi Culex truyền.
Cx.tritaeniorhynchus và Cx.vishnui có mối liên hệ chặt chẽ với canh tác lúa nước và nuôi lợn ở Châu Á Kể từ năm 1873, Nhật Bản đã ghi nhận nhiều trường hợp bệnh lưu hành và dịch bệnh hàng năm Trong giai đoạn từ năm 1924 đến 1959, tỷ lệ tử vong do các vụ dịch này dao động từ 24% đến 91,7% Từ năm 1972 đến nay, theo thống kê của Bộ Y tế và Phúc lợi Nhật Bản, số ca tử vong hàng năm đã giảm xuống còn dưới mức đáng kể.
100 trường hợp mắc VNNB do tác động của vắc xin dự phòng bệnh [17;49]
Trong giai đoạn từ năm 1949 đến 1969, bệnh viêm não Nhật Bản đã ghi nhận nhiều đợt dịch nghiêm trọng tại Triều Tiên, với 5.616 trường hợp mắc và 2.729 ca tử vong trong năm 1949, tương đương tỷ lệ mắc 27,8 trên 100.000 dân Các vụ dịch xảy ra cách ba năm, với số ca mắc vượt quá 1.000 trong suốt chín năm Đặc biệt, năm 1958 chứng kiến 6.897 bệnh nhân và 2.117 ca tử vong, tỷ lệ tử vong đạt khoảng 9,4 trên 100.000 dân Từ 1958 đến 1969, số ca mắc hàng năm vẫn duy trì khoảng 1.000, nhưng đã giảm xuống dưới 100 trường hợp trong những năm gần đây, mặc dù có những năm tăng đột biến như 769 ca vào năm 1973 và 1.197 ca vào năm 1982.
Hình 1.2 Tình hình bệnh viêm não Nhật Bản ở Hàn Quốc
Vắc xin VNNB đã giúp kiểm soát bệnh VNNB tại một số nước Bắc Á như Nhật Bản và Triều Tiên, nhưng tình hình ở Trung Quốc và một số nước Nam Á vẫn nghiêm trọng Tại Trung Quốc, tỷ lệ mắc bệnh là từ 15-20/100.000 người với tỷ lệ tử vong khoảng 30% Từ 1997-2006, Malaysia liên tục ghi nhận các ca VNNB, trong khi Ấn Độ cũng chứng kiến dịch bệnh lan rộng, bắt đầu từ miền Nam trước năm 1970 và sau đó xuất hiện ở miền Tây Bengal và nhiều khu vực khác Theo Rustagi R (2019), số ca mắc bệnh đã tăng mạnh từ 31 trường hợp ở Goa năm 1983 lên 3.451 trường hợp ở Uttar Pradesh năm 1978, với tỷ lệ tử vong từ 25%-45%, điều này nhấn mạnh sự cần thiết phải có chiến lược kiểm soát bệnh VNNB tại Ấn Độ.
Hình 1.3 Phân bố vùng lưu hành vi rút viêm não Nhật Bản trên thế giới
Giữa năm 1978 và 1984, Nepal ghi nhận 2.508 trường hợp mắc virus viêm não Nhật Bản (VNNB), trong đó có 886 ca tử vong, tỷ lệ tử vong đạt 35,32% Đặc biệt, trẻ em dưới 14 tuổi chiếm 33% số ca mắc và tỷ lệ tử vong lên tới 28,7% Trong đợt dịch năm 1985, Nepal có 595 trường hợp mắc bệnh và 146 ca tử vong, tiếp theo năm 1986 ghi nhận 1.299 trường hợp mắc và 357 ca tử vong.
Tại miền Bắc Thái Lan năm 1969 tỷ lệ mắc bệnh là 20,3 trên 100.000 dân, riêng đối với trẻ em dưới 15 tuổi, tỷ lệ mắc VNNB hàng năm thường vượt mức
Vi rút VNNB đã được xác định ở hầu hết các quốc gia châu Á, trải dài từ miền Đông châu Á, bao gồm khu vực biển Xibêri ở phía Bắc cho đến các đảo Indonesia ở phía Nam Các đảo và quần đảo trong khu vực châu Á như Nhật Bản, Triều Tiên, Guam, Đài Loan, Philippines, Myanmar, Singapore, Malaysia, Thái Lan, Indonesia, Bangladesh, Sri Lanka, Pakistan, Ấn Độ và Nepal đều nằm trong danh sách các khu vực bị ảnh hưởng.
Vi rút VNNB hiện chỉ được ghi nhận lưu hành tại châu Á và miền Bắc nước Úc, trong khi châu Mỹ, châu Âu và châu Phi chưa phát hiện sự tồn tại của loại vi rút này.
Bệnh VNNB thường xuất hiện vào mùa hè ở các nước cận nhiệt đới, với các vụ dịch lớn được ghi nhận, trong khi ở vùng nhiệt đới, ca bệnh xảy ra rải rác quanh năm Đối tượng có nguy cơ cao mắc bệnh chủ yếu là trẻ em dưới 15 tuổi và những người chưa có miễn dịch tự nhiên hoặc miễn dịch từ vắc xin phòng ngừa bệnh VNNB.
1.1.1.2 Lịch sử xuất hiện bệnh viêm não Nhật Bản ở Việt Nam, Tây Nguyên Ở Việt Nam, lần đầu tiên bệnh VNNB được ghi nhận vào năm 1953 với báo cáo sơ bộ của hai nhà khoa học người Pháp là Puyuelo H và Pre'vot M về
Tại miền Bắc Việt Nam, đã ghi nhận 98 trường hợp mắc bệnh viêm não Nhật Bản (VNNB) trong quân đội viễn chinh Pháp Các nhà khoa học Việt Nam sau đó đã tiến hành nghiên cứu về sự lưu hành của virus VNNB và tình hình dịch tễ học của bệnh này, tập trung chủ yếu vào các tỉnh vùng đồng bằng gần.
Hà Nội đã xác định nguyên nhân gây HCVNC ở miền Bắc Việt Nam là vi rút VNNB, với muỗi Cx tritaeniorhynchus là tác nhân truyền bệnh chủ yếu Các nghiên cứu dịch tễ học và lâm sàng đã chỉ ra rằng vi rút VNNB liên quan đến các đợt dịch HCVNC vào mùa hè Tình hình mắc HCVNC ở miền Bắc cho thấy tỷ lệ mắc trên 100.000 dân dao động từ 1,77 (1962) đến 22,07 (1970), trong khi tỷ lệ tử vong từ 0,477 (1962) đến 4,982 (1970) không có xu hướng giảm cho đến khi vắc xin VNNB được đưa vào chương trình tiêm chủng mở rộng cho trẻ em từ 01-05 tuổi, góp phần giảm tỷ lệ mắc bệnh.
Trong giai đoạn 2011-2013, tỷ lệ mắc Viêm não Nhật Bản (VNNB) ở các tỉnh trung du và đồng bằng Bắc Bộ giảm xuống còn khoảng 2-5 trường hợp trên 100.000 dân, trong khi tỷ lệ toàn quốc dao động từ 0,9-1,4 trên 100.000 dân Tại các tỉnh phía Nam, VNNB chỉ ghi nhận một số ít trường hợp, điển hình là vào mùa hè năm 1968, khi có 57 trường hợp mắc VNNB trong quân đội Hoa Kỳ tại Long Bình - Sài Gòn, dẫn đến 1 ca tử vong Từ năm 1978 đến 1997, virus VNNB đã được phân lập từ bệnh nhân tại TP Hồ Chí Minh và các tỉnh Đồng Tháp, Sông Bé, Đồng Nai, cũng như từ muỗi Culex quiquefasciatus tại TP Hồ Chí Minh.
Minh, tỉnh Long An Trong các năm 1999-2001 đã ghi nhận các trường hợp VNNB xuất hiện tản phát ở hai tỉnh Đồng Nai và Vĩnh Long [4;11;13;21]
Tại Tây Nguyên, theo tài liệu của Viện VSDTTW (1993), tỷ lệ mắc "hội chứng viêm não cấp" ở Việt Nam từ 1979-1990 dao động từ 1,62 (1990) đến 5,96 (1984), với tỷ lệ tử vong từ 0,18 (1990) đến 0,76 (1983) Trong giai đoạn này, chẩn đoán huyết thanh VNNB ở trẻ em xác định dương tính từ 50-70% trong các trường hợp có biểu hiện "hội chứng viêm não cấp" Từ năm 2000-2001, đã xác định được 21 trường hợp VNNB tại Gia Lai, Kon Tum và Đắk Lắk Giai đoạn 2002-2005, Tây Nguyên phát hiện trên 283 trường hợp viêm não, trong đó có 50 ca tử vong, và riêng tại Gia Lai đã phát hiện 46 ca VNNB từ 74 bệnh phẩm của bệnh nhân có HCVNC.
Đặc điểm muỗi Culex và vai trò truyền vi rút viêm não Nhật Bản
Hiện nay, đã xác định có hơn 30 loài muỗi Culex, như Cx tritaeniorhynchus, Cx vishnui và Cx gelidus, có khả năng truyền vi rút VNNB Những loài muỗi này thường sinh sản ở đồng ruộng, có thể bay xa đến 1,5 km và được phát hiện ở độ cao 13-15m, nơi các loài chim thường trú Muỗi hút máu động vật nhiễm vi rút, đặc biệt là lợn và chim trong thời kỳ nhiễm vi rút huyết, và có khả năng truyền bệnh suốt đời cũng như qua trứng Vi rút VNNB phát triển tốt trong cơ thể muỗi ở nhiệt độ 27-30°C, trong khi sự phát triển của vi rút dừng lại dưới 20°C, lý do khiến dịch bệnh VNNB thường xảy ra vào mùa hè ở các vùng cận nhiệt đới.
1.2.1 Véc tơ truyền vi rút viêm não Nhật Bản
Muỗi Culex, đặc biệt là loài Cx tritaeniorhynchus, không chỉ là ổ chứa vi rút mà còn là véc tơ truyền vi rút VNNB sang người tại Việt Nam Chu kỳ tự nhiên của vi rút VNNB diễn ra qua chu trình "chim-muỗi", và vào mùa hè, chu kỳ này mở rộng thành chu kỳ "muỗi-lợn", dẫn đến chu trình "muỗi-người" Chu trình "người-muỗi" được coi là chu trình cuối cùng, vì vi rút VNNB không lây truyền từ người sang người qua muỗi véc tơ.
CHIM CHIM MUỖI LỢN LỢN
Hình 1.6 Chu trình lây truyền của vi rút viêm não Nhật Bản
1.2.2 Nghiên cứu về muỗi Culicinae
1.2.2.1 Nghiên cứu về muỗi Culicinae trên thế giới Đã có nhiều công trình nghiên cứu về muỗi Culicinae trong đó có nhiều loài muỗi Culex được xác định là trung gian truyền bệnh VNNB Việc điều tra nghiên cứu về khu hệ, sinh thái học, vai trò truyền bệnh và các biện pháp phòng chống những loài muỗi Culex là trung gian truyền bệnh VNNB đã được nhiều tác giả, công bố với những nghiên cứu ở một số nước khu vực Đông Nam Á như Thái Lan, Singapore, Indonesia, Philippines, Malaysia, v.v [56;61;67;69;120]; hoặc Bắc Á như Trung Quốc [88]; hoặc Nam Á như Ấn Độ [93], v.v Những loài muỗi Culex đã được nhiều tác giả xác định là véc tơ truyền vi rút VNNB bao gồm: a) Cx gelidus Đây là loài muỗi thích hút máu gia súc hơn là máu người, nó được phát hiện ở nhiều nước châu Á như Malaysia, Thái Lan, Taipang, Perak, Ấn Độ, v.v theo công bố trước đây, loài muỗi này còn có tên khác là Cx bipunctata khi được phát hiện ở châu Á Thái Bình Dương từ các nước như: Myanmar, Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia, Nhật Bản, Malaysia, Nepal, New Guinea, Pakistan, Pholippines, Đài Loan, Thái Lan, Việt Nam [3;38;39;40;110;120;129] b) Cx tritaeniorhynchus Đây là véc tơ chính truyền vi rút VNNB ở châu Á, loài muỗi này đã được thu thập ở Bom Bay, Ấn Độ và đặt tên là Cx biroi Dyar, 1920 đã thu thập loài muỗi này ở Los Banos, Philippines và đặt tên là Cx summorosus Còn Baraud và Christophers, 1931 đã thu thập loài muỗi này ở Chieng Mai, Thái Lan và đặt tên là Cx siamensis Loài muỗi này phân bố hầu như khắp thế giới như các nước thuộc châu Phi (Angola, Camerun, Cộng hòa Trung Phi, Ai Cập, v.v.), các nước Nam Á và một số nước châu Âu như Togo, Thổ Nhĩ Kỳ, v.v châu Á Thái Bình Dương Loăng quăng và bọ gậy tìm thấy ở mọi nơi như đầm lầy, ao tù, mương, rãnh, v.v Nghiên cứu xác định, muỗi cái chủ yếu hút máu các loài gia súc và lợn, còn hút máu người chỉ là một sự ngẫu nhiên [3;39;50;72;81;83;129] c) Culex vishnui Đây cũng là là véc tơ chính truyền vi rút VNNB, loài muỗi này phân bố khá rộng ở hầu khắp các nước Châu Á Thái Bình Dương như Bangladesh, Myanma, Campuchia, Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia, Nhật Bản, Malaysia, Nepal, Philippines, Singapore, Sri Lanka, Đài Loan, Thái Lan, Đông Timo, Việt Nam Loăng quăng, bọ gậy được tìm thấy trong ao tù, bao gồm chỗ nước bùn, mương rãnh, ao, vũng chân gia súc, lốp bánh xe và ở đồng ruộng mới gặt, cày ải cho nước vào và ruộng lúa mới cấy Muỗi cái chủ yếu hút máu các loài chim và lợn, nhưng cũng hút cả máu người [3;39;50;121;129] d) Culex sittiens
Loài muỗi này, có khả năng truyền vi rút VNNB và giun chỉ tại Thái Lan, được phát hiện ở nhiều khu vực khác nhau như Makessar, Celebes với tên gọi Cx impellens, và ở Úc là Cx annulirostris Tại Malaya, nó được đặt tên là Cx somaliensis Loăng quăng và bọ gậy của loài muỗi này thường xuất hiện trong các dụng cụ chứa nước mặn, nước lợ và nước ngọt ven biển Muỗi cái chủ yếu hút máu từ các loài chim và lợn, nhưng cũng có thể hút máu người.
1.2.2.2 Nghiên cứu về muỗi Culicinae ở Việt Nam
Trước năm 1954, nghiên cứu về muỗi Culicinae tại Việt Nam chủ yếu do người nước ngoài thực hiện, đặc biệt trong các thập niên 1940 Từ thập niên 1950 trở đi, các nghiên cứu này chủ yếu do người Việt Nam thực hiện, tập trung vào véc tơ truyền bệnh sốt rét và bệnh VNNB ở miền Bắc Việt Nam, kết hợp với các công tác điều tra cơ bản khác.
Nghiên cứu giám sát véc tơ truyền bệnh và phân lập vi rút từ muỗi ở các vùng dịch như Việt Yên Bắc Thái, Đông Anh Hà Nội, và Gia Lương Hà Bắc (cũ) đã chỉ ra rằng các loài muỗi Culex tritaeniorhynchus, Culex vishnui, và Culex gelidus là véc tơ chính truyền bệnh viêm não Nhật Bản (VNNB) tại miền Bắc Việt Nam.
Hình 1.7 Mật độ một số loài muỗi Culex ở Cát Quế, Hoài Đức, Hà Tây (cũ) đã thu thập để phân lập vi rút viêm não Nhật Bản, 2001-2003
Nhiều nghiên cứu trong nước đã tập trung vào đặc điểm phân bố và sinh thái của muỗi truyền bệnh VNNB ở miền Bắc Việt Nam Những công trình này không chỉ xác định sự phân bố của một số loài muỗi mà còn cung cấp cái nhìn sâu sắc về vai trò của chúng trong việc lây truyền bệnh.
Nghiên cứu về muỗi Culex ở Cát Quế, Hà Tây (cũ) từ 2001-2003 cho thấy Cx tritaeniorhynchus xuất hiện quanh năm, với mật độ cao vào tháng 4 và tháng 9 Cx vishnui có mặt từ tháng 3 đến tháng 4 và từ tháng 7 đến tháng 11, với đỉnh cao trùng với Cx tritaeniorhynchus Cx gelidus chỉ được ghi nhận từ tháng 5 đến tháng 12, đạt đỉnh vào tháng 10, trong khi Cx quinquefaciatus chỉ xuất hiện trong tháng 1, 2 và tháng 11 Tại miền Bắc, virus VNNB chủ yếu được phát hiện ở ba loài muỗi: Cx tritaeniorhynchus, Cx vishnui và Cx gelidus, được xác định là véc tơ truyền virus VNNB Mật độ cao của các loài muỗi này, đặc biệt là Cx tritaeniorhynchus và Cx vishnui, có liên quan đến tần suất ca bệnh VNNB ở người.
Nghiên cứu về khu hệ và sinh thái của muỗi Culicinae, cũng như vai trò dịch tễ học của chúng trong việc truyền bệnh VNNB, là rất quan trọng Đồng thời, việc đánh giá sự nhạy cảm của các véc tơ muỗi với hóa chất diệt muỗi hiện đang sử dụng ở Việt Nam đóng góp tích cực vào công tác phòng chống các bệnh do muỗi truyền, đặc biệt trong giai đoạn chưa có vắc xin dự phòng.
Hình 1.8 Mật độ muỗi Culex tại tỉnh Sơn La, Điện Biên, Lào Cai, 2018
Nghiên cứu gần đây tại ba tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam, gồm Sơn La, Điện Biên và Lào Cai, đã phát hiện ra bốn loài muỗi thuộc chi Culex.
Cx tritaeniorhynchus chiếm tỷ lệ cao nhất 72,98%, tiếp theo là Cx vishnui
Nghiên cứu cho thấy rằng 24,91% muỗi Culex được xác định là véc tơ chính truyền bệnh VNNB, mặc dù không thực hiện phân lập vi rút từ muỗi.
VNNB đã được nghiên cứu tại Việt Nam trong các công trình trước đây [31;36] Bên cạnh đó, hai loài Cx quinquefasciatus và Cx fuscocephala cũng được ghi nhận tại hai tỉnh này, tuy nhiên, tỷ lệ của chúng khá thấp, chỉ dao động từ 0,48% đến 1,63% [38].
1.2.2.3 Nghiên cứu về muỗi Culicinae ở Tây Nguyên
Tây Nguyên hiện vẫn là khu vực bảo tồn nhiều rừng tự nhiên tại Việt Nam, với hệ sinh thái đa dạng và nhiều khu bảo tồn động vật phong phú, trong đó có một số loài mang mầm bệnh nguy hiểm có thể lây lan trong cộng đồng Nghiên cứu trước đây về thành phần và phân bố của loài Culex tại Tây Nguyên đã chỉ ra rằng, vào năm 1993, nhóm nghiên cứu do Đặng Tuấn Đạt, Nguyễn Ái Phương và Lý Thị Vi Hương dẫn đầu đã xác định được 41 loài muỗi thuộc phân họ Culicinae, bao gồm 16 loài Aedes, 8 loài Armigeres và 1 loài Mansonia.
Orthopodomya 10 loài, Malaya 01 loài, Toxorhynchites 3 loài, Tripteroides 2 loài, và đặc biệt giống Culex có 9 loài [10] Một số công trình nghiên cứu ở khu vực Tây Nguyên như trên đã phản ánh khái quát về thành phần, phân bố của muỗi Culex, tuy nhiên việc cập nhật số liệu thành phần, sự phân bố và vai trò truyền bệnh VNNB của Culex ở Tây Nguyên trong những năm gần đây và hiện tại chưa được nghiên cứu một cách hệ thống đầy đủ Do vậy rất cần có những nghiên cứu hiện tại và tương lai về lĩnh vực này, góp phần vào việc chăm sóc và bảo vệ sức khỏe cho cộng đồng các dân tộc ở Tây Nguyên.
Đặc điểm phân tử/dịch tễ sinh học phân tử vi rút viêm não Nhật Bản 23 1.4 Vài nét tổng quan khu vực Tây Nguyên
Đặc điểm phân tử và dịch tễ sinh học phân tử là các nghiên cứu di truyền dựa trên việc so sánh trình tự nucleotide hoặc axit amin của gen đích hoặc toàn bộ genome của các chủng vi sinh vật Những nghiên cứu này được thực hiện trên các mẫu từ nhiều nguồn và thời gian khác nhau, nhằm tìm hiểu quá trình lây lan của tác nhân gây bệnh Đồng thời, chúng cũng giúp xác định số lượng loại huyết thanh, nhóm genotype, phân nhóm genotype (clade) và tiểu phân nhóm genotype (cluster) đang lưu hành tại một khu vực cụ thể trong những khoảng thời gian nhất định.
Trong lĩnh vực vi sinh y học, đặc điểm phân tử và dịch tễ sinh học phân tử là phương pháp hiện đại nhất để xác định đặc điểm và nguồn gốc của tác nhân gây bệnh, cũng như sự lan truyền của chúng theo không gian và thời gian Phương pháp này đã trở thành công cụ chính xác và cần thiết trong giám sát dịch tễ học, nhờ vào khả năng cung cấp thông tin chi tiết về sự phát triển và lây lan của các tác nhân gây bệnh.
- Xác định được nguồn gốc, sự mới xuất hiện và sự lan rộng của tác nhân gây bệnh;
- Theo dõi được sự thay đổi các chủng gây bệnh ở mức phân tử theo thời gian và phân vùng địa lý;
- Theo dõi sự tiến hóa của các chủng vi sinh gây bệnh;
- Xác định được xu hướng của bệnh dịch liên quan đối với những tác nhân gây bệnh mang gene độc lực ở mức độ cao hoặc thấp;
- Trong một số trường hợp là cơ sở để phân biệt chủng phân lập có nguồn gốc từ vắc xin hay trong tự nhiên (hoang dại)
1.3.2 Sự phát triển và ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gen
1.3.2.1 Giải trình tự nucleotide a) Thế hệ thứ nhất (Phương pháp Sanger)
Phương pháp Sanger, được phát minh bởi Frederick Sanger vào năm 1977, vẫn được xem là "chuẩn vàng" trong việc giải trình tự nucleotide Phương pháp này cho phép xác định chính xác trình tự ADN của các mẫu phân tích và so sánh sự tương đồng về trình tự nucleotide giữa chúng.
Phương pháp này dựa vào cơ chế tổng hợp ADN của vi sinh vật sống, sử dụng dideoxynucleotide (ddNTP) thiếu nhóm –OH ở vị trí cacbon 2’ và 3’ Khi ADN polymerase gắn ngẫu nhiên một ddNTP vào sợi ADN đang tổng hợp, quá trình này sẽ bị ngừng lại do sự thiếu hụt nhóm –OH ở vị trí 3’, nơi nucleotide tiếp theo cần gắn vào để hình thành cầu nối phosphodiester trong quá trình kéo dài chuỗi ADN.
Mẫu vi rút đã sàng lọc
Tinh sạch sản phẩm PCR
Thực hiện phản ứng RT-PCR để nhân đoạn gen đích hiệu Tách chiết ARN của vi rút
Tinh sạch sản phẩm của phản ứng
Thực hiện phản ứng PCR giải trình tự
Xác định độ tinh sạch và nồng độ Điện di kiểm tra
Vào cuối thế kỷ XX, công nghệ giải trình tự gen đã có bước tiến lớn với việc sử dụng máy đọc tự động (Sequenser) theo nguyên lý sắc ký lỏng, cho phép xác định trình tự nucleotide dài hơn so với các phương pháp trước đây Phương pháp này được áp dụng để phát hiện các genotype mới, bằng cách thiết kế các mồi dựa trên trình tự của các chủng "consensus" Một ví dụ điển hình là nghiên cứu phát hiện genotype I và genotype V của vi rút VNNB tại các nước châu Á và Bắc Á trong vài thập kỷ qua.
Phương pháp giải trình tự thế hệ thứ hai mang lại bốn ưu điểm nổi bật so với phương pháp của Senger: tốc độ nhanh hơn, chi phí thấp hơn, khả năng xử lý nhiều mẫu trong cùng một thời gian và độ chính xác cao hơn ngay cả khi lượng ADN hạn chế.
NGS, hay giải trình tự với sản lượng cao, là một công nghệ tiên tiến cho phép giải mã ADN và ARN nhanh chóng và tiết kiệm chi phí hơn so với kỹ thuật Sanger Công nghệ này đã tạo ra một cuộc cách mạng trong nghiên cứu genome và sinh học phân tử, nhờ vào sự phát triển của nhiều công nghệ hiện đại khác nhau.
1.3.2.2 Giải trình tự acid amine a) Giới thiệu chung về các phương pháp giải trình tự acid amine
Giải trình tự protein là phương pháp xác định trình tự các acid amin trong protein, giúp hiểu rõ cấu trúc và chức năng của chúng trong cơ thể sống Kỹ thuật này đóng vai trò quan trọng trong việc nghiên cứu các chu trình tế bào, từ đó tìm ra con đường chuyển hóa và mục tiêu cho các loại thuốc.
Có hai phương pháp chính để giải trình tự protein: (1) phương pháp khối phổ và (2) phản ứng Edman sequencing Tuy nhiên, những phương pháp này đã được thay thế bởi phương pháp giải trình tự acid nucleic, một phương pháp đơn giản hơn, cho phép xác định trình tự ADN và dễ dàng dự đoán trình tự protein suy biến.
Xác định thành phần acid amin của protein là bước quan trọng để tìm ra trình tự của nó, giúp phát hiện sai sót trong quá trình giải trình tự và phân biệt các kết quả không rõ ràng Hiểu biết về tần suất các acid amin cũng hỗ trợ trong việc chọn lựa protease phù hợp để phân cắt protein.
Hình 1.10 Mô phỏng từ trình tự peptide đến giải mã genome
(Nguồn ảnh: http://www.peptideatlas.org/) b) Ứng dụng của các kỹ thuật giải trình tự acid amine
Xác định mức biểu hiện protein tại các thời điểm khác nhau là quan trọng trong việc hiểu các quá trình biệt hoá, tăng sinh và truyền tín hiệu của tế bào Thuật ngữ proteomics, xuất hiện sau năm 1970, liên quan đến việc xây dựng cơ sở dữ liệu protein Mặc dù gặp khó khăn trong việc xác định protein do thiếu phương pháp phân tích nhanh và nhạy, sự phát triển của kỹ thuật khối phổ vào năm 1990 đã tạo ra công cụ phân tích hiệu quả cho protein Proteomics không chỉ phân tích chức năng của các sản phẩm gene mà còn khám phá sự tương tác giữa các protein, từ đó đóng góp trực tiếp vào việc phát triển thuốc, vì hầu hết thuốc điều trị tác động trực tiếp lên protein.
1.3.2.3 Đặc điểm dịch tễ sinh học phân tử của vi rút viêm não Nhật Bản
Hình 1.11 Phân bố địa lý và sự lan truyền của các kiểu gen vi rút viêm não Nhật Bản
Vi rút VNNB chỉ có một type huyết thanh duy nhất, nhưng có 5 genotype
Sự phân bố của các genotype vi rút VNNB thay đổi theo từng vùng địa lý và theo thời gian, với tần suất tiến hóa di truyền rất thấp, dưới 3,2% Mối liên hệ giữa độc lực của vi rút và các genotype là một yếu tố quan trọng cần được nghiên cứu.
Phân tích genotype vi rút VNNB dựa trên trình tự nucleotide cho thấy vi rút này có 5 genotype khác nhau, với ngưỡng phân biệt là 12% Vi rút VNNB được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1935 tại Nhật Bản với chủng Nakayama thuộc genotype III, chủng này đã được sử dụng để sản xuất vắc xin phòng bệnh cho người trong hơn 50 năm Chủng SA 14-14-2 cũng thuộc genotype III và được phát triển thành vắc xin sống giảm độc lực tại Trung Quốc Ngược lại, genotype I chỉ được phát hiện 5 chủng từ người vào những năm 1970, cho thấy vi rút này có khả năng thích ứng với muỗi và lợn hơn Genotype II có một số chủng phân lập từ người và muỗi ở Malaysia, Indonesia và Bắc Úc trong các thập kỷ 1980 và 1990, nhưng chưa có báo cáo về sự tái xuất hiện gần đây Đối với genotype IV và V, vai trò gây bệnh vẫn chưa được xác định rõ, trong đó genotype IV cho thấy độc lực thấp hơn so với genotype I và III.
Các chủng vi rút VNNB đã được xác định với 5 genotype khác nhau, lưu hành chủ yếu ở Malaysia, Indonesia và New Guinea Tại Nhật Bản, chỉ có genotype III được phát hiện từ năm 1935, được cho là có nguồn gốc từ vi rút tổ tiên ở châu Phi Nghiên cứu đầu thế kỷ XXI cho thấy vi rút VNNB có thể đã xuất hiện đầu tiên ở Malaysia và Indonesia, sau đó lan rộng ra châu Á Dự đoán trong tương lai, genotype III có thể xuất hiện ở Úc, trong khi genotype II có khả năng lưu hành tại Bắc Á, bao gồm Trung Quốc và Nhật Bản.
Trong những thập kỷ qua, không có sự xuất hiện mới của vi rút VNNB genotype II tại các nước Bắc Á và vi rút VNNB genotype III tại Úc Điều này cho thấy sự ổn định trong tình hình dịch tễ học của các chủng vi rút này kể từ khi genotype II lần đầu được phát hiện ở Úc.
Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.1.1.1 Đối tượng nghiên cứu cho mục tiêu 1
Các trường hợp HCVNC nghi ngờ do vi rút và VNNB có phiếu điều tra (Phụ lục 1) ở 4 tỉnh của khu vực Tây Nguyên, 2005-2018
Tiêu chuẩn lựa chọn ca bệnh HCVNC được xác định dựa trên chẩn đoán lâm sàng, trong đó HCVNC nghi ngờ do virus phải tuân theo tiêu chuẩn của Bộ Y tế, cụ thể là theo Quyết định 4283/QĐ-BYT ban hành ngày 08 tháng 10.
Bệnh nhân mắc bệnh viêm não Nhật Bản (VNNB) thường có biểu hiện sốt đột ngột (nhiệt độ ≥37,8 oC) kèm theo các triệu chứng như đau đầu, buồn nôn, và có thể gặp rối loạn ý thức từ nhẹ đến nặng Các dấu hiệu thần kinh khác có thể xuất hiện, bao gồm dấu hiệu màng não như co cứng cơ và cổ cứng, cùng với các triệu chứng thần kinh khu trú như co giật và liệt Dịch não tuỷ của bệnh nhân thường trong, không màu Để xác định ca bệnh VNNB, cần xét nghiệm tìm kháng thể IgM kháng virus VNNB từ dịch não tuỷ hoặc huyết thanh bệnh nhân bằng kỹ thuật MAC-ELISA.
Nghiên cứu này xác định ca bệnh VNNB dựa trên kết quả xét nghiệm IgM kháng vi rút VNNB dương tính bằng kỹ thuật MAC-ELISA, được thực hiện tại các phòng xét nghiệm của Trung tâm Y tế dự phòng tỉnh và Viện VSDT Tây Nguyên.
2.1.1.2 Đối tượng nghiên cứu cho mục tiêu 2
Một số loài muỗi Culex thu thập ở 4 tỉnh của khu vực Tây Nguyên, 2005- 2018;
Vi rút VNNB được phân lập từ muỗi Culex ở Tây Nguyên, 2005-2018
2.1.1.3 Đối tượng nghiên cứu cho mục tiêu 3
Trình tự nucleotide và acid amin vùng gen E của các chủng vi rút VNNB được phân lập từ muỗi Culex ở 4 tỉnh của Tây Nguyên
Nghiên cứu được thực hiện tại 4 tỉnh thuộc khu vực Tây Nguyên: Kon Tum, Gia Lai, Đắk Lắk và Đắk Nông
Tây Nguyên, nằm ở Trung Bộ Việt Nam, là vùng núi cao rộng lớn thuộc sườn phía Tây dãy Trường Sơn, tọa độ khoảng 11°44' vĩ độ Bắc và 107°15' đến 108°50' độ kinh Đông Khu vực này bao gồm 5 tỉnh: Kon Tum, Gia Lai, Đắk Lắk, Đắk Nông và Lâm Đồng, với địa hình chủ yếu là cao nguyên.
Hình 2.1 Bản đồ hành chính khu vực Tây Nguyên
Nghiên cứu được thực hiện từ năm 2017 đến 2018.
Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu mô tả cắt ngang (cross-sectional study)
2.2.2 Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu
2.2.2.1 Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu cho mục tiêu 1
Thu thập toàn bộ số liệu, 2005-2018 liên quan đến HCVNC và ca bệnh VNNB được xác định ở 4 tỉnh của khu vực Tây Nguyên
Trong giai đoạn 2005-2018, một cuộc khảo sát đã được thực hiện với 713 bệnh nhân nhiễm virus HCVNC tại 4 tỉnh khu vực Tây Nguyên, trong đó xác định được 168 trường hợp viêm gan nhiễm virus B (VNNB).
2.2.2.2 Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu cho mục tiêu 2
1) Thu thập toàn bộ số mẫu muỗi Culex được xét nghiệm xác định khả năng nhiễm vi rút VNNB trong giai đoạn 2005-2016 Trên thực tế, nghiên cứu chỉ thu thập và sử dụng được số mẫu muỗi Culex vào 2 giai đoạn 2005-2007 và 2012-2014 để mô tả và phân lập vi rút Riêng giai đoạn 2008- 2011, nghiên cứu không thu thập được số liệu, vì đây là số liệu hồi cứu nên phụ thuộc vào các địa phương trong giai đoạn này không tiến hành hoạt động giám sát véc tơ VNNB
Mỗi mẫu có khoảng 5-50 con/mẫu bảo quản ở tủ lạnh âm sâu (-70 0 C) cho đến khi phân lập vi rút, tương ứng số mẫu muỗi Culex thu được 138 mẫu với
5.368 cá thể muỗi của giai đoạn 2005-2007 và 236 mẫu với 8.351 cá thể muỗi thu thập giai đoạn 2012-2014 để mô tả và xét nghiệm khả năng nhiễm vi rút VNNB
2) Mẫu muỗi Culex thu thập tại thực địa trong 2 năm (2017-2018): cá thể muỗi/nhà x 15 nhà/điểm x 10 điểm x 2 đợt, như vậy tổng số muỗi thu thập được tối thiểu là 300 cá thể muỗi
Nghiên cứu đã thu thập được 372 cá thể muỗi Culex cái trưởng thành từ thực địa, sau khi định loại, xử lý và bảo quản trong Nitơ lỏng Các mẫu muỗi này được chuyển đến phòng thí nghiệm của Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương để tiến hành phân lập vi rút.
Mỗi mẫu phân lập vi rút tương ứng với một cá thể muỗi, với dự kiến thu thập 100 mẫu từ loài muỗi Culex Tuy nhiên, kết quả thực tế cho thấy đã phân lập được 166 mẫu vi rút.
2.2.2.3 Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu cho mục tiêu 3
Chọn mẫu theo phương pháp thuận tiện, toàn bộ chủng vi rút VNNB phân lập từ muỗi Culex ở khu vực Tây Nguyên trong thời gian nghiên cứu từ 2005-
Vào năm 2018, các mẫu virus đã được xác định dương tính thông qua kỹ thuật RT-PCR Những chủng virus này được bảo quản ở nhiệt độ -70 độ C tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cho đến khi tiến hành nghiên cứu.
1) Số liệu hồi cứu: 04 chủng vi rút phân lập từ muỗi Culex, 2007 trong giai đoạn thu thập mẫu muỗi Culex, 2005-2007
2) Số liệu thực hiện tại thực địa trong 2 năm (2017-2018): 05 chủng vi rút phân lập từ muỗi Culex trong năm 2018
Nội dung nghiên cứu
2.3.1 Các biến số, chỉ số nghiên cứu
TT Các biến số/chỉ số Loại biến
Phương pháp thu thập thông tin Mục tiêu 1
1 Giới Nhị phân Hồi cứu;
2 Tuổi Liên tục Hồi cứu;
3 Dân tộc Phân loại Hồi cứu;
4 Nghề nghiệp Phân loại Hồi cứu;
5 Nơi thường trú Địa danh Hồi cứu;
6 Thời gian mắc bệnh Liên tục Hồi cứu;
7 Nơi mắc bệnh, lấy mẫu xét nghiệm và điều trị Địa danh Hồi cứu;
8 Kết quả xét nghiệm về chẩn đoán VNNB Phân loại Hồi cứu;
9 Ca bệnh Phân loại Hồi cứu;
1 Thành phần loài muỗi Culex Phân loại Hồi cứu;
2 Phân bố từng loài muỗi Culex Phân loại Hồi cứu;
3 Tỷ lệ nhiễm tối thiểu của một loài muỗi Culex với vi rút VNNB Liên tục Hồi cứu;
1 Vi rút VNNB và xác định genotype Phân loại Hồi cứu;
2 Cây di truyền phả hệ Định danh Hồi cứu;
3 So sánh về sự tương đồng trình tự nucleotide Phân loại Hồi cứu;
4 Đột biến acid amin Phân loại Hồi cứu;
2.3.2 Kỹ thuật và công cụ thu thập thông tin
2.3.2.1 Kỹ thuật và công cụ thu thập thông tin, cách tiến hành, đánh giá kết quả cho mục tiêu 1
Tỷ lệ mắc HCVNC, VNNB/100.00 dân của từng tỉnh và khu vực theo năm, theo giai đoạn
Tỷ lệ chết VNNB trên 100.000 dân của từng tỉnh và khu vực theo năm, theo giai đoạn
Phân bố số mắc HCVNC, VNNB theo huyện của từng tỉnh và khu vực theo năm, theo giai đoạn
Phân bố số mắc HCVNC, VNNB theo tháng tại của từng tỉnh và khu vực theo năm, theo giai đoạn
Phân bố số mắc HCVNC, VNNB theo nhóm tuổi tại của từng tỉnh và khu vực theo năm, theo giai đoạn
Trong giai đoạn từ năm 2017 đến ngày 31 tháng 12 năm 2018, chúng tôi đã tiến hành điều tra và thu thập số liệu tại Viện Vệ sinh dịch tễ Tây Nguyên cùng với các Trung tâm y tế dự phòng tại các tỉnh Kon Tum, Gia Lai, Đắk Lắk và Đắk Nông.
Tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Tây Nguyên và Trung tâm Y tế Dự phòng, hệ thống báo cáo và giám sát tình hình dịch bệnh được triển khai tại các tỉnh Gia Lai, Kon Tum, Đắk Lắk và Đắk Nông Các mẫu xét nghiệm bệnh nhân HCVNC được thu thập bao gồm mẫu huyết thanh và dịch não tủy, với kết quả xét nghiệm VNNB được hồi cứu thông qua phương pháp MAC-ELISA tại Phòng thí nghiệm Viện VSDTTN.
Bài viết này tập trung vào việc thu thập thông tin về bệnh nhân VNNB, bao gồm các yếu tố như tuổi, giới tính, nghề nghiệp, dân tộc và kết quả xét nghiệm VNNB Dữ liệu được thu thập thông qua phương pháp hồi cứu, dựa trên các số liệu đã được ghi nhận và quan sát, ghi chép theo phiếu điều tra trong phụ lục 1.
Các trường hợp nghi ngờ nhiễm virus HCVNC sẽ được lấy mẫu huyết thanh hoặc dịch não tủy để xác định bệnh viêm não Nhật Bản (VNNB) Phương pháp chẩn đoán sử dụng kỹ thuật MAC-ELISA để phát hiện IgM kháng virus, dựa trên nguyên lý của kỹ thuật ELISA gián tiếp.
- Kỹ thuật MAC-ELISA chẩn đoán VNNB từ huyết thanh/DNT
Sử dụng bộ sinh phẩm MAC-ELISA từ Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, tiến hành thực hiện và đánh giá kết quả theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Hình 2.3 Sơ đồ kỹ thuật MAC-ELISA chẩn đoán VNNB
Kỹ thuật MAC-ELISA dựa trên nguyên lý sử dụng IgG kháng IgM người đặc hiệu, được gắn trên bản nhựa 96 giếng hoặc thanh nhựa 2 x 8 giếng Khi mẫu xét nghiệm chứa IgM, nó sẽ kết hợp với IgG kháng IgM Nếu mẫu xét nghiệm có IgM đặc hiệu kháng virus viêm não Nhật Bản, nó sẽ tương tác với kháng nguyên viêm não Nhật Bản khi tiếp xúc.
IgG kháng vi rút VNNB gắn enzyme sẽ kết hợp với kháng nguyên, tạo thành phức hợp với cơ chất không màu Tetramethylbenzidine (TMB) và Hydrogen Peroxide Dưới tác động của Hydrogen Peroxide, cơ chất không màu sẽ chuyển sang màu xanh Khi dừng phản ứng bằng axít, màu xanh sẽ chuyển thành màu vàng.
Sự hiện diện của IgM đặc hiệu kháng vi rút VNNB trong mẫu được xác định thông qua sự chuyển màu Các mẫu chứng âm và mẫu thử không có IgM đặc hiệu kháng vi rút VNNB sẽ không xuất hiện màu sắc.
- Tiêu chuẩn nhận định một trường hợp bị VNNB :
Phát hiện được IgM trong dịch não tuỷ, nhưng không phát hiện được IgM trong mẫu máu lấy cùng ngày: Bị HCVNC do vi rút VNNB (tiêu chuẩn vàng)
Trong giai đoạn cấp, không phát hiện được IgM trong dịch não tuỷ và mẫu huyết thanh lấy cùng ngày, nhưng phát hiện IgM trong mẫu huyết thanh lần thứ hai cho thấy bệnh nhân bị HCVNC do vi rút VNNB với sự chênh lệch hiệu giá kháng thể.
Không phát hiện IgM trong dịch não tuỷ, nhưng có IgM trong huyết thanh cùng ngày và mẫu huyết thanh thứ hai (không có chênh lệch hiệu giá kháng thể giữa hai mẫu): Chẩn đoán HCVNC do nguyên nhân khác.
2.3.2.2 Kỹ thuật và công cụ thu thập thông tin, cách tiến hành, đánh giá kết quả cho mục tiêu 2
Thành phần loài muỗi Culex bao gồm các cá thể thuộc giống Culex đã được thu thập và định loại để kiểm tra khả năng nhiễm virus VNNB.
Phân bố của từng loài muỗi Culex được xác định dựa trên số lượng cá thể thu thập tại các điểm nghiên cứu ở các địa phương khác nhau.
Tỷ lệ nhiễm vi rút VNNB ở muỗi Culex được tính bằng cách chia số lượng mẫu muỗi dương tính (được xác nhận qua sequencing) cho tổng số cá thể muỗi trong các mẫu, sau đó nhân với 1000.
Từ năm 2005 đến 2016, nghiên cứu đã thu thập và khai thác toàn bộ số liệu về thành phần, phân bố và vai trò truyền bệnh của muỗi Culex Trong năm 2018, Viện Vệ sinh dịch tễ Tây Nguyên và Viện Vệ sinh dịch tễ Trung Ương đã phân lập vi rút VNNB từ các mẫu muỗi trong giai đoạn này.
Tiến hành điều tra và bắt muỗi tại thực địa nhằm xác định và phân loại các loài muỗi Culex, từ đó thống kê mô tả thành phần và phân bố của chúng Mẫu muỗi sẽ được bảo quản và vận chuyển về Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương để xét nghiệm khả năng nhiễm virus VNNB Địa điểm điều tra được lựa chọn dựa trên các yếu tố sinh địa cảnh thuận lợi cho sự phát triển của muỗi Culex, như gần ruộng lúa, vườn cây ăn quả và khu vực chăn nuôi gia súc, đặc biệt là những nơi có bệnh nhân VNNB ghi nhận trong giai đoạn 2015-2018 Ngoài ra, các tiêu chí khác như vùng địa lý, phân khu hành chính và khả năng nhân lực, vật lực cũng được xem xét khi lựa chọn điểm điều tra và thu thập muỗi.
Hình 2.4 Bản đồ vị trí các điểm thu thập muỗi Culex , 2017-2018