(LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu tạo hạt nano polymer bọc alpha mangostin và bước đầu đánh giá hoạt tính kháng ung thư in virtro của hạt tạo được​

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Dòng tế bào ưng thư và các điều kiện nuôi

Dòng tế bào ung thư phổi A549 được mua từ bộ sưu tấp giống của Hoa

Tế bào ung thư phổi A549, được cung cấp bởi American Type Culture Collection (ATCC) tại Manassas, Hoa Kỳ, được nuôi trong môi trường DMEM Môi trường này được bổ sung với L-glutamine 2 mM, HEPES 10 mM, natri pyruvate 1.0 mM và huyết thanh phôi bò 10% (FBS; Gibco, Hoa Kỳ), và được duy trì trong tủ ấm ở nhiệt độ 37°C với 5% CO2.

Nguyên liệu thực vật

Vỏ quả măng cụt, được thu mua từ tỉnh Bình Dương, đã được Viện sinh thái và Tài nguyên vi sinh vật xác định tên khoa học là Garcinia mangostana.

L Nguyên liệu được sấy khô trong tủ ấm ở 60 o C, nghiền thành bột mịn và sau đó được ngâm chiết trong ethanol 96% theo tỉ lệ 1 nguyên liệu: 3 thể tích dung môi Dịch chiết rút sau đó được cô chân không và sử dụng như nguyên liệu khởi đầu cho các bước tinh sạch tiếp theo.

Hóa chất, thiết bị

-Bản silica gel tráng sẵn (Silicagel 60 F254) được mua từ hãng Mecrk (Đức)

-Hạt Silica gel cho chạy cột sắc ký (Grade 7734, 63-200 μm, 70-

230 mesh) được mua từ hãng Mecrk (Đức)

-Alpha, Beta và Hydroxy - β cyclodextrin được mua từ hãng Sigma (Hoa Kỳ) Eudragit RS 100 và RL 100 mua từ hãng Evonik (Singapore)

-Các dung môi dùng trong sắc ký có độ sạch phân tích và có nguồn gốc từ Trung Quốc

-Môi trường nuôi cấy tế bào (Invitrogen, Hoa Kỳ)

-Tất cả các hoá chất đều đạt độ tinh khiết cho phân tích

- Ống thủy tinh sắc ký

- Máy soi bản gel sắc ký lớp mỏng

- Máy quay cất khô chân không

- Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao

- Kính hiển vi đồng tụ quét laser

Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Tinh sạch AMG từ vỏ quả măng cụt

2.4.1.1 Tách các hợp chất polyphenol bằng sắc ký lớp mỏng (TLC)

Phân tích được thực hiện trên bản sắc ký dày 1mm (Silicagel 60 F254, Merck) với các hệ dung môi như: i) Toluene: ethyl acetate: acetone: formic acid (TEAF) theo tỉ lệ 5:3:2:1; ii) n-Hexane: acetone theo tỉ lệ 3:1 và 2:1; iii) n-Hexane: ethyl acetate theo tỉ lệ 3:1 Sau khi sắc ký, bản sắc ký được làm khô ở nhiệt độ phòng và màu sắc các vạch được quan sát dưới ánh sáng thường hoặc xông hơi.

2.4.1.2 Sắc ký cột silica gel

Sắc ký là kỹ thuật quan trọng trong việc tách, phân li và phân tích các chất, dựa vào sự phân bố khác nhau giữa pha động và pha tĩnh Đặc biệt, sắc ký cột là một phương pháp hiệu quả trong việc thực hiện các phân tích này.

Pha tĩnh là chất rắn, thường được chế biến từ alumin hoặc silica gel, được nén chặt vào trong một cột có kích thước được tính toán dựa trên khối lượng mẫu cần nạp.

- Pha động : là chất lỏng, được gọi là dung môi rửa giải

Trong thí nghiệm này, các phân đoạn chứa chất quan tâm được tách biệt trên các cột sắc ký nhồi hạt silica kích thước 70 - 230 mesh (Merck) bằng hệ dung môi đã được lựa chọn, sử dụng các bước gradient khác nhau Sau đó, các phân đoạn tinh sạch được kiểm tra độ sạch thông qua sắc ký lớp mỏng và đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H NMR, 13C NMR (Bruker Avance - 500, Hoa Kỳ).

2.4.1.3 Phân tích cấu trúc hóa học bằng cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Đối với phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân, chất nghiên cứu sau khi được đưa vào vùng từ trường Bo sẽ bị tách thành những proton có các mức năng lượng khác nhau từ thấp đến cao Sự khác nhau này được phản ánh thông qua tần số cộng hưởng Tần số này được ghi lại dưới dạng các phổ proton, carbon, HMBC, HPQC, COSY, NOESY nhờ máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker, Avance 500 (Hoa kỳ) Dựa vào độ dịch chuyển của các proton khi giải các phổ trên sẽ xác định được số nguyên tử C, H cũng như những nhóm chức có thể tham gia vào bộ khung carbon Kết hợp với những số liệu thu được từ máy đo khối phổ sẽ cho phép xác định cấu trúc hoá học của chất cần nghiên cứu

2.4.2 Tạo hạt nano polyme micelle bọc AMG (nanomangostin) và đánh giá các đặc trưng của hạt

2.4.2.1 Phương pháp tổng hợp vật liệu hạt nanomangostin

Phương pháp khuyếch tán dung dịch sẽ được áp dụng để tổng hợp hạt nanomangostin Các vật liệu polymer như α, β, hydroxy-β cyclodextrin và Eudragit RS/RL 100 sẽ được thử nghiệm nhằm tạo ra hạt nanomangostin Những chất mang này có cấu trúc đơn giản, tan tốt trong nước và an toàn sinh học, và chưa từng được sử dụng trong các nghiên cứu về hạt nanomangostin trước đây.

2.4.2.2 Xác định thế zeta của hạt

Nanomangostin particles were characterized for their surface charge and particle size distribution using a Dynamic Light Scattering (DLS) system (Zetasizer Ver.6.20, Malvern Instruments – UK).

2.4.2.3 Xác định kích thước hạt

Hạt nanomangostin được xác định về hình thái và kích thước thông qua việc sử dụng kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường FE-SEM (Hitachi-S4800, Nhật Bản) và kính hiển vi đồng tụ quét laser (Olimpus, Nhật Bản).

2.4.2.4 Xác định hàm lượng AMG

Hàm lượng AMG trong sản phẩm cuối cùng được xác định bằng phương pháp đo quang phổ tại bước sóng A243 nm, sử dụng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (Hitachi, detector DAD L2455, Nhật Bản) Chất chuẩn AMG (Sigma-Aldrich) được hòa tan trong methanol với nồng độ thích hợp.

Dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1 mg/ml được pha loãng trong methanol để tạo ra dãy chuẩn làm việc Mẫu hạt NMG cũng được chuẩn bị tương tự và các dung dịch này được trộn đều trước khi lọc qua màng lọc 0.45μm Hàm lượng AMG được xác định bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với các điều kiện sắc ký như sau: sử dụng cột Kromosilk -C18 RP (4.6 x 250 mm, 5μm) và tốc độ dòng chảy với pha động là methanol (kênh A) và nước (kênh B).

= 95:5; Tốc độ dòng chảy: 1ml/min, detector (DAD): 319 nm; nhiệt độ cột:

2.5 Hoạt tính gây độc lên dòng tế bào ung thư phổi A549

Hoạt tính ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư được đánh giá bằng phương pháp MTT Tế bào ung thư A 549 (10^5 tế bào/ml) được xử lý trong 24 giờ với chất nghiên cứu ở các nồng độ khác nhau (0; 2,5; 5,0; 10; 20,0 μg/ml) hòa tan trong DMSO đối với AMG hoặc nước đối với NMG Sau khi ủ, dung dịch MTT 0,1 μg/ml được thêm vào mỗi giếng và tế bào được ủ ở 37°C trong 4 giờ Môi trường nuôi tế bào sau đó được loại bỏ và DMSO (150 μL) được thêm vào để hòa tan kết tủa formazan, từ đó xác định hoạt tính ức chế 50% phát triển tế bào.

Hoạt tính gây độc lên dòng tế bào ung thư phổi A549

Đánh giá sự thâm nhập của hạt NMG vào tế bào

Dựa trên khả năng phát huỳnh quang của AMG khi được kích thích ở bước sóng 445 nm và phát quang ở bước sóng 480 nm, chúng tôi đã sử dụng tính chất này để đánh giá khả năng thâm nhập của hạt NMG vào tế bào ung thư.

Tế bào A549 được xử lý với AMG không nano hóa và hạt NMG ở nồng độ thích hợp Sau 6 giờ xử lý, mẫu thí nghiệm sẽ được rửa sạch bằng PBS và cố định với paraformaldehyde 4% trong 30 phút Cuối cùng, tế bào sẽ được quan sát trực tiếp dưới kính hiển vi đồng tụ quét laser IX71 (Olympus, Shinjuku, Tokyo, Nhật Bản) với độ phóng đại 96X.

Xử lý thống kê

2.6 Đánh giá sự thâm nhập của hạt NMG vào tế bào

Chúng tôi đã khai thác khả năng phát huỳnh quang của AMG, được kích thích ở bước sóng 445 nm và phát quang ở bước sóng 480 nm, để đánh giá khả năng thâm nhập của hạt NMG vào tế bào ung thư.

Tế bào A549 được xử lý với AMG không nano hóa và hạt NMG ở nồng độ thích hợp Sau 6 giờ, mẫu thí nghiệm được rửa sạch bằng PBS và cố định với paraformaldehyde 4% trong 30 phút Cuối cùng, tế bào được quan sát dưới kính hiển vi đồng tụ quét laser IX71 (Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan) với độ phóng đại 96X.

2.7 Đánh giá ảnh hưởng của NMG đến kích thước nhân tế bào

Sau khi xử lý tế bào ung thư phổi A549 với NMG và AMG tự do ở nồng độ IC50, các tế bào sẽ được ủ với Hoechst 33342 ở nồng độ 1.6 uM trong 30 phút Sau đó, tế bào được rửa bằng PBS và quan sát dưới kính hiển vi đồng tụ quét laser (IX71 inverted fluorescent microscope, Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan).

Các số liệu được xử lý bằng phương pháp thống kê sử dụng tiêu chuẩn t- test hoặc ANOVA trong trường hợp so sánh nhiều mẫu với giá trị p < 0,05.