Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu
Vật liệu nghiên cứu
- Dòng tế bào ung thư tủy xương myeloma Sp2/0
- Kháng nguyên: 3 loại kháng nguyên bao gồm
+ Progesterone Antigen (Mã code MBS238011, hãng Mybiosource, Mỹ) + Progesterone-3-BSA Antigen (Mã code LA330, hãng EastCoast Bio,Mỹ)
+ Proesterone-3-CMO: BSA Antigen (Mã code ND-R0752, hãng
* Các thiết bị thí nghiệm
- Tủ nuôi tế bào có điều hòa nhiệt độ và CO2 tự động
- Tủ cấy vụ trựng sử dụng đốn cực tớm và màng lọc 0,25àm (Microflow, Anh)
- Chai lọ nuôi cấy, pipet các loại
* Các hóa chất thí nghiệm
- DMEM (Dulbeco Modified Eagle Medium);
- Freund’s Complete Adjuvant (FCA), Freund’s Incomplete Adjuvant (FIA)
- PEG (Polyethylene glycol-PEG 1500), FCA (Freundcomplex Adjuvant)
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian tiến hành từ tháng 11 năm 2018 đến tháng 9 năm 2019
+ Bệnh viện Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam
+ Phòng thí nghiệm của Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Nội dung nghiên cứu
3.3.1 Gây miễn dịch cho chuột thuần chủng BALB/c bằng các kháng nguyên khác nhau
3.3.2 Thu số lượng tế bào lympho B ở chuột gây miễn dịch
3.3.3 Đánh thức và nuôi cấy tế bào Myeloma Sp2/0 dùng để dung hợp với tế bào Lympho B
3.3.4 Sàng lọc tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng bằng phản ứng ELISA 3.3.5 Nuôi cấy tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu progesterone
3.3.6 Xác định nồng độ kháng thể đơn dòng được tạo ra trong dịch báng của chuột BALB/c
3.3.7 Kiểm tra khả năng bắt cặp đặc hiệu, bắt cặp chéo giữa kháng thể đơn dòng với các kháng nguyên
Phương pháp nghiên cứu
3.4.1 Phương pháp gây miễn dịch cho chuột thuần chủng BALB/c bằng các kháng nguyên khác nhau
Hai loại kháng nguyên ProgesteroneAntigen và Progesterone-3-BSA Antigen, Progesterone-3-CMO:BSA Antigen được pha loãng với nồng độ khác nhau trong dung dịch PBS 1x vô trùng Kháng nguyên đã pha loãng được sử dụng để tạo nhũ tương với chất bổ trợ Freund’s Complete Adjuvant (FCA) và Freund’s Incomplete Adjuvant (FIA) theo tỷ lệ 1:1 Hỗn dịch được trộn đều để đảm bảo đồng nhất trong các xi lanh.
Chuẩn bị 135 con chuột BALB/c thuần chủng, khỏe mạnh và không mang thai, với độ tuổi lý tưởng khoảng 6 tuần Những con chuột này cần được nuôi dưỡng trong điều kiện đảm bảo để tối ưu hóa khả năng tạo kháng thể Mỗi kháng nguyên sẽ được thử nghiệm trên 15 con chuột với các nồng độ khác nhau nhằm đánh giá khả năng gây miễn dịch.
Chúng tôi đã tiến hành gây miễn dịch cho chuột bằng bốn nồng độ kháng nguyên khác nhau: 50 µg/lần/con, 100 µg/lần/con, 200 µg/lần/con và 300 µg/lần/con, đồng thời sử dụng một nhóm đối chứng không có kháng nguyên Mỗi nồng độ được lặp lại ba lần, với khoảng cách giữa các lần tiêm là ba ngày.
Trước khi tiêm, cần sát trùng vùng bàn chân chuột bằng bông cồn 70 độ và tránh tiêm vào các mạch máu lớn Đảm bảo cung cấp đủ thức ăn và nước uống cho chuột, đồng thời theo dõi chúng ít nhất hai lần mỗi ngày Nếu vết tiêm có dấu hiệu hoại tử, cần loại bỏ chuột và thay thế bằng con khác để đảm bảo miễn dịch Số lượng chuột thí nghiệm được bố trí hợp lý.
Kháng nguyên Lần thí nghiệm
Nồng độ khỏng nguyờn(àg/lần/con)
Chuột được gây miễn dịch theo phương pháp của Kõhler và Milstein
(1975), có cải tiến (Liddell and Cryer, 1991) như sau:
- Phối trộn kháng nguyên với các chất bổ trợ FAC (lần đầu tiên) và FAI (lần tiếp theo) theo tỷ lệ 1:1
- Gây miễn dịch cho chuột bằng phương pháp tiêm vào gan bàn chân chuột (lặp lại 3 lần, mỗi lần cách nhau 3 ngày)
- Lấy máu ở tim và thu huyết thanh sau 10 ngày gây miễn dịch để đánh giá khả năng đáp ứng bằng phương pháp ELISA
Hình 3.1 Gây miễn dịch cho chuột BALB/c 3.4.2 Phương pháp thu số lượng tế bào lympho B ở chuột gây miễn dịch
Lách và hạch bẹn của 5 chuột mỗi nhóm có đáp ứng miễn dịch tốt nhất được thu theo phương pháp của Oliver JP.Leger và Jose Wsaldanha (2000)
Hình 3.2 Thu hạch bẹn chuột Hình 3.3 Thu lách chuột
Hình 3.4 Nghiền nhỏ hạch bẹn và lách chuột
- Giết chuột đã được gây miễn dịch bằng kháng nguyên Progesterone, khử trùng chuột bằng cồn 70 0 C
Tách thuỳ lách và các hạch lympho, cho vào đĩa petri chứa 10ml dung dịch PBS Sử dụng kéo để cắt thuỳ lách và các hạch thành những mảnh nhỏ, sau đó dùng kẹp để gạt nhẹ, giúp các tế bào rơi ra.
Chuyển hỗn hợp tế bào vào ống ly tâm và đánh tơi để tách rời các tế bào Sử dụng pipet paster để hút và đẩy dung dịch, giúp cụm tế bào tách ra Sau đó, để dung dịch lắng cặn, hút dung dịch tế bào sang ống ly tâm khác Cuối cùng, ly tâm dung dịch tế bào ở tốc độ 1000 vòng/phút trong 5 phút để thu được kết quả chính xác.
Để loại bỏ dịch nổi và hòa cặn tế bào, thực hiện quy trình này với 10ml PBS và lặp lại 3 lần Ở lần cuối cùng, hòa cặn tế bào trong môi trường DMEM có bổ sung 10% FBS, với mật độ tế bào đạt 10^9 tế bào/ml.
3.4.3 Phương pháp đánh thức và nuôi cấy tế bào Myeloma Sp2/0 dùng để dung hợp với tế bào Lympho B
- Đánh thức và nuôi cấy tế bào Myeloma Sp2/0
Chuyển ống tế bào Myeloma Sp2/0 từ Nitơ lỏng sang bể ủ ấm 37 độ C để rã đông và khử trùng bên ngoài bằng cồn 70 độ C Sau đó, chuyển dung dịch tế bào sang ống ly tâm và ly tâm với tốc độ 1000 vòng/phút trong 5 phút Gạn bỏ lớp dịch nổi và hòa tan cặn tế bào với môi trường nuôi DMEM, rồi chuyển dung dịch tế bào sang chai nuôi cấy Cuối cùng, đặt chai nuôi trong tủ ấm với điều kiện 37 độ C và 5% CO2.
Sau khi tế bào được đánh thức và phát triển bình thường, cần đạt được mật độ tế bào từ 10^6 đến 10^7 tế bào/ml trong môi trường nuôi cấy Mỗi 2 - 3 ngày, môi trường nuôi cấy cần được thay mới do sự thay đổi pH và chất dinh dưỡng Nếu không thay môi trường kịp thời, tế bào sẽ bị chết Quy trình thay môi trường bao gồm việc ly tâm để loại bỏ môi trường cũ trước khi bổ sung môi trường mới.
7 ml môi trường nuôi cấy phù hợp, để tủ ấm 37oC, 5% CO2 và tiếp tục nuôi
- Bảo quản tế bào trong lạnh sâu
Chọn tế bào khỏe mạnh với tỷ lệ sống trên 95% và không bị nhiễm tạp khuẩn Thay môi trường cũ bằng môi trường mới, sử dụng pipet để làm cho tế bào phân tán đều Sau đó, chuyển dung dịch tế bào vào ống li tâm và li tâm ở 1000 vòng/phút trong 5 phút Gạn bỏ dịch nổi và hòa cặn tế bào với môi trường 10% FBS, sau đó cho dung dịch vào ống cất Tiến hành làm lạnh từ từ đến âm 25oC, sau đó nhanh chóng chuyển ống cất vào lạnh âm 70oC Cuối cùng, sau 20 giờ, chuyển vào bình Nitơ lỏng để bảo quản.
- Dung hợp tế bào tế bào lympho B với myeloma Sp2/0
Hỗn dịch tế bào lympho B với nồng độ 10^8/ml được phối trộn với tế bào myeloma Sp2/0 Sau khi thêm 1ml PEG và khuấy đều trong 1 phút, tiếp tục thêm 3,5ml môi trường huyết thanh có bổ sung HAT sau 5 phút và ủ qua đêm ở 37°C với 5% CO2 Cuối cùng, li tâm hỗn dịch tế bào, hòa cặn vào 30ml môi trường huyết thanh có bổ sung HAT và phân phối vào các giếng của đĩa 96 giếng để ủ trong tủ ấm.
Tại nhiệt độ 37 độ C, sau khi tiến hành dung hợp trong khoảng 5 – 7 ngày, thêm vào mỗi giếng 0,1 ml môi trường huyết thanh có bổ sung HAT Sau 10 ngày dung hợp, tiến hành thu thập dịch nổi và sử dụng phản ứng ELISA để phát hiện kháng thể mong muốn.
Chọn tế bào từ các giếng có hiệu giá kháng thể cao để tách dòng
3.4.4 Sàng lọc dòng tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng bằng phương pháp ELISA
Pha loãng progesterone đến nồng độ 2 àg/ml trong dung dịch Bicarbonate và BSA, sau đó đạt nồng độ 2 àg/ml trong PBS 1x Vortex mạnh để tạo dung dịch đồng nhất Sử dụng pipet đa kênh để thêm 100 àl progesterone và BSA đã pha loãng vào mỗi giếng của đĩa ELISA, ủ qua đêm ở 4 o C hoặc 2 giờ ở 37 o C Chuẩn bị dung dịch rửa PBS có bổ sung 0.5% Tween 20 Sau khi ủ, loại bỏ kháng nguyên trong đĩa bằng cách vẩy mạnh và úp ngược đĩa trong vài phút Thêm 200 àl dung dịch rửa vào mỗi giếng, lắc nhẹ đĩa vài lần, sau đó loại bỏ dung dịch rửa và úp ngược đĩa, gõ nhẹ lên giấy thấm để loại bỏ hoàn toàn dung dịch rửa Lặp lại bước rửa này 3 lần.
Pha loãng BSA trong PBS 1x với nồng độ 5% (w/v) và cho vào mỗi giếng 100 µl, sau đó lắc nhẹ đĩa để dung dịch phân bố đều Ủ ở 37°C trong 1 giờ, sau đó rửa các giếng 3 - 4 lần Dùng pipet hút 100 µl dịch tế bào từ các giếng có tế bào lai trong đĩa nuôi cấy tế bào và chuyển sang các giếng của đĩa ELISA, tiếp tục ủ trong tủ 37°C trong 1 giờ.
Để đảm bảo tế bào không chết nhanh chóng, cần bổ sung môi trường nuôi vào các giếng đã hút dịch kháng thể đơn dòng Sau khi ủ, rửa các giếng 3 lần bằng PBS có 0.5% Tween 20 Tiếp theo, pha loãng dung dịch BSA 5% với HRP IgG Antimouse theo tỉ lệ 1/2500 và cho vào mỗi giếng 100 µl Ủ đĩa ở 37°C trong 1 giờ và lặp lại bước rửa 3-4 lần Sau đó, thêm 100 µl TMB vào mỗi giếng, lắc nhẹ để dịch đều trên mặt đĩa, và ủ ở nhiệt độ thường, tránh ánh sáng trong 15 phút Cuối cùng, bổ sung 100 µl HCL 1M vào mỗi giếng để dừng phản ứng và đọc kết quả trên máy ELISA ở bước sóng 630 nm.
3.4.5 Phương pháp nuôi cấy tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu progesterone
Tiến hành nuôi cấy 5 dòng tế bào lai (E4, E3, C6, H3, F10) tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên Progesterone Antigen
