Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ sinh học
Thời gian nghiên cứu
Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 02/2017 đến tháng 10/2017 Thí nghiệm được tiến hành vào vụ Xuân Hè năm 2017.
Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu bao gồm các giống cà chua nhập khẩu, các tổ hợp lai cà chua thế hệ F1 và F2, cùng với gen Ph3 kháng bệnh sương mai, được cung cấp bởi Viện nghiên cứu Rau quả Tên và nguồn gốc của từng giống sẽ được liệt kê trong các thí nghiệm cụ thể.
- Hóa chất phục vụ nghiên cứu được đặt mua của hãng Sigma và Fermentas Các cặp mồi đặt mua từ công ty Invitrogen cung cấp
- Thiết bị sử dụng như máy PCR, máy điện di, máy nghiền, máy ly tâm, tủ định ôn… tại Viện Nghiên cứu Rau quả.
Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát sự đa hình với gen Ph3 của các chỉ thị phân tử
- Xác định chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen kháng bệnh sương mai cà chua Ph3
- Ứng dụng chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen kháng Ph3 xác định kiểu gen Ph3 của các tổ hợp lai cà chua
Đánh giá năng suất và đặc điểm nông sinh học của các tổ hợp lai cà chua mang gen Ph3 trong vụ Xuân Hè tại Gia Lâm, Hà Nội, cho thấy sự phát triển mạnh mẽ và khả năng chống chịu sâu bệnh tốt Nghiên cứu này cung cấp thông tin quý giá về tình hình sâu bệnh, giúp nông dân áp dụng các biện pháp phòng trừ hiệu quả, từ đó nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm cà chua.
Phương pháp nghiên cứu
3.5.1 Phương pháp xác định chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen Ph3
3.5.1.1 Phương pháp khảo sát sự đa hình với gen Ph3 của các chỉ thị phân tử a Mẫu giống
Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng các giống cà chua kháng, chống chịu và nhiễm bệnh sương mai tiến hành thí nghiệm như danh sách trong bảng 3.1:
Bảng 3.1 Danh sách các giống cà chua nghiên cứu
Dòng/giống Kiểu gen Ph3 Nơi thu thập
(08TP76 X 08TP65)5-3-7-3-3-1-1 Ph3/Ph3 FAVRI
Hồng đào Ph3/ph3 Công ty Sygenta
Anna ph3/ph3 Công ty Seminis
Savior ph3/ph3 Công ty Sygenta
Nguồn: DNA này sẽ được dùng để khảo sát các chỉ thị phân tử liên kết với gen Ph3 kháng bệnh sương mai b Chỉ thị phân tử
Nghiên cứu sử dụng 5 chỉ thị phân tử đã được xác định từ các nghiên cứu trước, bao gồm TOM236 (Zhu et al., 2006), SCU602F3R3 (Trương Thị Hồng Hải và cộng sự, 2015), cùng với 3 chỉ thị SSR383, SSR69 và LB3 (Kết quả đề tài, 2009).
2012) Các chỉ thị lựa chọn tập trung trên vai dài nhiễm sắc thể số 9, gần vị trí chỉ thị TG591 (chỉ thị RFLP)
Hình 3.1 Vùng khảo sát chỉ thị phân tử liên kết với gen Ph3 trên nhiễm sắc thể số 9 c Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Tách chiết DNA từ mẫu lá non giai đoạn 2 đến 3 lá thật được thực hiện theo phương pháp cải tiến của Dorokhov và Klocke (1998) để xác định chỉ thị phân tử liên kết với gen Ph3 Để kiểm tra độ tinh khiết của DNA, phương pháp điện di trên gel agarose 1% được sử dụng Dưới tác động của điện trường, DNA di chuyển từ cực âm sang cực dương, với các đoạn DNA lớn di chuyển chậm hơn và các đoạn ngắn di chuyển nhanh hơn, cho phép phân tách các đoạn DNA trên gel Cuối cùng, phản ứng PCR được thực hiện với các cặp mồi liên kết với gen Ph3 kháng bệnh sương mai và các mẫu giống khác nhau.
Phản ứng PCR qua 5 chỉ thị nghiên cứu xác định trên các mẫu giống được liệt kờ trong bảng 3.1 Thành phần mỗi phản ứng 10àl như bảng 3.2 dưới đõy:
Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR với mồi
Húa chất Thể tớch (àl)
Nước (Di H2O) 5,9 Đệm (Buffer 10X) 1,0 dNTPs (10mM) 1,0
Sau khi đã có đủ thành phần, hàm lượng các chất cần thiết, tiến hành đặt chương trình chạy cho máy Chu trình nhiệt trong máy PCR như sau:
Bảng 3.3 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR
Bước Nhiệt độ ( 0 C) Thời gian Số chu kỳ
( * ): Nhiệt độ gắn mồi- có thể thay đổi tùy theo từng cặp mồi cụ thể
- Kiểm tra kết quả điện di sản phẩm PCR của từng chỉ thị Điện di trên gel agarose1,5%, trong dung dịch đệm TAE 0,5X, dưới hiệu điện thế 160V trong
70 phút Sau đó, các băng DNA được quan sát khi đưa vào máy Geldoc
3.5.1.2 Phương pháp xác định mức độ liên kết của chỉ thị phân tử thông qua đánh giá sự tương đồng giữa kiểu gen và kiểu hình tính kháng bệnh
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã lựa chọn 5 chỉ thị phân tử liên quan đến gen Ph3 để kiểm tra tính đa hình trên các dòng giống kháng nhiễm Việc điều tra kiểu gen Ph3 được thực hiện trên quần thể F2 từ tổ hợp lai F1 giữa dòng 08TP73-10-4 mang gen kháng Ph3 và dòng 08TP03-15-3-1 không mang gen kháng Đồng thời, kiểu hình kháng nhiễm cũng được đánh giá qua lây nhiễm nhân tạo Khoảng cách di truyền được tính toán theo phương pháp của Nei (1978) dựa trên tỷ lệ % cá thể trao đổi chéo của từng chỉ thị So sánh tỷ lệ % cây trao đổi chéo giữa 5 chỉ thị, chỉ thị nào có tỷ lệ % thấp nhất sẽ cho thấy sự liên kết chặt chẽ nhất với gen Ph3 kháng bệnh sương mai.
Hình 3.2 Sơ đồ tạo quần thể F2 của tổ hợp lai 08TP03-15-3-1 x 08TP73-10-4
Nguồn: Viện Nghiên cứu Rau quả
Hạt giống được xử lý bằng dung dịch NaOCl 1% trong 15 phút, sau đó rửa sạch dưới vòi nước trong 30 phút và hong khô trước khi gieo Trong nhà lưới, hạt được gieo vào khay nhựa 72 lỗ chứa giá thể nền hữu cơ GT05, phối trộn với xơ dừa sạch theo tỉ lệ 1:1 Từ quần thể F2, chọn ngẫu nhiên 96 cây để tách chiết DNA và đeo thẻ nhằm đánh giá kiểu kình kháng nhiễm qua phương pháp lây nhiễm bệnh nhân tạo.
Lây nhiễm bệnh nhân tạo
Theo Leontine Colon et al (2004), lây nhiễm bệnh nhân tạo được thực hiện bằng phương pháp lá tách rời Sau 30-35 ngày gieo, khi cây có 5-6 lá thật, ngắt lá thật thứ 4 đã phát triển đầy đủ, sạch bệnh và ghi thẻ đánh dấu Lá cà chua được đặt lên môi trường thạch nước trong đĩa Petri, sau đó nhỏ 30 µl dung dịch bào tử nấm sương mai (5000 bào tử/ml) vào giữa mỗi lỗ Sau khi lây nhiễm, hộp Petri được đậy kín và giữ ở nhiệt độ 17°C Đánh giá kiểu hình kháng nhiễm bệnh của 96 cá thể quần thể F2 được thực hiện sau 7 ngày, xác định số bào tử hình thành: Kháng bệnh (R): 0- ≤ 1x10^4 bào tử/ml; Chống chịu (H): 1,5- < 9,5 x 10^4 bào tử/ml; Nhiễm bệnh (S): >10^4 bào tử/ml.
Hình 3.3 Lây nhiễm bệnh nhân tạo trên lá tách rời Nguồn nấm bệnh:
Chủng phân lập RIFAV được thu thập từ khu ruộng thí nghiệm của Viện Nghiên Cứu Rau Quả tại Gia Lâm, Hà Nội, trong vụ Đông Xuân 2017 Lá bệnh điển hình đã được thu thập và phân lập theo phương pháp cải tiến của Caten và Jinks (1968) trên môi trường V8.
Hình 3 4 Quá trình phân lập nấm sương mai (A-mẫu bệnh, B- Phân lập trên môi trường V8, C- Hình dạng bọc bào tử động dưới kính hiển vi)
Sau khi phân lập, nguồn bệnh được kiểm tra lại bằng cách xác định hình thái bọc bào tử động qua kính hiển vi Để duy trì tính độc cao, các isolate nấm được bảo quản liên tục trên mẫu lá cà chua tươi ở nhiệt độ từ 17°C đến 18°C.
3.5.2 Phương pháp xác định kiểu gen Ph3 của các tổ hợp lai cà chua
Sử dụng chỉ thị phân tử LB3 để xác định kiểu gen Ph3 của các tổ hợp lai cà chua, liên kết chặt nhất với gen Ph3 từ thí nghiệm đã thực hiện.
Bảng 3 4 Các tổ hợp lai cà chua tiến hành xác định kiểu gen Ph3
TT Ký hiệu Tên giống/tổ hợp lai Nơi thu thập
Gieo hạt trong nhà lưới và khi cây phát triển đến giai đoạn có 5-6 lá thật, tiến hành tách chiết DNA để điều tra khả năng chứa gen Ph3 Đồng thời, thực hiện lây nhiễm nhẫn tạo sử dụng chủng phân lập đã được xác định.
3.5.3 Đánh giá năng suất, đặc điểm nông sinh học và tình hình sâu bệnh của các tổ hợp lai cà chua ở vụ Xuân Hè năm 2017 tại Gia Lâm- Hà Nội
Trong thí nghiệm năm 2017, các tổ hợp lai có kiểu gen Ph3 đã được so sánh về năng suất, đặc điểm nông sinh học và tình hình sâu bệnh hại Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên hoàn chỉnh với 5 tổ hợp lai (V1 đến V5), trong đó V1 là giống lai F1 Savior làm đối chứng Hạt được gieo trên khay 40 x 60 cm với giá thể GT05 và xơ dừa theo tỷ lệ 1:1, giữ ẩm và đặt trong nhà lưới để tránh côn trùng Cây con được trồng ra ruộng khi có 5-6 lá thật, với mật độ khoảng 2,8 vạn cây/ha Luống trồng rộng 1,5 m, cao 20 cm, trồng hàng đôi với khoảng cách 65 cm giữa các hàng và 40 cm giữa các cây Phân bón được sử dụng bao gồm 100% phân hữu cơ, 100% phân lân, 1/3 phân đạm và 1/3 phân kali, với lượng đạm và kali còn lại được chia đều trong ba lần bón thúc.
Theo dõi đánh giá các tính trạng nông sinh học
- Theo dõi đặc điểm về chỉ tiêu sinh trưởng của cây:
+ Chiều cao cây cuối cùng (cm): Đo tính từ cổ rễ đến đỉnh sinh trưởng cây
+ Dạng hình sinh trưởng: Tùy theo khả năng sinh trưởng mà chia thành các dạng hình sinh trưởng bán hữu hạn, hữu hạn và vô hạn
- Theo dõi các đặc điểm hình thái và phẩm chất quả:
+ Chiều cao quả (mm) (H): Đo bằng thước kẹp của 10 quả trung bình
+ Đường kính quả (mm) (D): Đo bằng thước kẹp tại vị trí to nhất của 10 quả trung bình
Độ dày thịt quả được đo từ vỏ đến vị trí tiếp xúc với ngăn hạt tại phần lớn nhất của quả, với mẫu quả lấy từ chùm quả 2 đến chùm quả 3 Mỗi lần đo, sử dụng 10 quả mẫu và thực hiện bằng thước panme.
+ Độ Brix (%): Đo bằng chiết quang kế
+ Số ngăn hạt trên quả: Đo 10 quả tính trung bình
Chỉ số hình dạng quả được xác định bằng công thức I = H/D, trong đó I là chỉ số hình dạng, H là chiều cao quả và D là đường kính quả Dựa vào giá trị của chỉ số hình dạng, quả có thể được phân loại thành ba dạng: nếu I > 1,1 thì quả có dạng dài, I = 0,8-1,1 thì quả có dạng tròn, và I < 0,8 thì quả có dạng dẹt.
+ Màu sắc quả khi chín: Vàng, đỏ vàng, đỏ bình thường, đỏ cờ, đỏ thẫm
- Các yếu tố cấu thành năng suất bao gồm:
+ Khối lượng trung bình quả (g): Số quả mẫu 5 quả/ lần nhắc lại
+ Năng suất thực thu (tấn/ha): Tổng khối lượng quả đến khi kết thúc thu hoạch trên 1 đơn vị diện tích (Thu hoạch khi quả chín)
Năng suất thương phẩm (tấn/ha) của cây cà chua được xác định bằng tổng khối lượng quả thu hoạch trên mỗi đơn vị diện tích, theo tiêu chuẩn TCVN 4845: 2007 Để đánh giá tình hình nhiễm sâu bệnh, cần xem xét bệnh sương mai và xoăn vàng lá theo quy chuẩn quốc gia QCVN 01-63:2011/BNNPTNT, nhằm khảo nghiệm giá trị canh tác và sử dụng giống cà chua.
- Bệnh sương mai (Phytophthora infestans Debary): Giai đoạn sau trồng
Trong quá trình quan sát mức độ nhiễm bệnh trên thân lá trong khoảng thời gian 30, 60 và 90 ngày, chúng ta sử dụng thang điểm đánh giá như sau: Điểm 1 biểu thị không có bệnh; Điểm 3 cho thấy dưới 20% diện tích thân lá bị nhiễm bệnh; Điểm 5 chỉ ra rằng 20% đến 50% diện tích trên thân lá bị nhiễm; Điểm 7 thể hiện tình trạng nhiễm bệnh từ 50% đến 75% diện tích; và Điểm 9 cho biết hơn 75% đến 100% diện tích thân lá bị nhiễm bệnh.
- Bệnh xoăn vàng lá: Giai đoạn đánh giá từ trồng đến thu hoạch Tiến hành đếm số cây có triệu chứng bệnh, tính tỷ lệ % cây bệnh (%)
3.5.4 Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lí bằng phần mềm Microsoft Excel và xử lý thống kê với chương trình phần mềm xử lý thống kê SAS 9.1.
