Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng thí nghiệm của Bộ môn Công nghệ sinh học và khu đồng ruộng của Viện Nghiên cứu Rau quả, tọa lạc tại Trâu Quỳ, Gia Lâm, Hà Nội.
Thời gian nghiên cứu
Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 02/2017 đến tháng 10/2017 Thí nghiệm được tiến hành vào vụ Xuân Hè năm 2017.
Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu bao gồm các mẫu giống cà chua nhập khẩu, các tổ hợp lai cà chua F1 và F2, cùng với gen Ph3 kháng bệnh sương mai, được thu thập từ Viện Nghiên cứu Rau quả Danh sách tên và nguồn gốc của từng giống sẽ được trình bày trong các thí nghiệm cụ thể.
- Hóa chất phục vụ nghiên cứu được đặt mua của hãng Sigma và Fermentas Các cặp mồi đặt mua từ công ty Invitrogen cung cấp
- Thiết bị sử dụng như máy PCR, máy điện di, máy nghiền, máy ly tâm, tủ định ôn… tại Viện Nghiên cứu Rau quả.
Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát sự đa hình với gen Ph3 của các chỉ thị phân tử
- Xác định chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen kháng bệnh sương mai cà chua Ph3
- Ứng dụng chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen kháng Ph3 xác định kiểu gen Ph3 của các tổ hợp lai cà chua.
Phương pháp nghiên cứu
3.5.1 Phương pháp xác định chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen Ph3 3.5.1.1 Phương pháp khảo sát sự đa hình với gen Ph3 của các chỉ thị phân tử a Mẫu giống
Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng các giống cà chua kháng, chống chịu và nhiễm bệnh sương mai tiến hành thí nghiệm như danh sách trong bảng 3.1:
Bảng 3.1 Danh sách các giống cà chua nghiên cứu
Nguồn: DNA này sẽ được dùng để khảo sát các chỉ thị phân tử liên kết với gen Ph3 kháng bệnh sương mai b Chỉ thị phân tử
Nghiên cứu sử dụng 5 chỉ thị phân tử được xác định từ các nghiên cứu trước, bao gồm TOM236 (Zhu et al., 2006), SCU602F3R3 (Trương Thị Hồng Hải và cs, 2015), cùng với 3 chỉ thị SSR383, SSR69, và LB3 (Kết quả đề tài, 2009-2012) Những chỉ thị này tập trung vào vùng dài của nhiễm sắc thể số 9, gần vị trí chỉ thị TG591 (chỉ thị RFLP).
Hình 3.1 Vùng khảo sát chỉ thị phân tử liên kết với gen Ph3 trên nhiễm sắc thể số 9 c Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Tách chiết DNA từ mẫu lá non ở giai đoạn 2 đến 3 lá thật được thực hiện để xác định chỉ thị phân tử liên kết với gen Ph3, theo phương pháp cải tiến của Dorokhov và Klocke (1998) Để kiểm tra độ tinh khiết của DNA, phương pháp điện di trên gel agarose 1% được áp dụng Dưới tác động của điện trường, DNA mang điện tích âm di chuyển từ cực âm sang cực dương, với các đoạn DNA lớn di chuyển chậm hơn và các đoạn ngắn di chuyển nhanh hơn, cho phép phân tách các đoạn DNA trên gel agarose Cuối cùng, phản ứng PCR được thực hiện với các cặp mồi liên kết với gen Ph3 kháng bệnh sương mai và các mẫu giống khác nhau.
Phản ứng PCR qua 5 chỉ thị nghiên cứu xác định trên các mẫu giống được liệt kờ trong bảng 3.1 Thành phần mỗi phản ứng 10àl như bảng 3.2 dưới đõy:
Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR với mồi Hóa chất
Nước (Di H 2 O) Đệm (Buffer 10X) dNTPs (10mM)
Sau khi đã có đủ thành phần, hàm lượng các chất cần thiết, tiến hành đặt chương trình chạy cho máy Chu trình nhiệt trong máy PCR như sau:
Bảng 3.3 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR
( * ): Nhiệt độ gắn mồi- có thể thay đổi tùy theo từng cặp mồi cụ thể
Kiểm tra kết quả điện di sản phẩm PCR cho từng chỉ thị bằng cách điện di trên gel agarose 1,5% trong dung dịch đệm TAE 0,5X Quá trình điện di diễn ra dưới hiệu điện thế 160V trong 70 phút, sau đó các băng DNA được quan sát bằng máy Geldoc.
3.5.1.2 Phương pháp xác định mức độ liên kết của chỉ thị phân tử thông qua đánh giá sự tương đồng giữa kiểu gen và kiểu hình tính kháng bệnh
Trong thí nghiệm này, chúng tôi đã lựa chọn 5 chỉ thị phân tử liên kết với gen Ph3 để kiểm tra đa hình trên các dòng và giống kháng nhiễm Kiểu gen Ph3 được điều tra bằng chỉ thị phân tử DNA trên quần thể F2 từ hạt tổ hợp lai F1 giữa dòng 08TP73-10-4 chứa gen kháng và dòng 08TP03-15-3-1 nhiễm bệnh Đồng thời, kiểu hình kháng nhiễm được đánh giá thông qua lây nhiễm nhân tạo Khoảng cách di truyền được tính theo phương pháp của Nei (1978) dựa trên tỷ lệ % cá thể trao đổi chéo của từng chỉ thị Việc so sánh tỷ lệ % cây trao đổi chéo giữa 5 chỉ thị cho phép xác định chỉ thị có liên kết chặt nhất với gen Ph3 kháng bệnh sương mai.
Hình 3.2 Sơ đồ tạo quần thể F 2 của tổ hợp lai 08TP03-15-3-1 x 08TP73-10-4
Hạt giống được xử lý bằng dung dịch NaOCl 1% trong 15 phút, sau đó rửa sạch dưới vòi nước trong 30 phút và hong khô trước khi gieo Trong nhà lưới, gieo hạt vào khay nhựa 72 lỗ với giá thể hữu cơ GT05, phối trộn với xơ dừa sạch theo tỉ lệ 1:1 Từ quần thể F2, chọn ngẫu nhiên 96 cây để tách chiết DNA và đánh giá kiểu kình kháng nhiễm thông qua lây nhiễm bệnh nhân tạo.
Lây nhiễm bệnh nhân tạo
Theo Leontine Colon et al (2004), lây nhiễm bệnh nhân tạo được thực hiện bằng phương pháp lá tách rời (Lê Hồng Vinh và cs., 2008) Sau 30-35 ngày gieo, khi cây có 5-6 lá thật, ngắt lá thật thứ 4 đã phát triển đầy đủ, sạch bệnh và ghi thẻ đánh dấu Lá cà chua được đặt lên môi trường thạch nước trong đĩa Petri, sau đó sử dụng Micropipet nhỏ để thêm 30µl dung dịch bào tử nấm sương mai (5000 bào tử/ml) Sau khi lây nhiễm, hộp Petri được đậy kín và giữ trong tủ định ôn 17°C Đánh giá kiểu hình kháng nhiễm bệnh của 96 cá thể quần thể F2 được thực hiện sau 7 ngày lây nhiễm bằng cách xác định số bào tử hình thành, với các mức độ kháng bệnh được phân loại như sau: Kháng bệnh (R): 0- ≤ 1x10^4 bào tử/ml; Chống chịu (H): 1,5- < 9,5 x 10^4 bào tử/ml; Nhiễm bệnh (S): >10^4 bào tử/ml.
Hình 3.3 Lây nhiễm bệnh nhân tạo trên lá tách rời Nguồn nấm bệnh:
Sử dụng chủng phân lập RIFAV, thu thập tại khu ruộng thí nghiệm của Viện Nghiên Cứu Rau Quả, Gia Lâm- Hà Nội, vụ Đông Xuân
2017 Lá bệnh điển hình được thu thập và phân lập theo phương pháp của Caten và Jinks (1968) có cải tiến trên môi trường V8
Hình 3 4 Quá trình phân lập nấm sương mai (A-mẫu bệnh, B- Phân lập trên môi trường V8, C- Hình dạng bọc bào tử động dưới kính hiển vi)
Sau khi tiến hành phân lập, nguồn bệnh được kiểm tra lại thông qua việc xác định hình thái bọc bào tử động dưới kính hiển vi Để bảo đảm tính độc cao, các isolate nấm được bảo quản liên tục trên mẫu lá cà chua tươi ở nhiệt độ từ 17 đến 18 độ C.
3.5.2 Phương pháp xác định kiểu gen Ph3 của các tổ hợp lai cà chua
Sử dụng chỉ thị phân tử LB3, có liên kết chặt nhất với gen Ph3 từ thí nghiệm, để xác định kiểu gen Ph3 của các tổ hợp lai cà chua.
Bảng 3 4 Các tổ hợp lai cà chua tiến hành xác định kiểu gen Ph3
Gieo hạt trong nhà lưới cho đến khi cây phát triển 5-6 lá thật, sau đó tiến hành tách chiết DNA để điều tra khả năng chứa gen Ph3 và thực hiện lây nhiễm nhẫn tạo sử dụng chủng phân lập.
3.5.3 Đánh giá năng suất, đặc điểm nông sinh học và tình hình sâu bệnh của các tổ hợp lai cà chua ở vụ Xuân Hè năm 2017 tại Gia Lâm- Hà Nội
Trong thí nghiệm đánh giá các tổ hợp lai có kiểu gen Ph3 vào vụ Xuân Hè năm 2017, năng suất, đặc điểm nông sinh học và tình hình sâu bệnh hại đã được so sánh Thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh với 5 tổ hợp lai từ V1 đến V5, trong đó V1 là giống lai F1 Savior làm đối chứng, và được lặp lại 3 lần Hạt được gieo vào ngày 5 tháng 2 năm 2017 trên khay 40 x 60 cm với giá thể GT05 trộn xơ dừa theo tỷ lệ 1:1, mỗi khay có 40 đến 50 lỗ Cây được giữ ẩm thường xuyên và đặt trong nhà lưới để tránh côn trùng và che mưa, và được trồng ra ruộng khi có 5 đến 6 lá thật.
Thí nghiệm đặt tại Viện Nghiên cứu Rau quả, đại diện vùng Đồng bằng sông
Luống trồng rau có kích thước rộng 1,5 m và cao 20 cm, được thiết kế để trồng hàng đôi với khoảng cách giữa các hàng là 65 cm và giữa các cây là 40 cm Mỗi ô thí nghiệm sẽ trồng 40 cây, đạt mật độ khoảng 28.000 cây/ha Để đảm bảo dinh dưỡng cho cây, cần bón lót 100% phân hữu cơ và 100% phân lân, cùng với 1/3 lượng phân đạm và 1/3 phân kali Lượng phân đạm và kali còn lại sẽ được chia đều và bón thúc ba lần kết hợp với việc xới vun đất.
Theo dõi đánh giá các tính trạng nông sinh học
- Theo dõi đặc điểm về chỉ tiêu sinh trưởng của cây:
+ Chiều cao cây cuối cùng (cm): Đo tính từ cổ rễ đến đỉnh sinh trưởng cây.
+ Dạng hình sinh trưởng: Tùy theo khả năng sinh trưởng mà chia thành các dạng hình sinh trưởng bán hữu hạn, hữu hạn và vô hạn
- Theo dõi các đặc điểm hình thái và phẩm chất quả:
+ Chiều cao quả (mm) (H): Đo bằng thước kẹp của 10 quả trung bình.
+ Đường kính quả (mm) (D): Đo bằng thước kẹp tại vị trí to nhất của 10 quả trung bình
Độ dày thịt quả được đo từ vỏ đến điểm tiếp xúc với hạt tại phần lớn nhất của quả, với mẫu quả lấy từ chùm quả 2 đến chùm quả 3 Mỗi lần đo, số lượng quả mẫu là 10 quả, sử dụng thước panme để đảm bảo độ chính xác.
+ Độ Brix (%): Đo bằng chiết quang kế
+ Số ngăn hạt trên quả: Đo 10 quả tính trung bình
Chỉ số hình dạng quả được tính bằng công thức I = H/D, trong đó I là chỉ số hình dạng, H là chiều cao quả và D là đường kính quả Dựa vào chỉ số này, quả có thể được phân loại thành ba dạng khác nhau.
I > 1,1: Dạng quả dài, I = 0,8- 1,1: Dạng quả tròn và I < 0,8: Dạng quả dẹt.
+ Màu sắc quả khi chín: Vàng, đỏ vàng, đỏ bình thường, đỏ cờ, đỏ thẫm.
- Các yếu tố cấu thành năng suất bao gồm:
+ Khối lượng trung bình quả (g): Số quả mẫu 5 quả/ lần nhắc lại
+ Năng suất thực thu (tấn/ha): Tổng khối lượng quả đến khi kết thúc thu hoạch trên 1 đơn vị diện tích (Thu hoạch khi quả chín)