Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu
Đối tượng, địa điểm, nguyên liệu nghiên cứu
Ngan Pháp và vịt Super Meat đang nghi ngờ mắc bệnh nấm phổi (Aspergillosis) Những con ngan và vịt này được nuôi tại các hộ gia đình và trang trại ở 6 xã: Nam Phong, Nam Triều, Hồng Thái, Chuyên Mỹ, Đại Thắng, và Đại Xuyên, với độ tuổi từ 5 đến 15 ngày.
- Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm, bộ môn Bệnh lý, khoa Thú y – Học Viện Nông nghiệp Việt Nam
- Địa điểm theo dõi và lấy mẫu: Tại 6 xã: Nam Phong, Nam Triều, Hồng Thái, Chuyên Mỹ,Đại Thắng, Đại Xuyên
Mẫu bệnh phẩm để chẩn đoán Aspergillosis ở ngan và vịt bao gồm các bộ phận như phổi, túi khí, tim, gan, não, ruột và dạ dày Để làm tiêu bản vi thể, cần sử dụng các hóa chất như Formol 10%, cồn, xylen, paraffin, thuốc nhuộm heamatoxylin và thuốc nhuộm eosin.
Máy đúc tự động, máy cắt Microtom, máy li tâm lạnh, máy votex, máy PCR, máy chạy điện di, máy chụp ảnh gel, tủ ấm 37 0 C, tủ lạnh
Các dụng cụ khác gồm: lam kính, kính hiển vi, ống eppendoft, pipet, găng tay….
Nội dung nghiên cứu
- Xác định tỷ lệ mắc, tỷ lệ chết của đàn ngan, vịt bị bệnh nấm phổi tại Phú Xuyên – Hà Nội
- Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng của ngan, vịt mắc bệnh nấm phổi
- Xác định sự biến đổi bệnh tích đại thể của ngan, vịt mắc bệnh nấm phổi ở Phú Xuyên – Hà Nội
- Xác định sự biến đổi bệnh tích vi thể của bệnh.
Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phương pháp xác định triệu chứng lâm sàng và bệnh tích Để xác định triệu chứng lâm sàng của ngan, vịt mắc bệnh nấm phổi được xác định bằng phương pháp khám thường quy, theo dõi các chỉ tiêu về trạng thái bên ngoài: ăn uống, hô hấp và trạng thái cơ thể
Mổ khám ngan và vịt bị bệnh nhằm kiểm tra các dấu hiệu bệnh tích, bao gồm việc quan sát sự biến đổi của niêm mạc phổi, túi khí, yết hầu, màng ngực, bao tim, gan, màng treo ruột và não của động vật mắc bệnh.
3.3.2 Phương pháp xác định các chỉ tiêu theo dõi
Căn cứ vào triệu chứng lâm sàng, bệnh tích Xác định tỷ lệ mắc bệnh , tỷ lệ chết, tỷ lệ tử vong theo công thức:
Số con ngan, vịt mắc nấm phổi
Số con mắc nấm phổi
3.3.3 Phương pháp điều tra lấy mẫu
3.3.4 Phương pháp làm tiêu bản vi thể
* Lấy mẫu bệnh phẩm để kiểm tra bệnh tích vi thể
Khi tiến hành mổ khám để quan sát hạt nấm trong các cơ quan phủ tạng, việc lấy mẫu bệnh phẩm nhằm kiểm tra những biến đổi bệnh tích không thể nhìn thấy bằng mắt thường là rất quan trọng Để đảm bảo độ chính xác, cần phải chọn lọc, bảo quản và cố định mẫu bệnh phẩm theo đúng phương pháp.
+ Bệnh phẩm lấy không dày quá 0,5 cm, đủ rộng để định được tổ chức gốc, hai mặt cắt phải song song
Bệnh phẩm cần được lấy từ cả phần lành và phần bệnh, với miếng tổ chức tươi, tốt nhất là thực hiện ngay sau khi giết mổ Đối với ngan và vịt chết, việc lấy mẫu phải được thực hiện trong vòng 6 giờ sau khi chết để tránh hiện tượng hoại tử.
+ Động tác lấy mẫu phải nhẹ nhàng, chính xác tránh đụng chạm mạnh vì dễ gây dập nát do tác nhân cơ học
+ Không dùng kẹp, panh kẹp vào những vùng tổ chức sẽ lấy mẫu Không bóp mạnh, rửa mẫu
+ Khi cắt phải dùng dao sắc và cắt theo một hướng
+ Lấy mẫu xong phải cố định ngay, tránh hiện tượng tự hoại tử sau khi chết của tế bào
Tất cả các tổ chức cơ thể lấy bệnh phẩm đều được ngâm trong dung dịch cố định Đặc biệt, đối với phổi, thường được bọc trong một lớp bông trước khi ngâm vào thuốc cố định.
- Chiều dày mẫu vật có ảnh hưởng đến kết quả cố định, do vậy chiều dày bệnh phẩm không được quá 0,5cm
- Khối lượng thuốc cố định tối thiểu là một phần mẫu vật, chín phần thuốc cố định
Thời gian cố định của mẫu vật phụ thuộc vào từng loại thuốc sử dụng Thông thường, quá trình cố định diễn ra trong khoảng 24-48 giờ Nếu thời gian này vượt quá, cần phải loại bỏ hóa chất cũ và thay thế bằng chất cố định mới.
- Nhiệt độ cố định cao thì khả năng ngấm của chất cố định tăng, nhiệt độ thông thường là 30-37 O C
- Rửa mô sau khi cố định để làm mất các chất cố định, thời gian rửa ngang với thời gian cố định là tốt nhất
Thuốc cố định chất khoáng: axit khoáng và muối khoáng
Thuốc cố định axit khoáng: acid chromic, acid osmic
Thuốc cố định muối khoáng: bichromat kiềm, bichromat acid…
Thuốc cố định hữu cơ:
Các acid hữu cơ: acid acetic, acid picric
Các chất khử oxy hữu cơ: methylic, ethylic, folmandehyd
Thuốc cố định hỗn hợp
Dung dịch Bouin (acid acetic, acid picric, focmol)
Dung dịch Duboscq – Brasin (cồn, focmol, acid acetic, acod picric)
Dung dịch Carnoy (cồn, chloroform, acid acetic)
Những thuốc cố định thường dùng là:
Nước cất vừa đủ 10ml
Dung dịch acid picric bão hoà 75ml
* Phương pháp tạo khuôn mẫu vật:
Mục đích của việc tạo khuôn mẫu vật là gắn mẫu vật vào một khối nến, giúp nến thấm vào các chi tiết nhỏ nhất của tổ chức và tế bào Khi nến đông lại, nó tạo thành một khối duy nhất, giúp việc cắt mô thành những lát mỏng trở nên dễ dàng hơn Điều này là cần thiết cho việc chẩn đoán vi thể trên kính hiển vi quang học.
Nến là một chất được chiết xuất từ dầu mỏ, với các điểm nóng chảy dao động từ 35 đến 65 độ C Nó không hòa tan trong nước và chỉ tan một chút trong cồn, nhưng dễ dàng hòa tan trong các dung môi như chloroform, toluene và xylen Để tạo khuôn cho nến, cần thực hiện qua nhiều giai đoạn khác nhau.
Khử nước là bước quan trọng trong quá trình xử lý bệnh phẩm, bắt đầu bằng việc ngâm bệnh phẩm đã cố định vào các nồng độ cồn khác nhau (70°, 90°, 100°) để loại bỏ nước Mỗi cốc cồn chỉ cần ngâm sâu khoảng 1cm trên bề mặt miếng bệnh phẩm, và thời gian khử nước phụ thuộc vào độ dày của mẫu Mục đích của việc này là rút hết nước mà không làm thay đổi cấu trúc bên trong của bệnh phẩm Để kiểm tra xem bệnh phẩm đã khử nước hoàn toàn hay chưa, cho miếng bệnh phẩm vào cốc xylol; nếu cốc xylol trong thì bệnh phẩm đã khô, còn nếu cốc xylol đục màu trắng sữa thì cần tiếp tục khử nước trong cồn 100°.
Dung dịch để khử nước là loại cồn etylic, methylic, butylic
Để xử lý bệnh phẩm, dung dịch nến được sử dụng để tẩy cồn sau khi đã rút nước Dung dịch này cần có khả năng hòa tan cả cồn và nến, trong đó xylol thường được sử dụng Thời gian ngâm bệnh phẩm sẽ phụ thuộc vào loại dung dịch, thường là chuyển qua hai cốc cho đến khi mẫu bệnh phẩm trong suốt như miếng thạch.
+ Làm ngấm nến: Miếng bệnh phẩm đã được làm trong chuyển qua 3 bát nến nóng chảy với nhiệt dộ phù hợp
Để tạo khuôn bệnh phẩm, đầu tiên cần lấy miếng bệnh phẩm ngấm nến từ bát nến và đặt vào đáy khuôn có nến nóng chảy Lưu ý định hướng miếng bệnh phẩm sao cho mặt cắt nằm xuống dưới Sau khi đặt xong, làm lạnh khuôn trong nước hoặc tủ lạnh Cuối cùng, đánh dấu bệnh phẩm bằng cách sử dụng que nhọn viết vào cạnh khối nến.
Phương pháp cắt bệnh phẩm nhằm mục đích tạo ra những lát mỏng cho phép ánh sáng xuyên qua, phục vụ cho việc nghiên cứu bằng kính hiển vi quang học Quá trình cắt bệnh phẩm được thực hiện qua bốn giai đoạn trên máy.
Để chuẩn bị khuôn nến, trước tiên cần gọt khối nến thành hình chóp cụt, sau đó làm phẳng mặt cắt của khối nến sát với miếng bệnh phẩm Cuối cùng, gắn khối nến đã chuẩn bị vào bộ phận mang trên máy.
- Đặt dao vào máy: độ lệch của lưỡi dao khoảng từ 15 – 30 o so với mặt của khối nến
Trước khi cắt bệnh phẩm, cần điều chỉnh độ dày, bắt đầu từ 10-16 micromet Sau đó, sử dụng khối nến để cắt với độ dày điều chỉnh từ 3-5 micromet.
Để dán lát cắt vào phiến kính, trước tiên cần lấy băng đã cắt ra khỏi lưỡi dao một cách nhẹ nhàng và cẩn thận Sau đó, đặt băng lên phiến giấy đen và tách một lát cắt ra để chuẩn bị dán Trước khi dán, lát cắt cần được giãn phẳng bằng cách đặt vào nồi nước nóng 40 độ C Sau khi lát cắt được làm phẳng, vớt ra và dán lên phiến kính bằng dung dịch lòng trắng trứng.
