HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ĐỖ THÙY LINH NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG β-LACTAM CỦA CÁC CHỦNG SALMONELLA PHÂN LẬP TỪ THỊT GÀ TẠI CÁC CHỢ TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ HÀ NỘI Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Người hướng dẫn khoa học: TS Dương Văn Nhiệm NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2018 download by : skknchat@gmail.com LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn, thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày… tháng… năm… Tác giả luận văn Đỗ Thùy Linh i download by : skknchat@gmail.com LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn, tơi nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy cô giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Dương Văn Nhiệm – Bộ môn Thú y Cộng đồng tận tình hướng dẫn, dành nhiều cơng sức, thời gian tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập thực đề tài Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia, đặc biệt cám ơn PGS.TS Lê Thị Hồng Hảo – Viện trưởng, ThS Nguyễn Thành Trung – Phụ trách Khoa Vi sinh vật cán Khoa Vi sinh vật tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập, thực đề tài hoàn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận văn Hà Nội, ngày… tháng… năm… Tác giả luận văn Đỗ Thùy Linh ii download by : skknchat@gmail.com MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt .v Danh mục bảng vi Danh mục hình vii Trích yếu luận văn viii Thesis abstract ix Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài .1 1.2 Mục đích Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Vi khuẩn Salmonella 2.1.1 Khái niệm Salmonella 2.1.2 Khả gây bệnh Salmonella 2.1.3 Gia cầm – vật chủ chứa Salmonella 2.2 Tình hình nhiễm Salmonella gia cầm 2.2.1 Tình hình nhiễm Salmonella gia cầm giới 2.2.2 Tình hình nhiễm Salmonella gia cầm Việt Nam 2.3 Kháng sinh kháng kháng sinh .9 2.3.1 Lịch sử phát triển kháng sinh 2.3.2 Kháng sinh β-lactam 2.3.3 Cephalosporin kháng sinh phổ rộng 10 2.3.4 Kháng kháng sinh 11 2.3.5 Cơ chế kháng kháng sinh vi khuẩn 13 2.3.6 Kháng Cephalosporine .15 2.3.7 Enzyme B-lactamase phổ rộng 16 2.3.8 Kháng kháng sinh vi khuẩn Salmonella 19 2.4 Các phương pháp sử dụng để phân lập, đánh giá tính kháng kháng sinh, xác định gen kháng thuốc (gen mã hóa enzyme β-lactamse) vi khuẩn Salmonella .21 iii download by : skknchat@gmail.com 2.4.1 Các phương pháp phát Salmonella 21 2.4.2 Các phương pháp đánh giá tính kháng kháng sinh – kháng sinh đồ 22 2.4.3 Các phương pháp xác định gen mã hóa enzyme β-lactamse 26 Phần Đối tượng, nội dung phương pháp nghiên cứu 29 3.1 Đối tượng, địa điểm, thời gian nghiên cứu 29 3.2 Nội dung nghiên cứu 30 3.3 Phương pháp nghiên cứu 30 3.3.1 Phương pháp lấy mẫu, bảo quản lưu trữ mẫu .30 3.3.2 Phương pháp phân lập Salmonella 31 3.3.4 Phương pháp xác định gen kháng kháng sinh 41 Phần Kết thảo luận 44 4.1 Xác định tỉ lệ lưu hành Salmonella thịt gà tươi bốn quận nội thành Hà Nội 44 4.2 Xác định khả kháng kháng sinh nhóm β-lactam vi khuẩn Salmonella 46 4.2.1 Kháng kháng sinh cephalosporin hệ Cefazoline (CZ): 47 4.2.2 Kháng kháng sinh cephalosporin hệ CXM, FOX: 47 4.3 Xác định chủng Salmonella sinh enzyme β-lactamase phổ rộng 50 4.4 Xác định gen mã hóa enzyme βeta-lactamese 52 4.4.1 Xác định gen mã hóa enzyme bla TEM 52 4.4.2 Xác định gen mã hóa enzyme bla PSE 53 4.4.3 Xác định gen mã hóa enzyme bla CMY-2 .54 4.4.4 Xác định gen mã hóa enzyme bla OXA 55 Phần Kết luận đề nghị 57 5.1 Kết luận 57 5.2 Đề nghị .57 Tài liệu tham khảo 58 iv download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt AOAC BHI BOA CAL CAZ CLSI CRO CTL CTX CXM CZ ESBL FDA FOX FSIS IEC ISO LCR LDC MIC MKTTn NCCLS NTS OMP PBP PCR RFLP RV S TAE TCVN TSA TSI USDA WHO XLD Nghĩa tiếng Việt Hiệp hội thức nhà phân tích hóa học Brain heart Infusion Văn phịng cơng nhận chất lượng Ceftazidime + clavulanic axit Ceftazidime Viện Tiêu chuẩn Lâm sàng Thí nghiệm Ceftriaxone Cefotaxim + clavulanic axit Cefotaxime Cefuroxime Cefazolin Enzyme β-lactamase phổ rộng Cục Quản lý Dược phẩm Thực phẩm Hoa Kỳ Cefoxitin Tổ chức Kiểm tra An toàn thực phẩm Ban điện Tổ chức Tiêu chuẩn giới Phản ứng chuỗi Ligase Mơi trường L-Lyzin đâ khử nhóm cacboxyl Nồng độ ức chế tối thiểu Tetrathionat/novobioxin muller-kauffmann Ủy ban Quốc gia Tiêu chuẩn Lâm sàng Phịng thí nghiệm Salmonella khơng thương hàn Porin màng ngồi Protein liên kết penicillin Phản ứng chuỗi polymerase Kỹ thuật đa hình độ dài đoạn cắt hạn chế Rappaport-Vassiliadis Salmonella Tris-acetate-EDTA (EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid) Tiêu chuẩn Việt Nam Trypton casein soy agar Triple sugar iron Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ Tổ chức Y tế Thế giới deoxycholat lyzin xyloza v download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Tên kháng sinh điểm đọc kháng sinh đồ 39 Bảng 3.2 Trình tự cặp mồi 42 Bảng 3.3 Chu trình nhiệt 43 Bảng 4.1 Số lượng mẫu thu thập chợ 44 Bảng 4.2 Tỉ lệ ô nhiễm Salmonella thịt gia cầm theo khu vực 45 Bảng 4.3 Kết kháng cephalosporin hệ CZ 47 Bảng 4.4 Kết kháng cephalosporin hệ CXM 48 Bảng 4.5 Kết kháng cephalosporin hệ 48 Bảng 4.6 Tỉ lệ kháng kháng sinh β-lactam cephalosporin 49 Bảng 4.7 Các chủng Salmonella kháng kháng sinh cephalosporin 50 Bảng 4.8 Các chủng Salmonella mang gen mã hóa enzyme β-lactamase 56 vi download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Vi khuẩn Salmonella Hình 2.2 Khay kháng sinh 23 Hình 2.3 Phương pháp cột khuếch tán kháng sinh – Etest 23 Hình 2.4 Phương pháp sử dụng khoanh giấy kháng sinh 24 Hình 2.5 Xác định vi khuẩn sinh ESBL 26 Hình 3.1 Địa điểm lấy mẫu số Quận nội thành Hà Nội 29 Hình 3.2 Thịt gà bày bán chợ sau giết mổ 29 Hình 3.3 Khuẩn lạc ria lên thạch XLD 33 Hình 3.4 Kết phản ứng thạch TSI 33 Hình 3.5 Phản ứng Urea broth 34 Hình 3.6 Phản ứng LDC broth 34 Hình 3.7 Kháng sinh đồ chủng dương đối chiếu Salmonella 572 40 Hình 3.8 Kháng sinh đồ chủng đối chiếu E.coli ATCC 52922 40 Hình 4.1 Tỉ lệ nhiễm Salmonella gia cầm Quận nội thành 46 Hình 4.2 Chủng Salmonella kháng với cephalosporin hệ CZ 47 Hình 4.3 Chủng Salmonella kháng với cephalosporin hệ 1, (CZ, CXM) 48 Hình 4.4 Chủng Salmonella đối chứng kháng kháng sinh β-lactam phổ rộng 51 Hình 4.5 Chủng Salmonella sinh enzyme B-lactamse phổ rộng 51 Hình 4.6 Đoạn khuếch đại gen mã hóa enzyme bla 53 Hình 4.7 Đoạn khuếch đại gen mã hóa enzyme bla PSE 54 Hình 4.8 Đoạn khuếch đại gen mã hóa enzyme bla CMY-2 55 Hình 4.9 Đoạn khuếch đại gen mã hóa enzyme bla OXA 55 vii download by : skknchat@gmail.com TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Đỗ Thùy Linh Tên Luận văn: Nghiên cứu khả kháng β-lactam chủng Salmonella phân lập từ thịt gà chợ địa bàn thành phố Hà Nội Ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Tên sở đào tạo: Học Viện Nơng Nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Đánh giá khả kháng β-lactam chủng Salmonella phân lập mẫu thịt gà thu thập số chợ Hà Nội Xác định gen mã hóa enzyme β-lactamase chủng Salmonella kháng thuốc Phương pháp nghiên cứu Dựa mục đích nghiên cứu, lựa chọn phương pháp nuôi cấy truyền thống để phân lập Salmonella thịt gia cầm, phương pháp dùng khoanh giấy kháng sinh để phát nhanh tính kháng kháng sinh vi sinh vật kiểm chứng khả sinh enzyme β-lactamase chủng Salmonella thu thập, Các gen kháng kháng sinh chủng vi khuẩn bước đầu phát kỹ thuật khuếch đại gen Polymerase chain Reaction (PCR) Các mẫu dương tính lưu lại để thực tiếp nghiên cứu sâu phát đột biến điểm, gen kháng kháng sinh khác Kết kết luận Tỉ lệ Salmonella lưu hành thịt gia cầm chợ số quận nội thành Hà Nội 32.0% Các chủng Salmonella phân lập kháng lại kháng sinh cephalosporin hệ 1, 2, với tỉ lệ lần lượt: Cefazolin (CZ) 15.63%, Cefuroxime (CXM) 6.25%, Cefoxitin (FOX) với 0%, Ceftriaxone (CRO) với 3.13%, Cefotaxime (CTX) 3.13% Ceftazidime (CAZ) với 9.38% Có chủng sinh eznyme Blactamase phổ rộng số 32 chủng Salmonella thu thập, chủng kháng loại kháng sinh cephalosporin hệ 1, 2, Có 10 chủng Salmonella sinh enzyme Bla TEM, chủng sinh enzyme CMY-2, chủng sinh enzyme bla PSE, chủng sinh enzyme bla OXA Khơng có chủng Salmonella sinh enzyme bla SHV enzyme bla DHA số 32 chủng thu thập viii download by : skknchat@gmail.com THESIS ABSTRACT Master candidate: Do Thuy Linh Thesis title: A study on the β-lactam antibiotic resistance of Salmonella spp isolated from chicken in markets of Hanoi Major: Veterinary Medicine Code: 60 64 01 01 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives Evaluate of β-lactam resistance of Salmonella spp isolated from chicken collected in markets of Hanoi Identify of the gene encoding the β-lactamase enzyme of antibiotic resistant Salmonella spp Materials and Methods Based on our research objectives, we chose the traditional method for the isolation of Salmonella in poultry, the method of using disk diffusion antibiotic sensitivity testing to detect quickly antibiotic resistance of bacteria, and test the ability of the β-lactamase gene exits in isolated Salmonella Antibiotic resistance genes were initially detected by PCR technique Positive samples will be retained for other followup studies such as point mutations detect, other antibiotic resistance genes Main findings and conclusions The prevalence of Salmonella isolated from poultry in Hanoi is 32.0% The resistance ratios of isolated Salmonella on the first, second and third generation cephalosporin are: Cefazolin (CZ) 15.63%, Cefuroxime (CXM) 6.25%, Cefoxitin (FOX) 0%, Ceftriaxone (CRO) 3.13%, Cefotaxime (CTX) 3.13% and Ceftazidime (CAZ) 9.38% There is one Salmonella strain that produced the extended spectrum Blactamase enzyme in 32 strains of isolated Salmonella, which resist the first, second and third generation cephalosporin There are 10 isolated strains contain CMY-2 enzyme, strains contain bla PSE enzyme and strains contain bla OXA enzyme There is no Salmonella strains produced bla SHV enzyme and bla DHA enzyme from 32 isolated strains ix download by : skknchat@gmail.com Đông Nam Á Thái Lan (57%, n=754), Campuchia (88.2%, n=152) (Sun et al., 2010), Trung Quốc (52.2%, n =1.152) (WHO, 2005) Tại nơng trang gia cầm nhiễm Salmonella qua đường ăn uống, qua tiếp xúc với chất thải gia cầm mang mầm bệnh Tỉ lệ dương tính Salmonella thịt gia cầm lị mổ chợ bán lẻ cao khả lây nhiễm trình vận chuyển, nguồn ngước sử dụng lò mổ Tuy nhiên năm gần đây, quan quản lý yêu cầu phải thực giết mổ gia cầm gia súc lò mổ lớn, đảm bảo yêu cầu vệ sinh trình giết mổ giám sát cán thú y vùng góp phần làm giảm tỉ lệ nhiễm mầm bệnh Salmonella thịt gia cầm chợ bán lẻ so với số năm trước Như vậy, kết nhiễm Salmonella có tỉ lệ thấp dần theo thời gian thấp số nước phát triển khu vực Đông Nam Á phù hợp với tình hình phát triển Việt Nam nay, phản ánh thực trạng điều kiện đời sống kinh tế ngày cải thiện, người ý thức an toàn thực phẩm suốt q trình sản xuất ni trồng Hệ thống trang trại chăn ni, lị mổ nâng cấp, nguồn nước q trình chăn ni, sản xuất đảm bảo vệ sinh làm giảm nguy phát rộng rãi mầm bệnh môi trường lây nhiễm cho người Tỉ lệ ô nhiễm Salmonella theo khu vực Kết phân tích phát Salmonella phịng thí nghiệm phân lập từ 100 mẫu thịt gà tươi thu thập quận Hà Nội trình bày Bảng 4.2 Bảng 4.2 Tỉ lệ ô nhiễm Salmonella thịt gia cầm theo khu vực Số mẫu Phân tích Số mẫu dương tính Tỉ lệ nhiễm (%) Chợ Đồng Xa 25 36% Quận Thanh Xuân Chợ Phùng Khoang 25 10 40% Quận Hoàng Mai Chợ Đại Từ 25 32% Chợ Hôm 25 20% 100 32 32% Địa điểm lấy mẫu Quận Cầu Giấy Quận Hai Bà Trưng Tổng số 45 download by : skknchat@gmail.com Kết nghiên cứu dao động tỉ lệ nhiễm Salmonella mẫu thịt gà thu thập chợ thuộc quận nội thành khác cho thấy mẫu thịt già thu thập chợ Phùng Khoang (Quận Thanh Xuân) cho tỉ lệ nhiễm Salmonella cao lên tới 40% (10 mẫu nhiễm số 25 mẫu kiểm tra) Quận Hai Bà Trưng với tỉ lệ nhiễm Salmonella thịt gà thấp với 20% (5 mẫu nhiễm /25 mẫu phân tích) (Hình 4.2) Sự giao động tỷ lệ nhiễm Salmonella quận khác phạm vi nghiên cứu đề tài khơng thực có ý nghĩa mặt thống kê (P > 0,05), chưa thể đưa nhận định việc quận nhiễm nhiều hay quận khác Cần có nghiên cứu mở rộng với nhiều địa điểm lấy mẫu địa bàn, số lượng mẫu lớn đưa kết luận khuyến cáo phù hợp 40% 36% 32% 20% quận Hình 4.1 Tỉ lệ nhiễm Salmonella gia cầm Quận nội thành 4.2 XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG KHÁNG KHÁNG SINH NHÓM Β-LACTAM CỦA VI KHUẨN SALMONELLA Sau phân lập chủng Salmonella từ mẫu gà thu thập được, thực kháng sinh đồ phương pháp đặt khoanh giấy kháng sinh 32 khuẩn lạc từ 32 mẫu dương tính Tiến hành đánh giá tính kháng kháng sinh β-lactam kháng sinh thuộc dòng cephalosporin hệ cefazoline (CZ); hệ cefuroxime (CXM) cefoxitin (FOX), hệ ceftriaxone (CRO), cefotaxime (CTX) ceftazidime (CAZ) 46 download by : skknchat@gmail.com 4.2.1 Kháng kháng sinh cephalosporin hệ Cefazoline (CZ) Trong tổng số 32 chủng Salmonella phân lập được, có chủng cho kết kháng cephalosporin hệ CZ với kích thước vịng vô khuẩn cụ thể Bảng 4.3 Trong chủng kháng cephalosporin hệ CZ có chủng Salmonella thu thập từ quận Thanh Xuân, chủng Salmonella thu thập từ quận Cầu Giấy có khả kháng kháng sinh cephalosporin hệ CZ Bảng 4.3 Kết kháng cephalosporin hệ CZ Quận STT CEFFAZOLIN (CZ) S Ký hiệu mẫu ≥15 I - R ≤14 Kích thước vịng vơ khuẩn (mm) M85 Cầu Giấy R 10 M88 Thanh Xuân R M154 Cầu Giấy R M108 Thanh Xuân R M111 Thanh Xuân R CZ CXM CRO FOX Hình 4.2 Chủng Salmonella kháng với cephalosporin hệ CZ 4.2.2 Kháng kháng sinh cephalosporin hệ CXM, FOX Trong tổng số 32 chủng Salmonella phân lập được, có chủng cho kết kháng cephalosporin hệ CXM khơng có chủng kháng FOX với kích thước vịng vơ khuẩn bảng 4.4 47 download by : skknchat@gmail.com Bảng 4.4 Kết kháng cephalosporin hệ CXM Quận STT Ký hiệu mẫu M85 M154 CEFUROXIME (CXM) Kích thước vịng kháng I R khuẩn (mm) 15-17 ≤14 S ≥18 Cầu Giấy Cầu Giấy R R Cụ thể có chủng Salmonella phân lập từ mẫu thu quận Cầu Giấy cho kết kháng với CXM CZ CXM CRO FOX Hình 4.3 Chủng Salmonella kháng với cephalosporin hệ 1, (CZ, CXM) 4.2.3 Kháng kháng sinh cephalosporin hệ CRO, CTX, CAZ: Kiểm tra chủng Salmonella phân lập kháng kháng sinh cephalosporin hệ cho kích thước vịng vơ khuẩn cụ thể sau: Bảng 4.5 Kết kháng cephalosporin hệ Quận STT Ký hiệu mẫu S ≥23 M154 Cầu Giấy STT Ký hiệu mẫu Quận M154 CEFTRAEXONE (CRO) Kích thước vòng I R kháng khuẩn (mm) 20-22 ≤19 R CEFOTAXIME (CTX) S I R ≥23 20-22 ≤19 Cầu Giấy Kích thước vịng kháng khuẩn (mm) R 48 download by : skknchat@gmail.com STT Ký hiệu mẫu Quận CEFTAZIDIME (CAZ) S I R ≥23 20-22 ≤19 Kích thước vịng kháng khuẩn (mm) M59 Cầu Giấy R M151 Cầu Giấy R M154 Cầu Giấy R 11 Trong đó, có chủng số 32 chủng Salmonella phân lập cho kết kháng kháng sinh CRO; có số 32 chủng cho kết kháng kháng sinh CTX; số 32 chủng cho kết kháng kháng sinh CAZ Tất chủng phân lập từ mẫu thịt gà thu thập từ quận Cầu Giấy Tỉ lệ kháng kháng sinh β-lactam cephalosporin Sau tiến hành kháng sinh đồ phương pháp khoanh giấy kháng sinh, thu thập tổng hợp kết tỉ lệ kháng kháng sinh β-lactam cephalosporin trình bày Bảng 4.6 Bảng 4.6 Tỉ lệ kháng kháng sinh β-lactam cephalosporin Kháng sinh Cephalosporin hệ Cefazoline Cephalosporin hệ Cefuroxime Cefoxitin Cephalosporin hệ Ceftriaxone Cefotaxime Ceftazidime Số chủng kháng Tỉ lệ kháng (%) 15.63% 6.25% 0% 1 3.13% 3.13% 9.38% Các chủng Salmonella phát kháng nhiều với cefazoline với 15.63%, tiếp đến ceftazidime với 9.38% ceftriaxone với 6.25%, cuối cefoxitin ceftazidime với 3.31% Trong số 32 chủng Salmonella phân lập được, khơng có chủng kháng kháng sinh cefoxitin Trong số chủng Salmonella kháng kháng sinh β-lactam cephalosporin xác định trên, có chủng M88, M108, M111 kháng loại kháng sinh cephalosporin hệ (CZ); có chủng mã số M85 cho kết kháng cephalosporin hệ (CZ) (CXM); chủng M151, M59 lại không kháng 49 download by : skknchat@gmail.com kháng sinh hệ 2, mà kháng kháng sinh CAZ (thế hệ 3) Riêng có chủng mã số M154 kháng với hệ kháng sinh cephalosporin (CZ, CXM, CRO, CTX, CAZ) trừ FOX (Bảng 4.7) Có thể thấy, chủng Salmonella kháng kháng sinh không theo quy luật từ hệ đến hệ hệ 3, mà kháng loại kháng sinh hệ cao hay thấp độc lập Lý do có chủng Salmonella chưa tiếp xúc với kháng sinh hệ thấp (1, 2) tiếp xúc chưa có khả kháng kháng sinh đó, lại tiếp xúc có khả kháng với kháng sinh cephalosporin hệ Điều cho thấy, lúc kháng sinh hệ điều trị bệnh, mà cần đến kháng sinh hệ 1, Khuyến cáo cần làm kháng sinh đồ điều trị bệnh để đưa phác đồ điều trị phù hợp Bảng 4.7 Các chủng Salmonella kháng kháng sinh cephalosporin Quận STT Ký hiệu mẫu Cephalosporin Thế hệ CZ Thế hệ Thế hệ CXM FOX CRO CTX CAZ M85 Cầu Giấy R R - - - - M88 Thanh Xuân R - - - - - M154 Cầu Giấy R R - R R R M108 Thanh Xuân R - - - - - M111 Thanh Xuân R - - - - - M151 Cầu Giấy - - - - - R M59 Cầu Giấy - - - - - R 4.3 XÁC ĐỊNH CHỦNG SALMONELLA SINH ENZYME Β-LACTAMASE PHỔ RỘNG Ba chủng Salmonella M154, M151 M59 kháng cephalosporin hệ tiến hành khẳng định có mặt enzyme β-lactamase phổ rộng thử nghiệm kháng sinh đồ khoanh giấy kháng sinh cefotaxime (CTX), cefotaxime kết hợp clavulanic axit (CTL), ceftazidime (CAZ) ceftazidime kết hợp clavulanic axit (CAL) 50 download by : skknchat@gmail.com Quá trình thử nghiệm tiến hành song song với chủng dương Salmonella 572 (Hình 4.4) Kháng sinh CAZ Kháng sinh CAZ + acid clavulanic Hình 4.4 Chủng Salmonella đối chứng kháng kháng sinh β-lactam phổ rộng (A), chủng đối chứng 572; (B) chủng thu thập năm 2016 Kết cho thấy chủng Salmonella mã M154 cho kết kháng kháng sinh β-lactam phổ rộng với kích thước vịng kháng CTL CAL lớn 5mm so với vòng kháng CTX CAZ Chủng M154 chủng kháng với cephalosporin hệ 1, 3; kháng kháng với kháng sinh cephalosporin hệ ceftriaxone, cefotaxime, ceftazidime (Hình 4.5) Kháng sinh CAZ Kháng sinh CTX Kháng sinh CTX + acid clavulanic Kháng sinh CAZ + acid clavulanic Hình 4.5 Chủng Salmonella sinh enzyme B-lactamse phổ rộng 51 download by : skknchat@gmail.com Kết cho thấy, chủng M154 sinh enzyme β-lactamase phổ rộng nên bị clavulanic axit ức chế Cịn M151 M59 khơng sinh enzyme β-lactamase phổ rộng nên không bị clavulanic axit ức chế nên bổ sung thêm clavulanic axit, hai chủng M151 M59 biểu kháng kháng sinh với vịng vơ khuẩn có đường kính < 5mm so với khoanh giấy không bổ sung clavulanic axit thử kháng sinh đồ 4.4 XÁC ĐỊNH GEN MÃ HÓA ENZYME ΒETA-LACTAMESE 32 chủng Salmonella phân lập tiến hành chạy phản ứng PCR, khuếch đại đoạn gen đích cặp mồi sử dụng để phát gen mã hóa enzyme B-lactamse: bla TEM, bla PSE, bla DHA, bla OXA, bla CMY, bla SHV 4.4.1 Xác định gen mã hóa enzyme bla TEM Đoạn gen đích khuếch đại trình tự mồi mã hóa enzyme bla TEM cho kích thước 661bp (Hình 4.6) Trong số chủng Salmonella phân lập được, sau chạy phản ứng PCR, cho kết có 10 chủng mang gen mã hóa enzyme bla-TEM Các chủng mang gen mã hóa enzyme bla-TEM có chủng có mã số: M9, M85, M67, M88, M154, M77, M71, M15, M108, M111 Trong có chủng mang mã số M85, M88, M108, M111 kháng kháng sinh hệ (CZ); M85 M154 kháng kháng sinh hệ (CXM); M154 kháng kháng sinh hệ 1, (trừ FOX) M10 M11 M40 M48 M59 M61 M96 M99 M15 MA M77 M85 M108 M111 M154 M160 661 bp 600 bp Hình 4.6 Đoạn khuếch đại gen mã hóa enzyme bla TEM (661 bp, Ladder: 50 bp) 52 download by : skknchat@gmail.com 4.4.2 Xác định gen mã hóa enzyme bla PSE Đoạn gen đích khuếch đại trình tự mồi mã hóa enzyme bla PSE cho kích thước 575 bp (Hình 4.7) Kết cho thấy có chủng mang gen mã hóa enzyme bla PSE số 32 chủng Salmonella phân lập Các chủng mang gen PSE có mã số M48, MM59, M151, M61, M160; đó, chủng mang mã số M151 M59 có biểu kháng kháng sinh hệ CAZ, khơng kháng kháng sinh cịn lại Các chủng M48, M61, M160 mang gen mã hóa enzyme bla PSE không biểu kháng kháng sinh cephalosporin Hình 4.7 Đoạn khuếch đại gen mã hóa enzyme bla PSE (575 bp, Ladder: 50 bp) 4.4.3 Xác định gen mã hóa enzyme bla CMY-2 Đoạn gen đích khuếch đại trình tự mồi mã hóa enzyme bla CMY-2 cho kích thước 856 bp (Hình 4.8) Phát có chủng Salmonella cho kết mang gen mã hóa enzyme bla CMY-2, chủng mang mã số M85, M40, M99, M108; đó, có chủng số M108 kháng với kháng sinh hệ CZ, M85 kháng với kháng sinh hệ CZ hệ CXM Các chủng lại M99 M40 mang gen mã hóa enzyme β-lactamase khơng biểu kháng cephalosporin 53 download by : skknchat@gmail.com M15 M10 M40 M48 M61 M14 M151 M88 M108 MA M85 M69 M67 M77 M154 M160 856 bp 800 bp Hình 4.8 Đoạn khuếch đại gen mã hóa enzyme bla CMY-2 (856 bp, Ladder: 50 bp) 4.4.4 Xác định gen mã hóa enzyme bla OXA Đoạn gen đích khuếch đại trình tự mồi mã hóa enzyme bla CMY-2 cho kích thước 590 bp (Hình 4.9) Phát chủng số 32 chủng Samonella phân lập mang gen mã hóa enzyme bla OXA Các chủng mang mã số M85, M108, M111; chủng kháng kháng sinh hệ (CZ), M85 kháng kháng sinh hệ (CXM) M15 M14 M40 M48 M11 M108 M9 M88 M59 MA M67 M85 M69 M77 M154 M160 600 bp 590 bp Hình 4.9 Đoạn khuếch đại gen mã hóa enzyme bla OXA (590 bp, Ladder: 50 bp) 54 download by : skknchat@gmail.com Các chủng Salmonella mang gen mã hóa enzym β-lactamase Kết cho thấy có 10 chủng sinh enzyme Bla TEM, chủng sinh enzyme CMY-2, chủng sinh enzyme bla PSE, chủng sinh enzyme bla OXA, khơng có chủng sinh enzyme bla SHV enzyme bla DHA (Bảng 4.8.) Bảng 4.8 Các chủng Salmonella mang gen mã hóa enzyme β-lactamase Ký hiệu STT Mang gen mã hóa mẫu Bla TEM Bla Bla Bla Bla Bla CMY-2 PSE OXA SHV DHA M9 X O O O O O M15 X O X O O O M40 O X O O O O M48 O O X O O O M59 O O X O O O M61 O O X O O O M67 X O O O O O M71 X O O O O O M77 X O O O O O 10 M85 X X O X O O 11 M88 X O O O O O 12 M99 O X O O O O 13 M108 X X O X O O 14 M111 X O O X O O 15 M151 O O X O O O 16 M154 X O O O O O 17 M160 O O X O O O Ghi chú: X: dương tính O: âm tính 55 download by : skknchat@gmail.com PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN ● Tỉ lệ Salmonella lưu hành thịt gia cầm chợ số quận nội thành Hà Nội 32.0% ● Các chủng Salmonella phân lập kháng lại kháng sinh cephalosporin hệ 1, 2, với tỉ lệ lần lượt: Cefazolin 15.63%, Cefuroxime 6.25%, Cefoxitin với 0%, Ceftriaxone 3.13%, Cefotaxime 3.13% Ceftazidime với 9.38% ● Có chủng sinh eznyme B-lactamase phổ rộng số 32 chủng Salmonella thu thập, chủng kháng loại kháng sinh cephalosporin hệ 1, 2, ● Phát có 10 chủng Salmonella sinh enzyme Bla TEM, có chủng sinh enzyme CMY-2, có chủng sinh enzyme bla PSE, có chủng sinh enzyme bla OXA, khơng có chủng Salmonella sinh enzyme bla SHV enzyme bla DHA số 32 chủng thu thập 5.2 ĐỀ NGHỊ Khuyến cáo người dân hiểu rõ tình hình nhiễm Salmonella địa bàn Hà Nội cịn cao Ngồi ra, tồn chủng vi khuẩn kháng thuốc hệ khác kháng phổ rộng Khuyến cáo làm kháng sinh đồ mắc bệnh để có phác đồ điều trị phù hợp Đưa vào chương trình hành động vấn đề vi khuẩn kháng thuốc: kiến thức tình hình vi khuẩn kháng thuốc kiến thức sử dụng kháng sinh cộng đồng Tiến hành nghiên cứu sâu sinh học phân tử chủng kháng kháng sinh để xem xét khả kháng kháng sinh khác gen kháng kháng sinh khác tiềm ẩn chủng thu thập Xác định biến thể gen mã hóa enzyme β-lactamase phổ rộng chủng Salmonella thu thập 56 download by : skknchat@gmail.com TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Anh: Calo S., C Ricke and J Rivera (2015) Antibiotic Resistance in Pathogenic Salmonella, Antimicrobial Resistance and Food Safety Elsevier Inc pp 37-53 Centres for Disease Control and Prevention (US) (2013) Antibiotic resistance threats in the United States, 2013 Centres for Disease Control and Prevention, US Department of Health and Human Services Chen H M., W Yue, H S Lin and H C Cheng (2013) Nontyphoid Salmonella Infection: Microbiology, Clinical Features, and Antimicrobial Therapy Pediatrics and Neonatology 54 pp 147-152 Chroma M and M Kolar (2015) Genetic methods for detection of antibiotic resistance: focus on extended-spectrum β-lactamases Food Control 47 pp 264-276 European Food Safety Authority (2010) Scientific report of EFSA: analysis of the baseline survey on the prevalence of Campylobacter in broiler batches and of Campylobacter and Salmonella on broiler carcasses in the EU, Part A: Campylobacter and Salmonella prevalence estimates EFSA J pp.1-100 Hald T (2013 Pathogen Updates: Salmonella [ed.] Jr and Morris E Potter J Glenn Morris Foodborne Infections and Intoxications Fourth edition s.l Elsevier Inc pp 67-97 Hannah G., A L Nisler, M P H Karen, M Herman, M Dana, J Cole, I T Williams and M Griffin (Div of Foodborne, Waterborne, and Environmental Diseases, National Center for Emerging and Zoonotic (2008) Infectious Diseases Div of Viral Diseases National Center for Immunization and Respiratory Diseases Retrieved on 18 Sep 2017 at https://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/mm6035a3.htm Holmes A H., L S P Moore, A Sundsfjord, M Steinbakk, S Regmi, A Karkey, P J Guerin and L J V Piddock (2015) Understanding the mechanisms and drivers of antimicrobial resistance The Lancet http://dx.doi.org/10.1016/ S01406736(15)00473-0 Jorgensen F., H James and M Jane (2009) Antimicrobial Susceptibility Testing: A Review of General Principles and Contemporary Practices Clinical Infectious Diseases 49 pp 1749–1755 57 download by : skknchat@gmail.com 10 Lee K M., M Runyon, T J Herrman, R Phillips and J Hsieh (2015) Review of Salmonella detection and identification methods: Aspects of rapid emergency response and food safety Food Control 47 pp 264-276 11 Manning J., V Gole and K Chousalkar (2015) Screening for Salmonella in backyard chickens Preventive Veterinary Medicine 120 pp 241–245 12 Meldrum R J and I G Wilson (2007) Salmonella and Campylobacter in United Kingdong retail raw chicken in 2005 J Food Prot 70 pp 1937-1939 13 Neto D F., O C Penha, P Barrow and B Junior (2010) Sources of Human NonTyphoid Salmonellosis: A Review Brazilian Journal of Poultry Science 12 pp 1-11 14 Nguyen D T A., M Kanki, P D Nguyen, H T Le, P T Ngo, D N Tran, N H Le, C V Dang, T Kawai, R Kawahara, S Yonogi, Y Hirai, M Jinnai, S Yamasaki, Y Kumeda and Y Yamamoto (2016) Prevalence, Antibiotic Resistance, and Extended-Sectrum and AmpCβ-Lactamase Productivity of Salmonella Isolates from Raw Meat and Seafood Samples in Ho Chi Minh City, Vietnam International Journal of Food Microbiology 10 15 Oliveira K S., L A Lima, N B Cobacho, S C Dias and O L Franco (2016) Mechanism of Antibacterial Resistance: Shedding Some Light on These obscure Elsevier Inc pp 19-35 16 Philip W (2014) Mumy KL Salmonella Encyclopedia of Toxicology Elsevier Inc pp 211-212 17 Sanche V., M Flor, A Maisam, A E Haija and G Oscar (2011) Salmonella infections: An update on epidemiology, management, and prevention Travel Medicine and Infectious Disease pp 263-277 18 Seiffert S N., M Hilty, V Perreten and A Endimiani (2013) Extended-spectrum cephalosporin-resistant gram-negative organisms in livestock: An emerging problem for human health Drug Resist 13 pp 1-24 19 Shaikh S., J Fatima, S Shakil, S Mohd, D Rizvi and M A Kamal (2014) Antibiotic resistance and extended spectrum beta-lactamases: Types, epidemiology and treatment Saudi Journal of Biological Sciences, p doi: http://dx.doi.org/10.1016/j.sjbs.2014.08.002 20 Sun L K., Y Vuthy, P Song, K Phol and J L Sarthou (2010) Prevalence, numbers and antimicrobial susceptibilities of Salmonella serovars and Campylobacter spp in retail poultry in Phnom Penh Cambodia J Vet Med Sci 73 pp 325-329 58 download by : skknchat@gmail.com 21 Ta Y T., T T Nguyen, P B To, D X Pham, H T H Le, W Q Alali, I Walls, D M Wong and M P Doyle (2012) Prevalence of Salmonella on chicken carcasses from retail markets in Vietnam J Food Prot 75 pp 1851–1854 22 Ta Y T., T T Nguyen, P B To, D X Pham, H T H Le, G N Thi, W Q Alali, I Wall and M P Doyle (2014) Quantification, Serovars, and Antibiotic Resistance of Salmonella Isolated from Retail Raw Chicken Meat in Vietnam Journal of Food Protection 77 pp 57–66 23 Thai T H., T Hirai, N T Lan and R Yamaguchi (2012) Antibiotic resistance profiles of Salmonella serovars isolated from retail pork and chicken meat in North Vietnam International Journal of Food Microbiology 156 pp 147-151 24 Threlfall E J (2002) Antimicrobial drug resistance in Salmonella: problems and perspectives in food- and water-borne infections FEMS Microbiology Reviews 26 pp 141-148 25 Turki M D., Z Shi, Y M Kwon and S C Ricke (2017) Overview of Salmonellosis and Food-borne Salmonella: Historical and Current Perspectives Elsevier Inc pp 113-127 26 USDA (2016) Serotypes Profile of Salmonella Isolates from Meat and Poultry Products, January 1998 through December 2014 Retrieved on 10 sep 2017 at https://www fsis usda.gov /wps/portal/fsis/topics/data-collection-and-reports/ microbiology /annual- serotyping-reports 27 Urumova V (2015) Extended spectrum beta lactamase producing animal enterobacteriaceae isolates as potential risk to public health – review Revue Méd Vét l (166) pp 192-207 28 World Health Organization (2005) Global Salm-Surv: A global Salmonella surveillance and laboratory support project - Protocols for Isolation, Identification & Serotyping of Salmonella, Shigella & Vibrio cholera WHO, Newyork 29 Zhua J., Y Wanga, X Songa, S Cuib, H Xua, B Yangc, J Huang, G Liue, Q Chenf, G Zhoug, Q Chenh and F Li (2014) Prevalence and quantification of Salmonella contamination in raw chicken carcasses at the retail in China Food Control 44 pp 198–202 30 Zhao C., B Ge, J D Villena, R Sudler, E Yeh, S Zhao, D G White, D Wagner and J Meng (2001) Prevalence of Campylobacter spp., Escherichia coli, and Salmonella serrovars in retail chicken, turkey, pork, and beef from the Greater Washington, D.C., area Appl.Environ Microbiol 67 pp.5431-5436 59 download by : skknchat@gmail.com ... kháng β -lactam chủng Salmonella phân lập từ thịt gà chợ địa bàn thành phố Hà Nội? ?? 1.2 MỤC ĐÍCH Đánh giá khả kháng β -lactam chủng Salmonella phân lập mẫu thịt gà thu thập số chợ Hà Nội Xác định... skknchat@gmail.com TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Đỗ Thùy Linh Tên Luận văn: Nghiên cứu khả kháng β -lactam chủng Salmonella phân lập từ thịt gà chợ địa bàn thành phố Hà Nội Ngành: Thú y Mã số: 60 64... từ tháng đến tháng năm 2016 3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Phát hiện, phân lập chủng Salmonella có mẫu thịt gà thu thập được, từ xác định tỉ lệ lưu hành Salmonella thịt gà số chợ địa bàn Thành phố Hà