Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu
Đối tượng, địa điểm, thời gian nghiên cứu
Thịt gà tươi sống được thu thập ngẫu nhiên từ các chợ Đồng Xa (quận Cầu Giấy), chợ Phùng Khoang (quận Thanh Xuân), chợ Đại Từ (quận Hoàng Mai) và chợ Hôm (quận Hai Bà Trưng) của Thành phố sau khi giết mổ.
Hà Nội là nơi mà người dân thường ưa chuộng thực phẩm tươi sống, đặc biệt là tại các chợ truyền thống hơn là siêu thị Do đó, mẫu nghiên cứu được thu thập từ các chợ ở những khu vực đông dân cư tại các quận lớn.
Hình 3.1 Địa điểm lấy mẫu tại một số Quận nội thành Hà Nội
Hình 3.2 Thịt gà bày bán tại chợ sau khi giết mổ
Trong đó số lượng mẫu thu thập tại mỗi chợ là 25 mẫu Tổng số mẫu phân tích là 100 mẫu
Các mẫu sau khi thu thập sẽ được phân tích tại phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn ISO/IEC 17025:2005 của Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia.
Khoảng thời gian thu thập mẫu từ tháng 7 đến tháng 9 năm 2016 3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu này tập trung vào việc phát hiện và phân lập các chủng Salmonella có trong mẫu thịt gà được thu thập từ một số chợ ở Thành phố Hà Nội, nhằm xác định tỉ lệ lưu hành của vi khuẩn Salmonella trên thịt gà trong khu vực này.
Thử khả năng kháng kháng sinh thuộc nhóm β-lactam (thế hệ 1, 2, 3 và β-lactam phổ rộng) của các chủng Salmonella đã phân lập được
Tìm gen mã hóa enzyme β-lactamase của các chủng Salmonella kháng thuốc.
Dựa trên mục đích nghiên cứu, chúng tôi đã chọn phương pháp nuôi cấy truyền thống để phân lập Salmonella từ thịt gia cầm, kết hợp với việc sử dụng khoanh giấy kháng sinh nhằm phát hiện nhanh tính kháng kháng sinh của vi sinh vật Chúng tôi cũng kiểm chứng khả năng sinh enzyme β-lactamase của chủng Salmonella đã thu thập Các gen kháng kháng sinh của vi khuẩn được phát hiện bước đầu thông qua kỹ thuật khuếch đại gen PCR, và các mẫu dương tính sẽ được lưu giữ để thực hiện các nghiên cứu sâu hơn, bao gồm phát hiện các đột biến điểm và các gen kháng kháng sinh khác.
- Túi ghép mí đựng mẫu vô trùng;
- Tủ mát (Aucma, Nhật Bản);
- Tủ lạnh đông -80 0 C (Daire, Đan Mạch)
Số lượng 100 mẫu thịt gia cầm được thu thập tại 4 chợ, mỗi chợ
5 mẫu cho 1 lần thu thập, mỗi mẫu khoảng 1/4 con gà (hoặc 1 kg)
Mẫu thịt gà được đựng trong túi nilon ghép mí vô trùng, bảo quản trong thùng đựng mẫu có kèm đá khô đảm bảo nhiệt độ 4 0 C –
8 0 C Mẫu được vận chuyển ngay trong ngày về phòng thí nghiệm
Bảo quản mẫu riêng rẽ trong tủ mát ở nhiệt độ 4 0 C – 8 0 C tại phòng thí nghiệm nếu phân tích trong ngày, hoặc ở tủ đông sâu (-
20 o C) nếu phân tích vào ngày hôm sau Mẫu đã thu thập từ các chợ sẽ được phân tích trong vòng 24h sau khi thu thập
3.3.2 Phương pháp phân lập Salmonella
- Nồi hấp (Hyrayama, Nhật Bản)
- Cân kỹ thuật ML802 (Metler, Thụy Sĩ)
- Đồng hồ hẹn giờ (Extech 365535 Mỹ)
- Tủ ấm Sanyo (Nhật Bản)
- Tủ lạnh đông (Daire, Đan Mạch)
- Tủ an toàn sinh học cấp 2 (Telstar, Tây Ban Nha)
- Bể cách thủy (Memmert, Đức)
- pH Meter, có độ chính xác ± 0.1 0 C đơn vị pH ở 20 0 C hoặc 25 0 C (Thụy Sĩ)
- Micropipett có dung tích 10 ml và 1 ml (Eppendorf, Đức)
- Que cấy vũng vụ trựng, cú đường kớnh 3 mm hoặc 10àl
- Ống nghiệm, đĩa petri vô trùng
- Túi ghép mí đựng mẫu vô trùng (cỡ 3, cỡ 7, xuất xứ Việt Nam
- Buffer Peptone water (xuất xứ: Đức)
- XLD agar, HE agar (Merck, Đức)
- TSI, LDC, Ure broth, (Merck, Đức)
- Poly O antisera, Poly H antisera (BD, Pháp)
Chúng tôi sử dụng phương pháp TCVN 4829:2005 (ISO/IEC 6579:2005) để phát hiện Salmonella trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi Phương pháp này, được thực hiện tại phòng thử nghiệm Khoa Vi sinh vật, Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia, đã được Văn phòng công nhận chất lượng (BOA) đánh giá và công nhận.
Salmonella thường xuất hiện với số lượng nhỏ, thường đi kèm với nhiều vi sinh vật khác thuộc họ Enterobacteria hoặc các họ khác Để đảm bảo phát hiện được lượng nhỏ Salmonella hoặc Salmonella có hoạt tính yếu, cần thực hiện quy trình tăng sinh sơ bộ theo tiêu chuẩn TCVN 4829:2005.
Sau khi tăng sinh sơ bộ, số lượng và hoạt tính của vi khuẩn Salmonella gia tăng, tạo điều kiện cho sự tăng sinh chọn lọc và ức chế các vi khuẩn khác Các khuẩn lạc Salmonella điển hình được thử nghiệm thông qua các phản ứng sinh hóa và kháng huyết thanh, sử dụng phương pháp ngưng kết trên phiến kính Bên cạnh đó, việc sử dụng chủng chuẩn đối chứng là cần thiết trong quá trình phân tích để đảm bảo độ chính xác của kết quả.
− Đối chứng dương: Salmonella Enteritidis ATCC 13076
− Đối chứng âm: Escherichia coli ATCC 25922 c/ Các bước tiến hành
Bước 1: Tăng sinh không chọn lọc
- Cân 25 g thịt gà từ khối thịt gà đã đồng nhất trong túi ghép mí vô trùng
- Rót 225 ml đệm pepton (pH = 7) vào túi đựng mẫu gà đã cân, bóp đều trong 1 phút, để yên trong 30 phút, sau đó ủ ở nhiệt độ
37 0 C ± 1 0 C trong 18h ± 2h Bước 2: Tăng sinh chọn lọc
Sau khi ủ dịch tăng sinh ở nhiệt độ 37°C ± 1°C trong 18h ± 2h, chuyển 0.1 ml sang 10 ml RV broth (nuôi ở 41.5°C ± 1°C trong 24h ± 3h) và 1 ml sang 10 ml MKTTn broth (ủ ở 37°C ± 1°C trong 24h ± 3h) Tiếp theo, rải dịch đã tăng sinh lên môi trường thạch XLD agar, để yên trong 30 phút rồi ủ ở 37°C ± 1°C trong 24h ± 3h Thực hiện tương tự với môi trường thạch HE agar.
30 phút rồi ủ ở nhiệt độ 37 0 C ± 1 0 C trong 24h ± 3h
Bước 4: Nuôi khuẩn lạc điển hình trên môi trường thạch dinh dưỡng (TSA) ở nhiệt độ 37°C ± 1°C trong 24h ± 3h, bao gồm khuẩn lạc rìa hồng, tâm đen, nhẵn bóng, lồi, tròn trên XLD agar và khuẩn lạc rìa không màu, tâm đen, nhẵn bóng, lồi tròn trên HE agar.
Hình 3.3 Khuẩn lạc khi ria lên thạch XLD Bước 5: Thử các phản ứng sinh hóa để khẳng định
Để thực hiện thí nghiệm Thạch TSI, trước tiên cần sử dụng que cấy vô trùng để chấm khuẩn lạc đã được nuôi trên thạch dinh dưỡng Tiếp theo, cấy đường cấy trích sâu vào thạch TSI và tiến hành cấy ria trên bề mặt nghiêng của thạch Cuối cùng, nuôi mẫu ở nhiệt độ thích hợp để đảm bảo quá trình phát triển của vi khuẩn.
Nhiệt độ 37 ± 1 độ C qua đêm là điều kiện tối ưu để nuôi cấy Salmonella trên thạch TSI Các đặc điểm nhận diện bao gồm sự kiềm hóa thể hiện qua màu đỏ trên bề mặt nghiêng của thạch và sự chuyển màu vàng khi cấy đâm sâu, kèm theo sự sản sinh khí (bọt khí) và trong khoảng 90% trường hợp, tạo ra hydrosunfua khiến thạch bị đen.
Cấy đâm sâu giúp xác định sự hiện diện của glucoza qua màu sắc: màu vàng chỉ ra glucoza dương tính, màu đỏ hoặc không đổi màu cho thấy glucoza âm tính, trong khi màu đen biểu thị sinh khí hydro sunfua Ngoài ra, sự xuất hiện của bọt hoặc vết rạn có thể chỉ ra sự sinh khí từ glucoza.
+ Bề mặt thạch nghiêng: Màu vàng (lactoza và/hoặc sucroza dương tính), màu đỏ hoặc không đổi màu (lactoza và sucroza âm tính)
Hình 3.4 Kết quả phản ứng trên thạch TSI
Ure broth là một môi trường nuôi cấy được sử dụng để xác định khả năng phân giải urê của vi khuẩn Để thực hiện, dùng que cấy vô trùng chấm khuẩn lạc đã nuôi trên thạch dinh dưỡng, sau đó hòa vào dung dịch Ure broth trong ống nghiệm và ủ ở nhiệt độ 37 °C ± 1 °C qua đêm Nếu phản ứng dương tính xảy ra, urê sẽ được phân giải thành amoniac, dẫn đến sự thay đổi màu sắc của phenol từ màu đỏ sang hồng và cuối cùng là đỏ hồng, thường xuất hiện sau 2 đến 4 giờ.
Dương tính Salmonella Âm tính
Hình 3.5 Phản ứng trên Urea broth
- LDC: dùng que cấy vô trùng chấm khuẩn lạc đã nuôi trên thạch dinh dưỡng ở Bước 4, hòa vào dung dịch LDC trong ống nghiệm, nuôi ở nhiệt độ
37 0 C ± 1 0 C qua đêm Màu đục và đỏ tía sau khi ủ chứng tỏ phản ứng dương tính,
; màu vàng là phản ứng âm tính
Hình 3.6 Phản ứng trên LDC broth
Bước 6: Xác định các chủng Salmonella đã phân lập thông qua phương pháp huyết thanh học bằng phản ứng ngưng kết trên phiến kính theo sơ đồ Kauffmann White Để loại bỏ các chủng tự ngưng kết, cần thực hiện phản ứng ngưng kết với nước muối.
Sau đó kiểm tra kháng nguyên O, kháng nguyên H Để tiến hành phân typ các chủng thì cần ria các chủng phân lập được lên thạch dinh dưỡng, ủ 37 0 C trong 18 giờ
+ Nhỏ một giọt nước muối sinh lý 0.85% làm đối chứng lên phiến kính bằng cách sử dụng vòng que cấy
+ Lấy khuẩn lạc đã ria trên thạch dinh dưỡng lên phiến kính và trộn đều với giọt nước muối sinh lý
Phương pháp nghiên cứu
Dựa trên mục đích nghiên cứu, chúng tôi đã chọn phương pháp nuôi cấy truyền thống để phân lập Salmonella trên thịt gia cầm Phương pháp sử dụng khoanh giấy kháng sinh giúp phát hiện nhanh tính kháng kháng sinh của vi sinh vật và kiểm chứng khả năng sinh enzyme β-lactamase của chủng Salmonella đã thu thập Các gen kháng kháng sinh của vi khuẩn được phát hiện ban đầu bằng kỹ thuật khuếch đại gen PCR Những mẫu dương tính sẽ được lưu lại để thực hiện các nghiên cứu sâu hơn, bao gồm phát hiện các đột biến điểm và các gen kháng kháng sinh khác.
- Túi ghép mí đựng mẫu vô trùng;
- Tủ mát (Aucma, Nhật Bản);
- Tủ lạnh đông -80 0 C (Daire, Đan Mạch)
Số lượng 100 mẫu thịt gia cầm được thu thập tại 4 chợ, mỗi chợ
5 mẫu cho 1 lần thu thập, mỗi mẫu khoảng 1/4 con gà (hoặc 1 kg)
Mẫu thịt gà được đựng trong túi nilon ghép mí vô trùng, bảo quản trong thùng đựng mẫu có kèm đá khô đảm bảo nhiệt độ 4 0 C –
8 0 C Mẫu được vận chuyển ngay trong ngày về phòng thí nghiệm
Bảo quản mẫu riêng rẽ trong tủ mát ở nhiệt độ 4 0 C – 8 0 C tại phòng thí nghiệm nếu phân tích trong ngày, hoặc ở tủ đông sâu (-
20 o C) nếu phân tích vào ngày hôm sau Mẫu đã thu thập từ các chợ sẽ được phân tích trong vòng 24h sau khi thu thập
3.3.2 Phương pháp phân lập Salmonella
- Nồi hấp (Hyrayama, Nhật Bản)
- Cân kỹ thuật ML802 (Metler, Thụy Sĩ)
- Đồng hồ hẹn giờ (Extech 365535 Mỹ)
- Tủ ấm Sanyo (Nhật Bản)
- Tủ lạnh đông (Daire, Đan Mạch)
- Tủ an toàn sinh học cấp 2 (Telstar, Tây Ban Nha)
- Bể cách thủy (Memmert, Đức)
- pH Meter, có độ chính xác ± 0.1 0 C đơn vị pH ở 20 0 C hoặc 25 0 C (Thụy Sĩ)
- Micropipett có dung tích 10 ml và 1 ml (Eppendorf, Đức)
- Que cấy vũng vụ trựng, cú đường kớnh 3 mm hoặc 10àl
- Ống nghiệm, đĩa petri vô trùng
- Túi ghép mí đựng mẫu vô trùng (cỡ 3, cỡ 7, xuất xứ Việt Nam
- Buffer Peptone water (xuất xứ: Đức)
- XLD agar, HE agar (Merck, Đức)
- TSI, LDC, Ure broth, (Merck, Đức)
- Poly O antisera, Poly H antisera (BD, Pháp)
Chúng tôi áp dụng phương pháp TCVN 4829:2005 (ISO/IEC 6579:2005) để phát hiện Salmonella trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, sử dụng kỹ thuật nuôi cấy trên đĩa thạch Phương pháp này được thực hiện tại phòng thử nghiệm Khoa Vi sinh vật, Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia và đã được công nhận bởi Văn phòng công nhận chất lượng (BOA).
Salmonella có thể tồn tại với số lượng nhỏ, thường đi kèm với nhiều vi sinh vật khác thuộc họ Enterobacteria Để phát hiện Salmonella trong trường hợp này, cần thực hiện quá trình tăng sinh sơ bộ nhằm đảm bảo nhận diện được cả những vi khuẩn Salmonella có số lượng ít hoặc bị suy giảm hoạt tính, theo tiêu chuẩn TCVN 4829:2005.
Sau khi tăng sinh sơ bộ, số lượng và hoạt tính của vi khuẩn Salmonella sẽ tăng lên, đồng thời tạo điều kiện để ức chế sự phát triển của các vi khuẩn khác Các khuẩn lạc Salmonella điển hình được kiểm tra thông qua các phản ứng sinh hóa và thử kháng huyết thanh bằng phương pháp ngưng kết trên phiến kính Chủng chuẩn đối chứng cũng được sử dụng trong quá trình phân tích để đảm bảo tính chính xác.
− Đối chứng dương: Salmonella Enteritidis ATCC 13076
− Đối chứng âm: Escherichia coli ATCC 25922 c/ Các bước tiến hành
Bước 1: Tăng sinh không chọn lọc
- Cân 25 g thịt gà từ khối thịt gà đã đồng nhất trong túi ghép mí vô trùng
- Rót 225 ml đệm pepton (pH = 7) vào túi đựng mẫu gà đã cân, bóp đều trong 1 phút, để yên trong 30 phút, sau đó ủ ở nhiệt độ
37 0 C ± 1 0 C trong 18h ± 2h Bước 2: Tăng sinh chọn lọc
Sau khi ủ dịch tăng sinh ở nhiệt độ 37°C ± 1°C trong 18 giờ ± 2 giờ, chuyển 0.1 ml sang 10 ml môi trường RV broth (nuôi ở 41.5°C ± 1°C trong 24 giờ ± 3 giờ) và 1 ml sang 10 ml môi trường MKTTn broth (ủ ở 37°C ± 1°C trong 24 giờ ± 3 giờ) Tiếp theo, ria dịch đã tăng sinh lên môi trường thạch XLD agar, để yên trong 30 phút trước khi ủ ở 37°C ± 1°C trong 24 giờ ± 3 giờ Thực hiện tương tự với môi trường thạch HE agar.
30 phút rồi ủ ở nhiệt độ 37 0 C ± 1 0 C trong 24h ± 3h
Bước 4: Tiến hành bắt khuẩn lạc điển hình, bao gồm khuẩn lạc rìa hồng với tâm đen, nhẵn bóng, lồi, tròn trên môi trường XLD agar và khuẩn lạc rìa không màu, tâm đen, nhẵn bóng, lồi tròn trên HE agar Sau đó, nuôi cấy trên môi trường thạch dinh dưỡng (TSA) ở nhiệt độ 37°C ± 1°C trong khoảng thời gian 24 giờ ± 3 giờ.
Hình 3.3 Khuẩn lạc khi ria lên thạch XLD Bước 5: Thử các phản ứng sinh hóa để khẳng định
Để thực hiện thí nghiệm với thạch TSI, sử dụng que cấy vô trùng để lấy mẫu vi khuẩn đã nuôi trên thạch dinh dưỡng Cắm que cấy vào thạch TSI theo chiều sâu và sau đó cấy ria trên bề mặt nghiêng của thạch Cuối cùng, nuôi mẫu ở nhiệt độ thích hợp để quan sát kết quả.
Nhiệt độ 37°C ± 1°C trong môi trường nuôi cấy thạch TSI cho thấy các đặc điểm điển hình của Salmonella, bao gồm khả năng thể hiện tính kiềm với màu đỏ trên bề mặt nghiêng và tính axit với màu vàng khi cấy đâm sâu, kèm theo sự hình thành khí (bọt khí) và trong khoảng 90% trường hợp, tạo ra hydrosunfua khiến thạch bị đen.
Cấy đâm sâu giúp xác định sự hiện diện của glucoza qua màu sắc: màu vàng biểu thị glucoza dương tính, màu đỏ hoặc không đổi màu cho thấy glucoza âm tính, trong khi màu đen chỉ ra sự sinh khí hydro sulfua Ngoài ra, sự xuất hiện bọt hoặc vết rạn cũng cho thấy sự sinh khí từ glucoza.
+ Bề mặt thạch nghiêng: Màu vàng (lactoza và/hoặc sucroza dương tính), màu đỏ hoặc không đổi màu (lactoza và sucroza âm tính)
Hình 3.4 Kết quả phản ứng trên thạch TSI
Ure broth là môi trường nuôi cấy vi khuẩn, sử dụng que cấy vô trùng để chấm khuẩn lạc từ thạch dinh dưỡng, sau đó hòa vào dung dịch Ure broth trong ống nghiệm Mẫu được ủ ở nhiệt độ 37°C ± 1°C qua đêm Nếu có phản ứng dương tính, urê sẽ được phân giải thành amoniac, làm cho phenol chuyển từ màu đỏ sang hồng và sau đó là đỏ hồng Phản ứng này thường xuất hiện sau 2 đến 4 giờ.
Dương tính Salmonella Âm tính
Hình 3.5 Phản ứng trên Urea broth
- LDC: dùng que cấy vô trùng chấm khuẩn lạc đã nuôi trên thạch dinh dưỡng ở Bước 4, hòa vào dung dịch LDC trong ống nghiệm, nuôi ở nhiệt độ
37 0 C ± 1 0 C qua đêm Màu đục và đỏ tía sau khi ủ chứng tỏ phản ứng dương tính,
; màu vàng là phản ứng âm tính
Hình 3.6 Phản ứng trên LDC broth
Bước 6: Để khẳng định các chủng Salmonella phân lập được, thực hiện phản ứng ngưng kết trên phiến kính theo sơ đồ Kauffmann White Quy trình này bao gồm việc loại bỏ các chủng tự ngưng kết thông qua phản ứng ngưng kết với nước muối.
Sau đó kiểm tra kháng nguyên O, kháng nguyên H Để tiến hành phân typ các chủng thì cần ria các chủng phân lập được lên thạch dinh dưỡng, ủ 37 0 C trong 18 giờ
+ Nhỏ một giọt nước muối sinh lý 0.85% làm đối chứng lên phiến kính bằng cách sử dụng vòng que cấy
+ Lấy khuẩn lạc đã ria trên thạch dinh dưỡng lên phiến kính và trộn đều với giọt nước muối sinh lý
Đợi 30 giây để kiểm tra tính tự ngưng kết của chủng Nếu chủng tự ngưng kết, không cần thực hiện các bước định typ tiếp theo Ngược lại, với những chủng không tự ngưng kết, tiếp tục thực hiện các phản ứng ngưng kết kháng nguyên kháng thể.
Nhỏ một giọt kháng huyết thanh O của Salmonella vào mỗi vùng kiểm tra trên phiến kính Tiếp theo, cho chủng từ đĩa thạch dinh dưỡng vào các điểm có kháng huyết thanh và trộn đều cẩn thận Lắc nhẹ phiến kính trong 30 giây và quan sát phản ứng xảy ra.
Nhỏ một giọt kháng huyết thanh O của Salmonella vào mỗi vùng kiểm tra trên phiến kính Tiếp theo, cho chủng từ đĩa thạch dinh dưỡng vào các điểm có kháng huyết thanh và trộn đều cẩn thận Lắc nhẹ phiến kính trong 30 giây và quan sát phản ứng xảy ra.
Pha chế môi trường theo hướng dẫn của nhà sản xuất Môi trường trước khi sử dụng được kiểm soát chất lượng theo TCVN 8128-1,2 : 2009
Tuân thủ hướng dẫn của nhà sản xuất về bảo quản, hạn sử dụng và cách bảo quản là rất quan trọng Đối với môi trường phòng thí nghiệm, cần giữ ở điều kiện ổn định, tránh ánh sáng, độ ẩm và bảo quản ở nhiệt độ 5°C ± 3°C Đối với đĩa môi trường, thời gian bảo quản không quá 2 đến 4 tuần, trong khi các ống hoặc lọ nhỏ có thể được bảo quản từ 3 đến 6 tháng, trừ khi có quy định khác hoặc kết quả kiểm tra cho phép thời gian lâu hơn.