ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 43
2 1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Dê Định Hóa
- Địa điểm nghiên cứu: Thí nghiệm triển khai tại các xã Kim Phượng,
Phượng Tiến, Trung Hội, Bộc Nhiêu của huyện Định Hóa và Hợp tác xã chăn nuôi động vật bản địa huyện Phú Lương tỉnh Thái Nguyên
Các nghiên cứu về gen được tiến hành tại Phòng thí nghiệm sinh học phân tử của Viện Khoa học sự sống - Đại học Thái Nguyên
- Thời gian nghiên cứu: Từ năm 2016 - 2020
2 2 1 Nội dung 1: Nghiên cứu sinh trưởng và sức sản xuất thịt của dê Định Hóa
(1) Sinh trưởng tích lũy và sinh trưởng tuyệt đối (g/con/ngày) của dê tại các thời điểm sơ sinh đến 12 tháng tuổi
(2) Khảo sát một số chiều đo: Cao vây, vòng ngực, dài thân chéo, vòng ống tại thời điểm sơ sinh, 1, 3, 6, 9, 12 tháng tuổi
(3) Khảo sát năng suất thịt của dê Định Hóa tại thời điểm 9 và 12 tháng tuổi
2 2 2 Nội dung 2: Nghiên cứu đa hình gen POU1F1 và mối tương quan với tính trạng sinh trưởng của dê Định Hóa
(1) Lẫy mẫu phân tích: 336 mẫu
(2) Phân tích đa hình gen POU1F1
(3) Phân tích mối tương quan của đa hình gen POU1F1 với tính trạng sinh trưởng của dê
2 2 3 Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của kiểu gen của gen POU1F1 và thức ăn bổ sung đến sinh trưởng của dê Định Hóa
(1) Ảnh hưởng của kiểu gen của gen POU1F1 và thức ăn bổ sung đến sinh trưởng tích lũy, sinh trưởng tuyệt đối của dê Định Hóa
(2) Ảnh hưởng tương tác của kiểu gen của gen POU1F1 và thức ăn bổ sung đến sinh trưởng của dê Định Hóa
(3) Ảnh hưởng của kiểu gen của gen POU1F1 và thức ăn đến năng suất thịt của dê Định Hóa
(4) Tiêu tốn và chi phí thức ăn/kg tăng khối lượng của dê thí nghiệm
2 3 1 Nội dung 1: Nghiên cứu sinh trưởng và sức sản xuất thịt của dê Định Hóa
Mục tiêu nhằm đánh giá được khả năng sinh trưởng và sức sản xuất thịt của dê Định Hóa nuôi trong điều kiện chăn nuôi nông hộ
(1) Phương pháp nghiên cứu sinh trưởng của dê Định Hóa:
Dê được lựa chọn từ đàn dê thương phẩm, đảm bảo các đặc điểm nổi bật của giống dê Định Hóa Thí nghiệm được thực hiện tại ba hộ gia đình có điều kiện chuồng trại, đồi bãi chăn thả và phương thức chăn nuôi tương đồng, nhằm đảm bảo tính chính xác và đáng tin cậy của kết quả.
Nghiên cứu được thực hiện với 60 con dê, bao gồm 30 dê đực và 30 dê cái, trong khoảng thời gian từ sơ sinh đến 12 tháng tuổi Thí nghiệm được lặp lại hai lần, mỗi lần tại một hộ gia đình nuôi 10 dê (5 đực, 5 cái) Thời gian thí nghiệm diễn ra từ tháng 12/2016 đến tháng 6/2018.
Dê thí nghiệm được nuôi theo đàn tại hộ nông dân, chăn thả trên bãi đồi từ 9 giờ sáng đến chiều tối Ban đêm, dê được nhốt trong chuồng và được cung cấp nước pha muối trước khi ra ngoài ăn và sau khi trở về chuồng, nhưng không bổ sung thức ăn tinh.
Vào buổi sáng trước khi chăn thả, cần cân và đo kích thước các chiều của dê Khối lượng cơ thể của dê được theo dõi hàng tháng từ sơ sinh đến 12 tháng tuổi, trong đó khối lượng sơ sinh được cân ngay sau khi dê ra đời và đã được lau khô Để thực hiện việc này, sử dụng cân đồng hồ Nhơn Hòa loại 2 kg với độ chính xác ± 5 - 10 g.
Kích thước một số chiều đo của dê được xác định tại các thời điểm sơ sinh,
1, 3, 6, 9 và 12 tháng tuổi Phương pháp đo kích thước một số chiều đo (DươngMạnh Hùng và cs , 2017)
Vòng ngực (VN, cm): Sử dụng thước dây, đo chu vi quanh vòng ngực tiếp giáp phía sau của xương bả vai
Cao vây (cm) được đo từ mặt đất đến đỉnh cao nhất của xương bả vai (sau u vai) bằng cách sử dụng thước gậy đặt thẳng vuông góc với mặt đất Chỉ tiêu này giúp đánh giá sự phát triển của hai chân trước và phần thân trước.
Dài thân chéo (cm): Dùng thước gậy đo từ phía trước của đầu khớp bả vai cánh tay đến phía sau u ngồi
Vòng ống: Dùng thước dây đo chu vi 1/3 phía trên của xương bàn chân trái phía trước
Các chỉ tiêu theo dõi gồm: sinh trưởng tích lũy; sinh trưởng tuyệt đối (xác định theo TCVN 9715 - 2013); cao vây, dài thân chéo, vòng ngực và vòng ống
(2) Phương pháp khảo sát năng suất thịt của dê Định Hóa
Tiến hành theo phương pháp mổ khảo sát dê (Theo TCVN 9715 : 2013;
Dê được mổ khảo sát ở giai đoạn 9 và 12 tháng tuổi Số lượng mổ ở mỗi độ tuổi 8 con gồm 4 đực và 4 cái
Sau khi cho dê nhịn đói trong 24 giờ, tiến hành cân khối lượng hơi, cắt tiết, lột da và phân loại các sản phẩm sau mổ Các chỉ tiêu nghiên cứu bao gồm khối lượng móc hàm, khối lượng thịt xẻ, khối lượng thịt tinh và khối lượng xương.
Phương pháp cân các thành phần thân thịt được thực hiện bằng cách sử dụng các loại cân đồng hồ của Nhơn Hòa, với các trọng lượng 2 kg (độ chính xác ± 10 - 30 g), 5 kg (độ chính xác ± 10 - 30 g) và 30 kg (độ chính xác ± 50 - 150 g).
Các chỉ tiêu tính toán: Các tỷ lệ móc hàm, thịt xẻ, thịt tinh, xương được tính theo khối lượng sống (%)
Tiến hành phân tích thành phần hóa học trong thịt dê với các chỉ tiêu: vật chất khô theo TCVN 8135 : 2009; protein thô (%) theo TCVN 8134 :
2009; lipit thô (%) theo TCVN 8136 : 2009 và khoáng tổng số (%) theo
Sử dụng phần mềm Minitab 17, chúng tôi đã tiến hành xử lý số liệu thống kê để so sánh sự khác biệt giữa các số trung bình về sinh trưởng và năng suất thịt của dê đực và dê cái thông qua phương pháp so sánh cặp Turkey.
2 3 2 Nội dung 2: Nghiên cứu đa hình gen POU1F1 và mối tương quan với tính trạng sinh trưởng của dê Định Hóa
Sau khi thực hiện các biện pháp chăm sóc dê con mới sinh, chúng tôi đã thu thập 336 mẫu mô tai từ tháng 01/2017 đến tháng 02/2020 tại các hộ chăn nuôi dê.
Mẫu được thu bằng kìm cắt tai và bảo quản trong ethanol 70% ở nhiệt độ 4°C, sau đó lưu trữ ở -20°C tại phòng thí nghiệm Sinh học phân tử của Viện Khoa học Sự sống Thông tin về độ tuổi, giới tính và khối lượng cơ thể được ghi nhận tại các thời điểm sơ sinh, 3, 6, 9 và 12 tháng tuổi của từng cá thể.
(2) Phương pháp tách chiết ADN:
ADN tổng số của dê được tách chiết theo bộ kit tách chiết ADN gen GenomePlex theo quy trình như sau:
+ Phương pháp tách triết ADN tổng số bao gồm các bước như sau:
Bước đầu tiên là lấy mẫu và thấm khô cồn bằng giấy thấm Tiếp theo, sử dụng dao để loại bỏ sạch lông và phần bẩn màu đen trên mẫu, sau đó cắt nhỏ mẫu bằng dao.
Bước 2: Cho phần mẫu đã nghiền nhỏ vào ống effendoft 1,5 ml, thêm
500 àl buffer lysis Sau đú vortex 15 giõy và ủ 56 o C trong vũng 1 giờ (15 phút đảo trộn 1 lần)
Bước 3: Thờm 2 àl Proteinase K vào ống eppendorf chứa mẫu Ủ qua đêm ở 56 o C cho đến khi mẫu tan hết
Bước 4: Thờm 2 àl RNase vào ống eppendorf Ủ tiếp ở 37 o C trong 1 giờ
Bước 5: Bổ sung 500 àl CIAA, mix nhẹ bằng tay cho đến khi thấy dung dịch có màu trắng sữa đồng nhất Sau đó ủ tiếp ở -20 o C trong 1 giờ
Bước 6: Ly tâm 12000 rpm trong 15 phút Dùng pipette hút và chuyển dung dịch đó pha trờn sang ống eppendorf 1,5 ml mới (khoảng 400 àl)
Bước 7: Thêm dung dịch isopropanol với tỷ lệ 2:1 Sau đó đảo trộn đều và ủ ở -20 o C trong 2 giờ
Bước 8: Ly tâm 13000 rpm trong 15 phút Loại bỏ dịch nổi và thu cặn ADN Bước 9: Bổ sung 500 àl cồn 70% vào ống eppendorf Ly tõm 8000 rpm trong 5 phút
Bước 10: Đổ hết cồn, spindown rồi dùng pipette hút hết cồn dư Sau đó để khô tự nhiên Thu cặn ADN trong suốt
Bước 11: Thờm 50 àl dung dịch đệm Elution Buffer Bảo quản trong tủ -
20 oC sử dụng cho các công đoạn tiếp theo
(3) Phương pháp khuếch đại đoạn gen POU1F1:
Cặp mồi được thiết kế dựa trên trình tự gen POU1F1 của cừu (AJ549207) và bò (Zhao và cs, 2004) nhằm khuếch đại đoạn exon 6 (Lan và cs, 2007), thể hiện trong bảng 2.
Bảng 2 1 Trình tự các cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR
5’ - CCA TCA TCT CCC TTC TT - 3’
5’ - AAT GTA CAA TGT GCC TTC GAG - 3’
Thí nghiệm PCR được thực hiện với 20 µl phản ứng, bao gồm 0,4 µl dNTP, 10 pM mồi xuôi và mồi ngược, 1U Taq polymerase, và 100 ng ADN mẫu Quy trình nhiệt được thiết lập với các bước: 94 o C trong 45 giây, 50 o C trong 45 giây, và 72 o C trong 1 phút, lặp lại 32 chu kỳ, sau đó kéo dài sản phẩm ở 72 o C trong 5 phút Sản phẩm PCR thu được từ đoạn gen mong muốn.
POU1F1 được ủ với enzyme giới hạn DdeI ở 37 o C trong 5 giờ và được kiểm tra trên điện di agarose 1%
Sản phẩm PCR sau khi được khuếch đại sẽ được gửi đi giải trình tự ở công ty 1st BASE tại Singapore
Hình 2 1 Chu kì nhiệt độ của phản ứng PCR khuyếch đại đoạn gen POU1F1
(4) Phương pháp phân tích đa hình đoạn gen bằng enzyme giới hạn
Enzyme giới hạn, hay còn gọi là Endonuclease giới hạn, là những enzyme có khả năng nhận diện một trình tự ADN cụ thể và cắt đứt liên kết phosphodiester tại vị trí đó.
Cắt sản phẩm PCR gen POU1F1 bằng enzyme giới hạn DdeI
Bảng 2 2 Thành phần phản ứng cắt gen POU1F1 bằng enzyme Dde I
Bảng 2 3 Vị trí cắt của enzyme giới hạn
Sản phẩm PCR của cặp mồi được cắt bằng enzyme giới hạn và phân lập độ dài các đoạn ADN bằng cách chạy điện di trên gel agarose 1% - 2,5% với điện thế 110 V trong 60 phút trong hệ đệm TAE Sau đó, các đoạn ADN được nhuộm bằng Ethidium bromide và soi chụp dưới tia UV bằng máy chụp gel “Gel logic 1500 - Kodak - USD” Kết quả điện di được sử dụng để xác định kiểu gen cho từng cá thể.
(5) Phương pháp theo dõi sinh trưởng của dê: