(LUẬN văn THẠC sĩ) khảo sát tình hình vi khuẩn họ đường ruột sinh ESBL từ các mẫu bệnh phẩm được phân lập tại khoa vi sinh bệnh viện trung ương thái nguyên

ĐẦU

Đặt vấn đề

Kháng sinh đóng vai trò quan trọng trong việc chống lại vi sinh vật gây bệnh, nhưng việc sử dụng kháng sinh không kiểm soát đã dẫn đến nhiều hệ quả nghiêm trọng Vi khuẩn ngày càng kháng thuốc, làm giảm hiệu quả điều trị và dẫn đến tình trạng kháng sinh trở nên kém hiệu quả Mặc dù có sự phát triển của các loại kháng sinh mới, nhưng chúng không thể theo kịp với tốc độ kháng thuốc ngày càng gia tăng Đặc biệt, ở các nước đang phát triển, số lượng vi khuẩn kháng thuốc ngày càng tăng Sự lạm dụng kháng sinh là yếu tố chính thúc đẩy quá trình này, khiến con người phải đối mặt với những thách thức nghiêm trọng trong việc kiểm soát bệnh tật.

Nhóm trực khuẩn Gram âm đang là nguyên nhân chính gây nhiễm khuẩn nặng tại bệnh viện, với tỷ lệ tử vong cao do cơ chế sinh bệnh phức tạp và khả năng đề kháng cao với kháng sinh mạnh phổ rộng Trong số các vi khuẩn Gram âm kháng thuốc, đáng chú ý nhất là nhóm vi khuẩn họ đường ruột, bao gồm Escherichia coli, Klebsiella spp và Proteus spp., với tình trạng đề kháng ngày càng gia tăng qua các năm.

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng vi khuẩn sản sinh enzyme β-lactamase là nguyên nhân chính dẫn đến sự đề kháng kháng sinh nhóm Cephalosporins Đặc biệt, enzyme β-lactamase phổ rộng (Extended-Spectrum β-lactamase: ESBL) đóng vai trò quan trọng trong việc giúp vi khuẩn kháng lại các loại kháng sinh như Penicilin, Cephalosporin thế hệ 3, 4 và Monobactam.

Hiện nay, việc lựa chọn kháng sinh ban đầu ưu tiên sử dụng các loại kháng sinh phổ rộng mạnh mẽ, nhằm bao phủ hầu hết các tác nhân gây bệnh Sau khi có kết quả từ kháng sinh đồ, việc điều chỉnh liệu pháp điều trị sẽ được thực hiện.

2 sẽ điều chỉnh lại cho phù hợp, đảm bảo tính hiệu quả, ít tốn kém và giảm sự phơi nhiễm của các kháng sinh

Tại Việt Nam, tình trạng mua thuốc không cần đơn diễn ra phổ biến tại các quầy thuốc tư nhân, dẫn đến việc sử dụng kháng sinh liều cao, đắt tiền tại các phòng khám tư Sự dễ dàng trong việc tiếp cận thuốc đã thúc đẩy tâm lý muốn nhanh chóng khỏi bệnh của bệnh nhân, nhưng điều này đã góp phần làm tăng tỷ lệ kháng thuốc kháng sinh, khiến Việt Nam trở thành một trong những quốc gia có tỷ lệ kháng thuốc cao nhất thế giới theo tổ chức Y tế thế giới.

Vi khuẩn đường ruột sản sinh ra enzyme ESBL gây tác hại nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng, đặc biệt tại Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên, một trong những bệnh viện lớn ở Đông Bắc Việt Nam Bệnh viện này tiếp nhận nhiều bệnh nhân nặng và đóng vai trò là tuyến cuối cho các bệnh viện cơ sở trong khu vực, do đó, khả năng kháng thuốc tại đây được nghi ngờ là rất cao.

Nhóm nghiên cứu chúng tôi đã thực hiện đề tài nhằm tìm hiểu sâu hơn về vi khuẩn đường ruột sinh ESBL, xuất phát từ những tác nhân quan trọng liên quan đến vấn đề này.

“Khảo sát tình hình vi khuẩn họ đường ruột sinh ESBL từ các mẫu bệnh phẩm được phân lập tại Khoa Vi sinh Bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên”.

Mục tiêu của đề tài

Khảo sát tình hình kháng kháng sinh của vi sinh vật đường ruột được thực hiện từ các mẫu bệnh phẩm tại khoa Vi sinh, Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên Nghiên cứu này nhằm đánh giá mức độ kháng thuốc của các vi sinh vật, từ đó cung cấp thông tin quan trọng cho việc điều trị và phòng ngừa các bệnh nhiễm trùng liên quan đến đường ruột.

-Khảo sát tỉ lệ các chủng vi khuẩn Gram âm đường ruột thường gặp trong bệnh viện Trung ương Thái Nguyên

-Khảo sát tỉ lệ vi khuẩn Gram âm đường ruột sinh ESBL

-Khảo sát tình hình kháng kháng sinh của các vi khuẩn trên

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

-Đánh giá được thực trạng của vi khuẩn đường ruột kháng thuốc

Cung cấp tài liệu về vi khuẩn kháng thuốc là rất quan trọng để hỗ trợ các nghiên cứu sâu hơn về vi sinh vật kháng thuốc, cũng như trong việc điều trị các bệnh liên quan đến vi khuẩn đường ruột.

Xây dựng kháng sinh đồ cho từng bệnh nhân là yếu tố quan trọng trong việc phát triển chế độ hóa trị liệu phù hợp, giúp hạn chế sự lây lan của vi khuẩn.

Escherichia coli, Klebsiella spp và Proteus spp sinh ESBL ngoài cộng đồng.

QUAN TÀI LIỆU

Tổng quan về vi khuẩn

Vi khuẩn là sinh vật đơn bào có kích thước nhỏ, thuộc loại tế bào nhân sơ (Procaryote) Chúng có nhiều hình dạng khác nhau, bao gồm hình cầu (cầu khuẩn), hình que (trực khuẩn) và hình xoắn (xoắn khuẩn).

Vi khuẩn, có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp nghĩa là "cái gậy", được hiểu rộng rãi là các vi sinh vật thuộc ngành Bacteria Tuy nhiên, trong nghĩa hẹp, thuật ngữ này không bao gồm các loại vi khuẩn nhầy, xạ khuẩn, xoắn thể, Rickettsi và Mycoplasma.

Nhóm trực khuẩn được phân thành hai loại chính: Gram âm và Gram dương Trong đó, vi khuẩn Gram âm, đặc biệt là các vi khuẩn thuộc họ đường ruột, là nhóm phổ biến nhất.

2.1.2Vi khuẩn đường ruột Ở người tập trung rất nhiều loại vi khuẩn họ đường ruột, nhưng đông nhất vẫn là ở hệ tiêu hóa cụ thể là ở trong ruột người.Căn cứ theo đặc tính gây bệnh của vi khuẩn đường ruột người ta chia thành 2 nhóm:

-Nhóm vi khuẩn gây bệnh đây là nhóm vi khuẩn có thể gây ra bệnh[2].

Nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội xuất hiện khi hệ thống miễn dịch của cơ thể suy yếu hoặc do sự gia tăng độc lực của các loài vi khuẩn Các vi khuẩn này có khả năng gây bệnh trong những điều kiện mà cơ thể không thể chống lại, dẫn đến các vấn đề sức khỏe nghiêm trọng.

Vi khuẩn đường ruột có hình thể dạng que, dài khoảng 1-5 micromet, thường có flagella và không sinh bào tử, đồng thời có đặc điểm oxydase âm tính Hầu hết các loài trong nhóm này sở hữu fimbriae kiểu peritrichous type I, giúp bám dính vào tế bào ký chủ.

Chỉ một số ít vi khuẩn đường ruột có lông và vỏ, thuộc giới Bacteria, ngành Proteobacteria, lớp Gramma Proteobacteria, bộ Enterobacteriales, họ Enterobacteriaceae Trong số các vi khuẩn gây bệnh phổ biến ở người, Escherichia coli, Klebsiella spp và Proteus spp là những loại thường gặp nhất.

Các vi khuẩn đường ruột dễ dàng phát triển trên môi trường nuôi cấy thông thường Trong môi trường lỏng, chúng có thể làm đục và tạo cặn ở đáy ống, thậm chí tạo váng trên bề mặt Khi nuôi trên môi trường đặc, vi khuẩn hình thành ba dạng khuẩn lạc khác nhau.

+ Dạng S: Khuẩn lạc tròn, bờ đều, nhẵn bóng

+ Dạng R: Mặt khô, xù xì, thường gặp khi nuôi cấy giữ chủng

Khuẩn lạc dạng M có kích thước lớn hơn khuẩn lạc dạng S, thường có hình thức nhày và có xu hướng hòa vào nhau Phát triển theo dạng này thường thấy ở những vi khuẩn có khả năng tạo thành vỏ.

Vi khuẩn đường ruột có những đặc điểm sinh hóa quan trọng như khả năng di động và khả năng lên men đường, đặc biệt là glucose và lactose Việc không lên men glucose cho thấy vi khuẩn không thuộc họ này Ngoài ra, vi khuẩn có thể sinh hơi trong quá trình lên men và có sự hiện diện của một số enzyme như oxydase, urease và tryptophanease Nếu vi khuẩn có oxydase dương tính, chúng không thuộc họ vi khuẩn đường ruột Khả năng sinh sulfua hidro (H2S) khi phân hủy protein và acid amin cũng là một yếu tố quan trọng Vi khuẩn cũng cần phát triển trên môi trường tổng hợp tối thiểu, với khả năng sử dụng citrate làm nguồn carbon duy nhất thường được thử nghiệm trong môi trường Simmon Những đặc tính này giúp dễ dàng xác định vi khuẩn đường ruột.

Bảng 1.1 Tính chất sinh hóa của một số loại vi khuẩn đường ruột thường gặp

G GAS H 2 S MR VP IND CIT URE LYS PAD

Kháng nguyên Đối với kháng nguyên thường có 3 loại kháng nguyên như sau: O (thân), H (roi- flagellar) và K (vỏ capsular)[3].

Kháng nguyên O là một thành phần quan trọng của vi khuẩn, thuộc về cấu trúc thân của chúng Thành phần chính của kháng nguyên O bao gồm lipopolysaccharide (LPS), lipoprotein và peptidoglycan Trong đó, LPS đóng vai trò là kháng nguyên vách chủ yếu của vi khuẩn đường ruột, được xem như một nội độc tố Kháng thể chính được sản sinh để chống lại kháng nguyên O là IgM.

Kháng nguyên H là kháng nguyên lông của vi khuẩn, chỉ xuất hiện ở các loài vi khuẩn có lông, và có bản chất là protein Kháng thể chính liên quan đến kháng nguyên H là IgG Chức năng của kháng nguyên H phụ thuộc vào trình tự chuỗi acid amin trong protein flagellar, cụ thể là flagellin.

Kháng nguyên K là kháng nguyên nằm ở vỏ hoặc màng bọc bên ngoài kháng nguyên thân, có bản chất hóa học là protein hoặc polisaccharide Nó có thể xuất hiện dưới dạng một lớp vỏ dày, dễ dàng quan sát bằng kính hiển vi quang học, hoặc một lớp mỏng chỉ có thể nhìn thấy bằng kính hiển vi điện tử.

Các vi khuẩn đường ruột chủ yếu gây ra các bệnh lý liên quan đến hệ tiêu hóa, bao gồm tiêu chảy, viêm ruột ỉa chảy và viêm đại tràng Mỗi loại vi khuẩn có khả năng gây bệnh ở những vị trí khác nhau trong đường tiêu hóa, và cơ chế gây bệnh của chúng cũng có sự khác biệt đáng kể.

Escherichia coli (E coli) là một loài vi khuẩn Gram âm, thường được gọi là vi khuẩn đại tràng Loài vi khuẩn này sống cộng sinh và chiếm 80% vi khuẩn trong ruột, đóng vai trò quan trọng trong việc tổng hợp một số vitamin như B, K, E và duy trì sự cân bằng quần thể vi khuẩn đường ruột.

Tổng quan về các kháng sinh thuộc nhóm β - lactam

Kháng sinh nhóm β-lactam là một trong những nhóm kháng sinh quan trọng nhất trong lịch sử và y học Nhóm này bao gồm các hợp chất có vòng β-lactam, được đặc trưng bởi cấu trúc nhân cơ bản.

Bảng 1.2 Các nhân cơ bản của kháng sinh thuộc nhóm β-lactam

Tên nhân Cấu trúc hóa học chung

Nhân Penam Các penicillin tự nhiên và bán tổng hợp

Các penicillin kháng β- lactamase Acid clavulanic

Cefadroxil Cefaclor Cephalexin Cefixim Ceftibulen Nhân carbapenem Các carbapenem bán tổng hợp imipenem, meropenem

2.2.1 Phân loại kháng sinh thuộc nhóm β-lactam

Theo cấu trúc hóa học của kháng sinh thuộc nhóm β-lactam được chia thành

4 loại:Penicillin, Cephalosporin, Carbapenem, Monobactam

Nhóm kháng sinh này có cấu trúc gồm hai vòng β-lactam liên kết với vòng thiazolidin, chỉ khác nhau ở gốc R của mạch ngang Một ví dụ điển hình là Acid clavulanic, một kháng sinh phổ rộng có khả năng kháng β-lactamase, tác động lên nhiều loại vi khuẩn Gram dương và Gram âm Acid clavulanic đặc biệt hiệu quả trong việc ức chế β-lactamase truyền qua plasmid, nguyên nhân chính gây kháng penicillin và cephalosporin Vì vậy, acid clavulanic thường được kết hợp với các kháng sinh khác để nâng cao hiệu quả chống lại vi khuẩn sinh β-lactamase mạnh, đặc biệt là những vi khuẩn kháng penicillin và cephalosporin.

Sulbactam và tazobactam tương tự cũng là những chất kháng sinh được dùng kết hợp với các kháng sinh khác trong việc chống lại các vi khuẩn kháng thuốc[5].

Nhóm kháng sinh Cephalosporin là một trong những loại thuốc quan trọng nhất hiện nay, đứng thứ 7 trong danh sách 10 loại thuốc được sử dụng phổ biến nhất để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn Cephalosporin và cephamycin có cấu trúc đặc trưng với vòng β-lactam liên kết với dị vòng dihydrothiazin (nhân cephem) Điểm khác biệt giữa cephamycin và cephalosporin nằm ở nhóm –OCH3 tại vị trí CR7 (R2).

Nhóm Carbapenem là kháng sinh β-lactam có khả năng kháng khuẩn rộng, đặc biệt hiệu quả chống lại hầu hết các β-lactamase Được phát triển từ thienamycin, một chất được tìm thấy trong Streptomyces cattleya vào năm 1976, carbapenem được coi là lựa chọn cuối cùng trong điều trị các vi khuẩn kháng thuốc Cấu trúc của carbapenem tương tự như penicillin, nhưng có sự thay thế carbon cho phân tử lưu huỳnh ở vị trí số 1.

Monobactam là một loại kháng sinh có cấu trúc vòng β-lactam đặc trưng, không chứa vòng thiazolidine 5 cạnh như penicillin hay vòng dihydrothiazine 6 cạnh của cephalosporin Chất này chỉ có hiệu quả đối với các vi khuẩn Gram âm và hiện đang được sử dụng phổ biến với tên gọi aztreonam (Azactam).

Nhóm kháng sinh này hoạt động bằng cách tác động lên thành tế bào của vi khuẩn, khác với tế bào nhân thực Tế bào vi khuẩn có áp suất thẩm thấu cao hơn, do đó chúng được bao bọc bởi một lớp thành tế bào Thành tế bào được cấu tạo từ peptidoglycan, bao gồm các chuỗi polysaccharide thẳng và các đoạn penta-peptide Polysaccharide này chứa các phân tử đường với gốc amin như N-acetyl-glucosamine và N-acetyl-muramic.

Các β-lactam ức chế sự phát triển của vi khuẩn bằng cách ngăn chặn tổng hợp thành tế bào Chúng gắn vào các thụ thể PBPs (Penicillin binding proteins), trong đó có các enzyme transpeptidase Khi β-lactam liên kết với các thụ thể này, quá trình transpeptidation bị ức chế, dẫn đến việc ngăn cản tổng hợp peptidoglycan, một thành phần thiết yếu của thành tế bào vi khuẩn.

Khi quá trình tạo thành peptidoglycan không diễn ra chính xác, tế bào vi khuẩn sẽ có thành tế bào yếu, dễ bị tổn thương trước áp suất thẩm thấu Điều này dẫn đến việc màng tế bào bị phồng lên tại các điểm yếu do nước thẩm thấu vào, cuối cùng gây ra sự vỡ tế bào.

Giai đoạn này liên quan đến việc kích hoạt các enzyme tự tiêu, dẫn đến sự phân hủy tế bào trong môi trường đẳng trương Trong môi trường ưu trương, tế bào biến đổi thành protoblast hoặc spheroblast, chỉ được bao bọc bởi một màng tế bào, khiến chúng dễ bị vỡ.

Các kháng sinh nhóm β-lactam chỉ ức chế sự phát triển của vi khuẩn bằng cách ngăn chặn quá trình tổng hợp nguyên liệu thành tế bào, nhưng không ảnh hưởng đến peptidoglycan đã có sẵn, do đó chúng chỉ có tác dụng đối với các tế bào vi khuẩn đang trong giai đoạn sinh trưởng.

Trong quá trình sinh sản, các tế bào nghỉ không bị ảnh hưởng, điều này có nghĩa là chúng không tác động đến tế bào động vật và thực vật, bởi vì các loại tế bào này không chứa thành tế bào peptidoglycan.

Tổng quan về đề kháng kháng sinh của vi khuẩn

Kháng sinh có khả năng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn, tuy nhiên, khi vi khuẩn vẫn phát triển trong môi trường có kháng sinh, hiện tượng này được gọi là đề kháng kháng sinh.

Kháng sinh được phân thành hai nhóm, trong đó đề kháng tự nhiên là khả năng mà mầm bệnh đã có sẵn trước khi tiếp xúc với môi trường có kháng sinh.

Nguyên nhân gây ra tình trạng kháng thuốc ở vi sinh vật bệnh lý là do đột biến ngẫu nhiên trong nhiễm sắc thể, dẫn đến sự xuất hiện của các chủng kháng thuốc Trong quá trình điều trị, các chủng vi sinh vật bình thường bị tiêu diệt, trong khi các chủng kháng thuốc vẫn sống sót và phát triển Hậu quả là sự thay đổi hoàn toàn bản chất của vi sinh vật gây bệnh, làm giảm hiệu quả của các phương pháp điều trị bằng kháng sinh.

Đề kháng thu được là khả năng kháng thuốc của vi sinh vật phát triển sau khi tiếp xúc với kháng sinh, do biến cố di truyền khiến vi khuẩn xuất hiện gen đề kháng Những biến cố này bao gồm biến đổi gen và tiếp nhận gen kháng thuốc.

Ví dụ: Samonella kháng Cloramphenicol

2.3.3 Cơ chế đề kháng kháng sinh

Vi khuẩn sản xuất enzyme có khả năng biến đổi hoặc phá hủy cấu trúc hóa học của kháng sinh Chẳng hạn, enzyme β-lactamase có tác dụng phá vỡ các vòng β-lactam của penicillin và các phân tử tương tự, khiến chúng trở nên không còn hiệu lực.

14 được trên 200 loại lactamase khác nhau Các gen quy định chúng thường nằm trên plasmid R[9][10].

Hình 1.1 Hoạt động phân giải penicillin của penicillinase [24]

Sự đề kháng của các tác nhân gây bệnh làm chậm hoặc ngăn chặn sự xâm nhập của kháng sinh vào tế bào, thường liên quan đến sự thay đổi trong cấu trúc hoặc điện tích của các protein màng tế bào, đặc biệt là các porin trong màng ngoài của vi khuẩn Gram âm Những thay đổi này xuất phát từ biến đổi gen nhiễm sắc thể, dẫn đến sự thay đổi thụ thể đối với thuốc, khiến cho kháng sinh không thể gắn kết hiệu quả vào mục tiêu Đề kháng này thường gặp với các chất kháng trao đổi chất như sulfonamid và các thuốc như erythromycin, làm cản trở quá trình dịch mã.

Hình 1.2 Cơ chế làm thay đổi thụ thể đối với thuốc [24]

Vi khuẩn có khả năng thay đổi quá trình chuyển hóa, khiến cho thuốc kháng sinh không còn hiệu quả Chẳng hạn, một tế bào có thể phát triển đề kháng với thuốc bằng cách sản sinh ra nhiều enzyme hơn cho con đường trao đổi chất bị ảnh hưởng Ngoài ra, các tế bào cũng có thể trở nên kháng thuốc qua những cơ chế khác nhau.

15 sunfonamit bằng cách từ bỏ sự tổng hợp axid folic, thay vào đó chúng hấp thụ acid này từ ngoài môi trường[9][10]

Hình 1.3 Cơ chế thay thế con đường trao đổi chất [24]

Các tế bào đề kháng có thể bơm thuốc ra khỏi tế bào trước khi thuốc có thể gây tác dụng[9][10].

Hình 1.4 Cơ chế bơm thuốc ra khỏi tế bào [24]

2.3.4 Các biện pháp hạn chế sự gia tăng kháng kháng sinh

Một số biện pháp đã được đưa ra nhằm hạn chế sự gia tăng vi khuẩn kháng kháng sinh như sau:

-Chỉ dùng kháng sinh để điều trị những bệnh truyền nhiễm

Chọn kháng sinh dựa trên kết quả của kháng sinh đồ, ưu tiên các loại kháng sinh có tác dụng đặc hiệu đối với vi khuẩn gây bệnh và khả năng khuếch tán tốt đến vị trí nhiễm trùng.

-Dùng kháng sinh với một liều lượng vừa đủ và trong thời gian phù hợp (áp dụng cho một đợt điều trị)

-Duy trì thường xuyên việc giám sát sự phát triển đề kháng kháng sinh của vi khuẩn để từ đó sẽ đưa ra được chiến lược phù hợp nhất

Tổng quan về ESBL

ESBL là enzyme do vi khuẩn sản xuất để chống lại thuốc kháng sinh, phát sinh từ đột biến của β-lactamase do cephalosporins thế hệ 3 kích thích Những đột biến này liên quan đến sự thay đổi từ 1 đến 7 acid amin gần trung tâm hoạt động của enzyme, tạo ra một trung tâm hoạt động linh hoạt và tiến hóa hơn.

Vì thế tăng ái lực và tăng hoạt động thủy phân đối với cephalosporins thế hệ 3 (như ceftazidime, cefotaxime, ceftriaxone, ) và monobactams (aztreonam)

Hầu hết các enzyme ESBL xuất phát từ hai loại chính là TEM và SHV, với hơn 90 loại enzyme TEM và 25 loại enzyme SHV đã được xác định Các enzyme này thường được phát hiện trong vi khuẩn E coli và K pneumoniae.

Tuy nhiên, chúng cũng có thể được tìm thấy ở Proteus spp và các chủng vi khuẩn khác thuộc họ Enterobacteriaceae[25].

TEM: TEM-1 là loại β-lactamase thường gặp ở vi khuẩn Gram âm Hơn 90 chủng E coli kháng lại với ampicillin là nhờ có TEM-1

TEM-1 có khả năng thủy phân penicillin và các cephalosporins thế hệ 1 như cephalothin và cephaloridine TEM-2 là dẫn xuất đầu tiên của TEM-1, có sự thay thế

1 acid amin so với β-lactamase nguyên thủy TEM-3 được báo cáo lần đầu tiên vào năm 1989, là loại TEM - β-lactamase đầu tiên bộc lộ kiểu hình của ESBL [28]

TEM-3 có khả năng phân giải cephalosporin phổ rộng Sau đó, hơn 130 β- lactamase TEM được mô tả [27]

Mặc dù β-lactamase loại TEM chủ yếu xuất hiện ở E coli và K pneumoniae, nhưng chúng cũng được phát hiện ở nhiều chủng vi khuẩn Gram âm khác, với tần suất ngày càng gia tăng.

SHV: SHV - 1 thường được tìm thấy ởK pneumoniae, và chính nó đã gây ra hơn 20% sựđề kháng ampicillin qua trung gian plasmid ở chủng này.Không như TEM-1, SHV-

1 chỉ có vài dẫn xuất Phần lớn các SHV khác nhau mang kiểu hình ESBL được đặc trưng

17 bởi sự thay đổi acid amin tại vị trí 238, thay serine bằng glycine[28].

Bảng 1.3 Các lớp ESBL chính [26]

Lớp Nguồn gốc Các biến thể

Các đột biến TEM penicillinase, nguồn gốc không rõ, các thay thế 1 –

Các đột biến SHV penicillinase, ở K pneumoniae thì xuất phát từ nhiễm sắc thể; thay thế

CTX-M (A) Ở Kluyvera spp hầu hết hay tất cả các phân lớp đều xuất phát từ nhiễm sắc thể, rồi được chuyển động nhờ các chuyển động chèn

OXA-15 (D) Đột biến OXA - 2, được biết từ lâu là penicillinase có nguồn ngốc không rõ

- 2), được biết từ lâu là penicillinase có nguồn ngốc không rõ

Hiện nay, hầu hết các chủng SHV đều mang kiểu hình ESBL, ngoại trừ SHV-10, được ghi nhận với kiểu hình đề kháng - ức chế Enzyme SHV-10 có nguồn gốc từ SHV-5 và đặc biệt chứa thêm một glycine thay thế cho serine tại vị trí 130.

CTX-M là enzyme qua trung gian plasmid có khả năng phân giải mạnh cefotaxim, chủ yếu được phát hiện ở E coli, nhưng cũng xuất hiện ở các chủng khác thuộc họ Enterobacteriaceae.

Sự mở rộng hoạt tính của CTX-M.ESBL kháng cephalosporin phổ rộng không chỉ do sự thay đổi của một vài acid amin như ở TEM hay SHV, mà chủ yếu là do sự hiện diện của serine ở vị trí 237, điều này có mặt ở tất cả các loại CTX-M Năm 2006, CTX-M-15 được phát hiện phổ biến ở chủng E coli tại Anh và đã nhanh chóng lan rộng ra toàn cầu Hiện tại, đã có hơn 40 loại CTX-M được xác định.

Enzyme OXA, được đặt tên do khả năng thủy phân oxacillin, có cấu trúc phân tử khác biệt so với các enzyme TEM và SHV, thuộc lớp D OXA cũng có chức năng riêng, thuộc nhóm 2d, cho thấy sự đa dạng trong các loại enzyme kháng thuốc.

Vi khuẩn này có khả năng kháng thuốc ampicillin và cephalothin, đồng thời có hoạt động thủy phân mạnh với oxacillin và cloxacillin, ít bị ức chế bởi acid clavulanic Đặc biệt, hầu hết các enzym beta-lactamase phổ rộng (ESBL) thường được phát hiện ở các chủng E coli và K pneumoniae.

Nguyên tắc xét nghiệm ESBL trong vi sinh lâm sàng gồm 2 bước[13]:

-Bước 1: Xét nghiệm sàng lọc

-Bước 2: Xét nghiệm xác định

Xét nghiệm sàng lọc nhằm chọn lựa cephalosporin(s) chỉ điểm để khảo sát sự đề kháng và giảm nhạy cảm, từ đó phát hiện các chủng vi khuẩn có khả năng sinh ESBL Việc sử dụng nhiều loại cephalosporin sẽ gia tăng cơ hội phát hiện các kiểu kháng thuốc ít gặp Các kháng sinh được khuyên dùng cho các chủng thuộc họ Enterobacteriaceae bao gồm cefpodoxime, ceftazidime, aztreonam, cefotaxim và ceftriaxone Nếu đường kính vòng vô khuẩn nhỏ hơn hoặc bằng điểm gãy (BP) của bất kỳ kháng sinh nào trong số này, có thể xác định được chủng vi khuẩn sinh ESBL, và sẽ tiến hành bước tiếp theo.

Xét nghiệm xác định: Xét nghiệm xác định ESBL dựa vào tìm kiếm sự cộng hưởng giữa oxymino-cephalosporin và clavulanate Nhờ đó phân biệt các chủng

ESBL (cộng hưởng dương) có khả năng kháng thuốc do nhiều nguyên nhân khác nhau (cộng hưởng âm), trong đó clavulanate đóng vai trò ức chế ESBL Hiện nay, nhiều phương pháp phát hiện ESBL đã được đề xuất, chủ yếu dựa trên nguyên tắc đĩa khuyếch tán của Kirby - Bauer Các phương pháp phổ biến hiện nay bao gồm phương pháp đĩa đôi, phương pháp đĩa kết hợp và phương pháp E-test.

Phương pháp đĩa đôi, được Jarlier và cộng sự mô tả vào năm 1988, dựa trên nguyên tắc sử dụng acid clavulanic để ức chế enzym beta-lactamase mở rộng phổ (ESBL) Phương pháp này giúp giảm mức độ đề kháng của cephalosporins và mở rộng vòng vô khuẩn của đĩa kháng sinh cephalosporins khi được đặt gần một đĩa kháng sinh chứa acid clavulanic.

Vi khuẩn được cấy trên đĩa thạch Mueller - Hinton, với đĩa cephalosporin (30µg) và đĩa amoxicillin-clavulanate (20µg) cách nhau 20 - 25mm trên mặt thạch Khoảng cách này đã được giảm từ 30mm trước đây để tăng độ nhạy cảm của phương pháp Có hiện tượng cộng hưởng khi vòng vô khuẩn của đĩa cephalosporin mở rộng tại vùng giao tiếp với đĩa chứa clavulanate Phương pháp này dễ thực hiện, nhưng có thể bỏ sót một số chủng vi khuẩn có ESBL.

Phương pháp đĩa kết hợp, được Jacoby và Hans giới thiệu lần đầu vào năm 1999, sử dụng hai loại đĩa kháng sinh là cephalosporins thế hệ 3 và cephalosporins thế hệ 3 phối hợp với acid clavulanic Việc phát hiện vi khuẩn tiết ESBL được thực hiện khi hiệu số đường kính vòng vô khuẩn của đĩa cephalosporins kết hợp với acid clavulanic lớn hơn hoặc bằng 5mm so với đĩa cephalosporins Các loại đĩa kháng sinh được sử dụng bao gồm cefotaxime (30µg)/cefotaxime - clavulanic acid (30/10µg), ceftazidime (30µg)/ceftazidime - clavulanic acid (30/10µg), và cefpodoxime.

Tiêu chuẩn CLSI yêu cầu phương pháp mới phải thực hiện đồng thời trên cả hai hệ thống, bao gồm cefotaxime (30µg)/cefotaxime - clavulanic acid (30/10µg) và ceftazidime (30µg)/ceftazidime-clavulanic acid (30/10µg) Phương pháp này dễ thực hiện, ít tốn kém, nhưng yêu cầu phòng thí nghiệm phải có đĩa kháng sinh cefotaxime.

- clavulanic acid và ceftazidime-clavulanic acid Một số trường hợp cho kết quả

20 dương tính giả do một số vi khuẩn sinh AmpC cũng xuất hiện sự gia tăng đường kính vòng vô khuẩn khi có clavulanic acid

Phương pháp E-test sử dụng que E-test (AB Biodisk, Solna, Sweden) với một đầu chứa dãy nồng độ của cephalosporin và đầu đối diện chứa dãy nồng độ của cephalosporin/clavulanic acid Nếu đầu chứa clavulanic acid làm giảm MIC ≥ 8 lần so với đầu còn lại, điều này cho thấy vi khuẩn có khả năng sinh ESBL Mặc dù phương pháp này mang lại kết quả chính xác, nhưng chi phí thực hiện lại khá cao.

Tình hình nghiên cứu các họ vi khuẩn đường ruột sinh ESBL trên thế giới và tại Việt Nam

2.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Hiện tượng vi khuẩn sinh ESBL đã xuất hiện từ Tây Âu và hiện nay được phát hiện rộng rãi ở nhiều quốc gia như Mỹ và các nước Châu Á Tần suất xuất hiện của vi khuẩn này có sự khác biệt tùy thuộc vào từng quốc gia và viện nghiên cứu.

Kháng thuốc kháng sinh đang trở thành một vấn đề nghiêm trọng toàn cầu, gây gánh nặng lớn về chi phí điều trị do cần thay thế các kháng sinh cũ bằng những loại mới đắt tiền Tại Mỹ, tỷ lệ vi khuẩn đường ruột sinh ESBL dao động từ 0 đến 25% tùy theo từng viện nghiên cứu, với tỷ lệ trung bình toàn quốc khoảng 3% Nghiên cứu của SENTRY cho thấy tỷ lệ K pneumoniae sinh ESBL ở Mỹ là 7,6%, so với 4,9% ở Canada.

Tỉ lệ E coli sinh ESBL tại Mỹ là 4,2% và ở Canada là 3,3% Nghiên cứu của Moland và các cộng sự (2001-2002) cho thấy tỉ lệ sinh ESBL ở K pneumoniae là 11,3% và ở E coli là 2,6% trên toàn nước Mỹ Tại Châu Âu, tỉ lệ vi khuẩn đường ruột sinh ESBL cũng có sự biến đổi theo từng quốc gia, ví dụ như một nghiên cứu tại Hà Lan vào năm 1999 trên 11 phòng thí nghiệm.

Chỉ có dưới 1% E coli và K pneumoniae sản sinh enzyme ESBL Tuy nhiên, nghiên cứu tại Pháp cho thấy 40% chủng K pneumoniae phân lập được kháng ceftazidime Trên toàn Châu Âu, tỷ lệ K pneumoniae kháng ceftazidime là 20% tại các cơ sở điều trị thông thường và 42% tại các cơ sở chăm sóc đặc biệt.

Tại Châu Á, tỉ lệ vi khuẩn đường ruột sinh enzyme beta-lactamase phổ rộng (ESBL) vẫn còn thấp, với mức dưới 0,1% đối với E coli và 0,3% đối với K pneumoniae tại Nhật Bản Tuy nhiên, tỉ lệ này cao hơn ở các nước khác, như Hàn Quốc với 4,8%, Đài Loan 8,5%, và Hồng Kông 12% Ở Ả Rập Xêut, một nghiên cứu trên 3231 vi khuẩn Gram âm cho thấy tỉ lệ sinh ESBL cũng là 4,8%, trong khi Ấn Độ ghi nhận tỉ lệ cao nhất với 26,6%.

2.4.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

Tại Việt Nam, đã có nhiều công trình nghiên cứu cho thấy tỉ lệ khá cao các vi khuẩn E coli, K pneumoniae và Poteus spp sinh ESBL

Theo nghiên cứu của Hoàng Thị Phương Dung tại Bệnh viện Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh từ tháng 7 đến tháng 12 năm 2008, tỉ lệ sinh ESBL đạt 32,4% (66/204 chủng) Trong số đó, E coli có tỉ lệ sinh ESBL cao nhất với 71,2% (47/66 chủng), tiếp theo là K pneumoniae với 15,2% (10/66 chủng).

Nghiên cứu GARP-VN từ 15 bệnh viện tại Việt Nam đã chỉ ra tình hình đáng báo động về tỉ lệ vi khuẩn E coli và K pneumoniae tiết ESBL Cụ thể, tại Bệnh viện Chợ Rẫy, tỉ lệ lần lượt là 49% và 58%, trong khi Bệnh viện Việt Đức ghi nhận 57% và 49% Tại Bệnh viện Nhiệt đới Quốc Gia, tỉ lệ này là 55% và 73%, và ở Bình Định, con số này đạt 36% và 54%.

Tại các khoa hồi sức tích cực, tình trạng nhiễm khuẩn trở nên nghiêm trọng hơn do đây là nơi điều trị cho những bệnh nhân nặng nhất Các vi khuẩn gram âm mang gen kháng thuốc, đặc biệt là β-lactamase, là một thách thức lớn trong việc quản lý và điều trị.

Theo báo cáo của WHO giai đoạn 2011 - 2014, Việt Nam là một trong những quốc gia có tỷ lệ vi khuẩn E coli sản sinh enzyme ESBL cao nhất thế giới.

TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Các chủng vi sinh vậtEscherichia coli, Klebsiella spp., Proteus spp.được phân lập tại phòng nuôi cấy-kháng sinh đồ Khoa vi sinh-Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên

Các chủng vi khuẩn đã được phân lập từ bệnh nhân thuộc khoa Vi sinh-Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên.

Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Tại phòng nuôi cấy vi khuẩn và kháng sinh đồ, khoa Vi sinh bệnh viện Trung ương Thái Nguyên

Dụng cụ, hóa chất và thiết bị sử dụng

Dụng cụ: Đĩa peptri, kính hiển vi, lam kính, phiến kính, đèn cồn, ống nghiệm, que cấy, tăm bông vô trùng, ăng cấy,

Thiết bị: Tủ ấm, tủ sấy, cân phân tích, máy hấp vô trùng, máy cấy máu, tủ lạnh, tủ cấy vô trùng

-Thuốc nhuộm Gram: thuốc tím getian, dung dịch lugol, cồn tẩy 90◦, dung dịch fuchsin

-Nước muối sinh lý đã được khử trùng

-Thuốc thử phản ứng VP

-Thuốc thử tính chất vật lý hóa học

-Nước oxy già, các hóa chất để pha môi trường

-Môi trường nuôi cấy: Thạch máu, Uri, Mác,

-Môi trường kháng sinh đồ: MH

-Các khoanh giấy kháng sinh.

Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Thu thập và xử lý mẫu bệnh phẩm của các bệnh nhân tại Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên

Nội dụng 2: Phân lập và định danh các chủng vi khuẩn Escherichia coli, Klebsiella spp., Proteus spp

Nội dung 3: Khảo sát tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn Escherichia coli, Klebsiella spp., Proteus spp

Nội dung 4: Khảo sát tình hình vi khuẩn Escherichia coli, Klebsiella spp., Proteus spp sinh ESBL.

Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu

-Kỹ thuật nuôi cấy phân lập

-Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán Kirby-Bauer

-Diễn giải kết quả kháng sinh đồ theo hướng dẫn tài liệu CLSI năm 2018 để xác định mức độ nhạy cảm (S), trung gian (I) hoặc đề kháng (R).

Xử lý số liệu

-Thu thập số liệu, hồi cứu phiếu kết quả cấy vi sinh định danh vi khuẩn và -phiếu kết quả kháng sinh đồ

-Xử lý số liệu bằng phần mềm SPSS.

Phương pháp nghiên cứu

3.7.1 Phương pháp 1: Thu mẫu bệnh phẩm(theo sổ tay hướng dẫn lấy mẫu của khoa gửi tới các khoa cận lâm sàng)

Tùy vào vị trí tổn thương, cũng như là từng loại mẫu bệnh phẩm mà ta có các kỹ thuật lấy mẫu bệnh phẩm khác nhau[14]:

Bệnh phẩm mủ được lấy bằng cách sử dụng tăm bông vô trùng tại vị trí tiếp giáp giữa tổ chức vết thương và tổ chức lành, hoặc có thể thu thập mủ bằng bơm tiêm vô trùng sau khi tiến hành phẫu thuật.

Để lấy bệnh phẩm dịch tỵ hầu, bệnh nhân cần ngồi đúng tư thế Sử dụng tăm bông vô trùng, đưa vào mũi bệnh nhân đến vùng tỵ hầu, sau đó xoay nhẹ và lấy ra.

Bệnh phẩm nước tiểu: Phải lấy bằng ống tăm bông vô khuẩn, đảm bảo thể tích

Bệnh phẩm đờm: Dùng ống hút dịch khí quản hút dịch phế quản vào tăm bông vô trùng

Bệnh phẩm máu bao gồm các chai cấy máu chứa môi trường dinh dưỡng và chất hấp phụ kháng sinh, cho phép vi khuẩn trong máu kháng kháng sinh vẫn phát triển Đối với trẻ em, cần lấy từ 3-5 ml máu và bơm vào chai dành riêng cho trẻ, trong khi người lớn cần lấy từ 5-10 ml máu vào chai dành cho người lớn Lưu ý rằng mọi thao tác lấy máu phải tuân thủ nghiêm ngặt quy trình hướng dẫn để tránh nguy cơ nhiễm khuẩn.

3.7.2 Phương pháp 2: Phân lập và định danh

Sẽ được tiến hành theo 2 bước:

-Bước 1: Nhuộm soi, soi tươi sơ bộ mẫu bệnh phẩm

-Bước 2: Nuôi cấy và định danh

Nhuộm soi, soi tươi sơ bộ mẫu bệnh phẩm[15]:

Quan sát vi khuẩn bằng kính hiển vi cho phép người thực hiện thấy hình dạng và khả năng bắt màu của chúng Việc soi tươi tiêu bản giúp phát hiện khả năng di chuyển và sự có mặt của nấm Nhuộm tiêu bản cho phép xác định hình thái, kích thước và cách sắp xếp của vi khuẩn Kết quả từ các quan sát này sẽ định hướng cho việc nuôi cấy vi khuẩn hiệu quả.

Để tiến hành soi tươi, nhỏ 1-2 giọt NaCl 0.9% vô khuẩn lên lam kính Sử dụng que cấy hoặc tăm bông vô trùng để hòa đều với giọt NaCl 0.9% Đặt phiến kính nhẹ nhàng lên giọt canh khuẩn để tránh tạo bọt khí, sau đó quan sát dưới vật kính X10 hoặc X40.

Nhuộm soi: Sử dụng kỹ thuật nhuộm Gram

Để làm tiêu bản, sử dụng que cấy để lấy mẫu bệnh và phết dàn mỏng lên phiến kính theo hình xoắn ốc với đường kính 1cm Sau đó, để tự khô hoặc cho vào tủ ấm, tiếp theo tiến hành cố định mẫu trên ngọn lửa đèn cồn.

-Nhỏ dung dịch thuốc tím Gentian lên tiêu bản, chờ trong 1 phút, rửa vòi nước đang chảy

Nhỏ dung dịch Lugol lên tiêu bản và đợi 30 giây trước khi rửa dưới vòi nước chảy Sau đó, nhỏ cồn tuyệt đối lên phiến kính, và khi màu tím vừa phai hết, hãy rửa ngay bằng nước.

-Nhỏ dung dịch Fucsin lên tiêu bản, đợi 1 phút rửa vòi nước đang chảy

- Đợi tiêu bản khô, soi dưới vật kính dầu X100 Đọc kết quả: Vi khuẩn có bắt màu tím là Gram dương

Vi khuẩn bắt màu đỏ là Gram âm

Nuôi cấy và định danh:

Bệnh phẩm sau khi được lấy về, tùy theo từng loại bệnh phẩm mà ta tiến hành nuôi cấy trên môi trường thích hợp

Bảng 3.1.Môi trường nuôi cấy cho từng loại bệnh phẩm

Bệnh phẩm Mủ Đờm Phân Dịch tỵ hầu Máu Nước tiểu

Tiến hành nuôi cấy vi khuẩn trên các mẫu bệnh phẩm: Đối với bệnh phẩm là mủ, đờm, dịch tỵ hầu, phân:

18-24h Đối với bệnh phẩm nước tiểu:

18-24h Đánh dấu thông tin mặt sau hộp thạch và mẫu bệnh phẩm sao cho trùng khớp nhau

Khử trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn, ngón cái và ngón giữa tay trái mở nắp đĩa môi trường

Nhúng que cấy vào bệnh phẩm và thực hiện cấy ria trên bề mặt môi trường theo kỹ thuật cấy 3 vùng Sau đó, đóng nắp đĩa petri và nuôi trong tủ CO2 ở 37◦C (DTH), trong khi các bệnh phẩm khác được nuôi ở 36◦C Cuối cùng, đọc kết quả và đánh dấu thông tin ở mặt sau hộp thạch để đảm bảo khớp với mẫu bệnh phẩm.

Sử dụng ăng cấy 1àl, nhỳng vào bệnh phẩm, cấy ria trờn bề mặt môi trường theo kĩ thuật cấy 3 vùng

Nuôi trong tủ ấm 36◦C Đọc kết quả

Sau khi vi khuẩn mọc khuẩn lạc, chúng sẽ được định danh thông qua các phương pháp xác định dựa vào tính chất hóa học của chúng Hiện nay, các bộ xác định đồng thời tính chất sinh vật hóa học như API 20E và 20NE đã được phát triển, giúp xác định 20 tính chất của vi khuẩn API 20E được áp dụng cho vi khuẩn họ đường ruột và trực khuẩn Gram âm, trong khi 20NE được sử dụng cho trực khuẩn Gram dương.

Phương pháp thông thường là sẽ dựa vào một số tính chất như sau để xác định vi khuẩn

Môi trường KIA (Kligler Iron Agar) là một môi trường tổng hợp chứa hai loại đường glucose và lactose với tỉ lệ 1/10, cùng với chất chỉ thị pH phenol đỏ Khi nuôi cấy vi khuẩn ở nhiệt độ 37◦C trong 24 giờ, nếu phần chân ống thạch chuyển từ màu đỏ sang màu vàng, điều này cho thấy vi khuẩn có khả năng lên men đường glucose mà không lên men đường lactose Ngược lại, nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường lactose, toàn bộ môi trường sẽ chuyển sang màu vàng.

Môi trường Manitol là một loại môi trường nuôi cấy vi khuẩn chứa manit, được ủ ở nhiệt độ 37°C trong 24 giờ Nếu vi khuẩn có khả năng sử dụng manit, môi trường sẽ chuyển từ màu đỏ đậm sang màu vàng Môi trường này có dạng thạch màu đỏ đậm, và khi cấy, cần sử dụng que cấy thẳng để chọc vào giữa ống.

Các tính chất khác trong quá trình lên men đường:

Phản ứng Methyl Red (MR) cho thấy một số loài vi khuẩn, đặc biệt là các vi khuẩn đường ruột, có khả năng lên men glucose để sản sinh ra các axit như lactic và acetic Những vi khuẩn này tạo ra đủ lượng axit để duy trì pH môi trường nuôi cấy ở mức ≤ 4,4.

Sử dụng các môi trường lỏng như Clack-lubs để nuôi cấy[16]

Để tiến hành thí nghiệm, sử dụng que cấy để lấy khuẩn lạc vi khuẩn và cấy vào môi trường thích hợp Sau đó, ủ trong tủ ấm trong khoảng 24-48 giờ Cuối cùng, nhỏ 2-3 giọt MR để phát hiện sự hiện diện của vi khuẩn.

Phản ứng dương tính: môi trường chuyển sang màu đỏ (pH=4,4)

Phản ứng âm tính: môi trường chuyển sang màu vàng (pH=6)

Phản ứng Indol được thực hiện bằng cách lấy khuẩn lạc và cấy vào môi trường nước pepton Sau đó, ủ trong tủ ấm trong 24 giờ Tiếp theo, nhỏ từ 0,2 ml đến 0,3 ml dung dịch thuốc thử Kovac’s vào môi trường và lắc nhẹ Cuối cùng, đọc kết quả để xác định phản ứng.

Phản ứng dương tính (sinh indol): xuất hiện vòng màu đỏ phía trên môi trường Phản ứng âm tính (không sinh indol): không xuất hiện vòng màu đỏ

Phản ứng Voges-Proskauer (VP) là một phương pháp xác định khả năng của một số vi khuẩn trong việc sản xuất acetone trong quá trình lên men đường Quá trình này có thể được phát hiện thông qua sự chuyển đổi acetone thành diacetone, tạo ra phức chất màu đỏ nhờ sự xúc tác của anpha-napthol và creatin Để kiểm tra khả năng này, vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường Clack-lubs.

Cách tiến hành: Dùng que cấy lấy khuẩn lạc cấy vào môi trường Ủ trong tủ ấm, sau 24-48h thì nhỏ dung dịch thử VP Đọc kết quả:

Phản ứng dương tính: môi trường chuyển từ màu vàng nhạt sang màu đỏ Phản ứng âm tính: môi trường có màu vàng nhạt

QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ