ĐỐI TƯỢNG & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
NGUYÊN LIỆU
2.1.1 Nọc Bò cạp đen An Giang ( Heterometrus laoticus )
- PĐ 5 phân lập từ nọc Bò cạp đen An Giang Heterometrus laoticus
- Các PĐTC 5.5.1, 5.21.1, 5.22.3 (thu được từ PĐ 5)
Các mẫu được cung cấp bởi TSKH Hoàng Ngọc Anh, chuyên gia đến từ Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, tại Thành phố Hồ Chí Minh.
Chuột nhắt trắng đực trưởng thành, thuộc giống Swiss albino, khỏe mạnh và không dị tật, có trọng lượng khoảng 20 ± 02 g/con, được cung cấp bởi Viện Vắc xin và sinh phẩm y tế Nha Trang Sau khi mua về, chuột sẽ được nuôi ổn định trong phòng thí nghiệm của Bộ môn Dược lý, Khoa Dược, Đại học Nguyễn Tất Thành, Thành phố Hồ Chí Minh, với chế độ ăn uống đầy đủ trong ít nhất 2 ngày trước khi tiến hành các thử nghiệm.
(TLD204E, hãng Mettler – Toledo, Thụy Sĩ)
NaCl 0,9% (công ty Cổ phần thương mại thiết bị y tế Vĩnh Phúc)
Các hóa chất thường quy khác do bộ môn Dược lý, khoa Dược, Đại học Nguyễn Tất Thành cung cấp.
PHƯƠNG PHÁP
Các chất khảo sát được hòa tan trong dung dịch NaCl 0,9% và tiêm vào tĩnh mạch đuôi chuột để nghiên cứu tác động của PĐ5 và các PĐTC lên quá trình đông và chảy máu, với thể tích tiêm là 0,1 ml cho mỗi 10g trọng lượng chuột.
Chuột tham gia thử nghiệm được phân thành các lô (6 chuột/ lô):
- Lô chứng: chuột được tiêm tĩnh mạch đuôi dung dịch NaCl 0,9%
- Lô thử: chuột được tiêm tĩnh mạch đuôi các PĐ 5 và các PĐTC 5.5.1, 5.21.1, 5.22.3 ở liều 2,48 mg/kg (1/5 của LD50, LD50 = 12,4 mg/kg)
Thời gian chảy máu được thực hiện theo mô hình chuẩn hóa của Yang Liu và các đồng sự Để tiến hành, giữ phần da đầu và da lưng của chuột, thả lỏng đuôi và tránh tác động vào đuôi Cắt một đoạn đuôi dài khoảng 5mm từ chóp đuôi với đường kính vết cắt khoảng 1,5mm Phần đuôi còn lại được ngâm trong dung dịch NaCl 0,9% ở nhiệt độ 37°C Thời gian chảy máu được tính từ lúc bắt đầu chảy cho đến khi ngừng chảy, với các thao tác được thực hiện tại các thời điểm 20.
30, 60, 90, 120 phút kể từ sau khi tiêm thuốc
Thời gian đông máu được xác định bằng cách cắt đuôi chuột và lấy một giọt máu có đường kính khoảng 6-7 mm từ vết cắt, sau đó đặt giọt máu lên lam kính trong đĩa petri có nắp đậy để tránh tác động từ môi trường Sau đó, đuôi chuột được nhúng vào dung dịch NaCl 0,9% Quá trình theo dõi thời gian đông máu bắt đầu từ lúc lấy giọt máu cho đến khi nó đông hoàn toàn, với các thời điểm kiểm tra là 20, 30, 60, 90 và 120 phút sau khi tiêm thuốc.
PHÂN TÍCH THỐNG KÊ KẾT QUẢ
Các số liệu được trình bày dưới dạng Số trung bình (Mean) ± SEM (Sai số chuẩn của số trung bình) Để xác định sự khác biệt giữa các lô, sử dụng phép kiểm Mann-Whitney với phần mềm thống kê Minitab 16.0 Sự khác biệt được coi là có ý nghĩa thống kê khi giá trị p < 0,05 Đồ thị được tạo ra bằng phần mềm SigmaPlot 11.0.
KẾT QUẢ & BÀN LUẬN
KẾT QUẢ
3.1.1 Tác động của chất khảo sát lên quá trình đông máu
Kết quả khảo sát tác động của PĐ 5 và các PĐTC 5.5.1, 5.21.1 và 5.22.3 lên thời gian đông máu so với lô chứng (NaCl 0,9%) đã được thể hiện ở Bảng 3.1
Bảng 3.1 Thời gian đông máu dưới tác động của các chất khảo sát của PĐ 5 và các
PĐTC 5.5.1, 5.21.1, 5.22.3 ở liều 2,48mg/kg so với lô chứng (NaCl 0,9%)
Thời gian đông máu (giây)
Sau 20 phút Sau 30 phút Sau 60 phút Sau 90 phút Sau 120 phút PĐ5 422.3± 48.4* 391.7± 48.1* 387.5± 35.0 360.2± 56.5 358.8± 26.6*
Hình 3.1 Thời gian đông máu dưới tác động của PĐ 5 và các PĐTC 5.5.1, 5.21.1, 5.22.3 ở liều 2,48mg/kg
Các PĐ 5 và các PĐTC 5.5.1, 5.21.1 và 5.22.3 đều cho thấy tác động kéo dài thời gian đông máu trong suốt quá trình thử nghiệm Thời gian đông máu được xác định tại các thời điểm 20, 30, 60, 90 và 120 phút sau khi tiêm tĩnh mạch đuôi chuột.
PĐ 5 sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) được quan sát thấy ở các thời điểm
20, 30 và 120 phút sau khi tiêm Riêng thời điểm 60 và 90 phút, sự khác biệt không mang ý nghĩa thống kê (p > 0,05)
Trong 30 phút đầu kể từ sau khi tiêm thuốc, ngoại trừ PĐTC 5.21.1, các PĐTC khác đều cho thời gian đông máu dài hơn hẳn so với nhóm chứng và sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê PĐTC 5.21.1 tuy kéo dài thời gian đông máu đáng kể so với nhóm chứng nhưng lại không mang ý nghĩa thống kê
Sau 60 phút thì chỉ còn 2 PĐCT là 5.5.1 và 5.22.3 cho sự khác biệt có ý nghĩa thống kê PĐTC 5.21.1 dù có kéo dài thời gian đông máu nhưng lại không có ý nghĩa thống kê
Sau 90 phút, các PĐTC đều kéo dài thời gian đông máu đáng kể so với nhóm chứng Tuy nhiên, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê chỉ được thể hiện ở PĐTC 5.22.3, các PĐTC còn lại thì không có ý nghĩa thống kê
Sau 120 phút, có sự khác biệt rõ rệt so với các thời điểm trước Các PĐTC vẫn kéo dài thời gian đông máu, nhưng kết quả từ 5.21.1 cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê, trong khi 5.5.1 và 5.22.3 không cho thấy sự khác biệt đáng kể và không mang ý nghĩa thống kê.
Như vậy, cả PĐ 5 và 3 PĐTC 5.5.1, 5.21.1, 5.22.3 ở liều 2,48 mg/kg đều tăng thời gian đông máu so với lô chứng Trong đó, PĐTC 5.21.1 cho tác động chậm nhất
3.1.2 Tác động của chất khảo sát lên quá trình chảy máu
Kết quả khảo sát tác động của PĐ 5 và các PĐTC 5.5.1, 5.22.3 và 5.21.1 lên thời gian chảy máu so với lô chứng (NaCl 0,9%) đã được thể hiện ở Bảng 3.2
Bảng 3.2 Thời gian chảy máu dưới tác động của các chất khảo sát của PĐ 5 và các
PĐTC 5.5.1, 5.21.1, 5.22.3 ở liều 2,48mg/kg so với lô chứng (NaCl 0,9%)
Thời gian chảy máu (giây)
Sau 20 phút Sau 30 phút Sau 60 phút Sau 90 phút Sau 120 phút
Thời gian chảy máu được ghi nhận dưới tác động của PĐ 5 và các PĐTC 5.5.1, 5.21.1, 5.22.3 ở liều 2,48mg/kg cho thấy sự kéo dài đáng kể trong suốt quá trình thử nghiệm Các thời điểm kiểm tra thời gian chảy máu được thực hiện lần lượt sau 20, 30, 60, 90 và 120 phút sau khi tiêm tĩnh mạch chuột các chất khảo sát.
PĐ 5 sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) được quan sát thấy ở các thời điểm
20, 30 và 90 phút sau khi tiêm Riêng thời điểm 60 và 120 phút, sự khác biệt không mang ý nghĩa thống kê (p > 0,05)
Sau 20 phút kể từ khi tiêm thuốc, cả 3 PĐTC đều kéo dài thời gian chảy máu so với nhóm chứng từ 3-5 lần và tất cả sự khác biệt có ý nghĩa thống kê
Sau 30 phút, các PĐTC 5.5.1 và 5.22.3 đều kéo dài thời gian chảy máu đáng kể so với nhóm chứng và các khác biệt đều có ý nghĩa thống kê Đáng chú ý, PĐTC 5.5.1 có thời gian chảy máu gấp khoảng 7,2 lần so với nhóm chứng và sự chênh lệch này là cao nhất so với các thời điểm khảo sát khác của PĐTC này và các PĐTC khác trong suốt quá trình thử nghiệm Ở PĐTC 2.21.1, thời gian chảy máu mặc dù có kéo dài nhưng lại không có ý nghĩa thống kê
Sau 60 phút, mặc dù các PĐTC đều kéo dài thời gian chảy máu so với nhóm chứng nhưng chỉ có 5.5.1 và 5.22.3 có ý nghĩa thống kê, 5.21.1 có sự khác biệt so với nhóm chứng không lớn (1,8 – 1,9 lần, trong khi 5.5.1 và 5.22.3 tương ứng là 3,2 và 4,8 lần) và cũng không có ý nghĩa thống kê
Sau 90 phút, cả 3 PĐTC 5.5.1, 5.22.3 và 5.21.1 dù có kéo dài thời gian chảy máu so với nhóm chứng nhưng không mang ý nghĩa thống kê
Sau 120 phút, hầu hết các PĐTC đều kéo dài thời gian chảy máu so với nhóm chứng, ngoại trừ PĐTC 5.5.1 có thời gian chảy máu ngắn hơn Tuy nhiên, sự khác biệt giữa ba PĐTC được khảo sát không đạt ý nghĩa thống kê.
Như vậy, cả PĐ 5 và 3 PĐTC 5.5.1, 5.21.1, 5.22.3 ở liều 2,48 mg/kg đều tăng thời gian chảy máu so với lô chứng Trong đó, PĐTC 5.21.1 cho tác động yếu nhất.
BÀN LUẬN
Theo các nghiên cứu trước đây, nọc thô bò cạp Heterometrus laoticus được tách ra 5
PĐ (cột Saphadex G-50 1,5 x 100cm) Trong đó, PĐ 5 làm tăng thời gian đông máu lên 10 lần so với mẫu đối chứng qua xét nghiệm APTT [2]
Trong thử nghiệm in vivo, PĐ 5 đã cho thấy ảnh hưởng rõ rệt đến thời gian đông và chảy máu, với thời gian đông máu kéo dài gấp 1,1 – 1,4 lần và thời gian chảy máu gấp 2,9 – 4,9 lần so với nhóm chứng trong suốt 120 phút Kết quả này củng cố thêm bằng chứng về tác dụng chống đông máu của PĐ 5.
5 nọc bò cạp Heterometrus laoticus
Từ loài Heterometrus laoticus, 24 peptide có hoạt tính sinh học đã được tách ra thông qua phương pháp sắc ký pha đảo Trong số đó, ba peptide sạch 5.5.1, 5.21.1 và 5.22.3 đã thể hiện khả năng kéo dài thời gian đông và chảy máu trong suốt quá trình thử nghiệm.
Tác động lên quá trình đông máu của các PĐTC
Kết quả khảo sát cho thấy tác động kéo dài thời gian đông máu của các PĐTC khảo sát không cao, chỉ từ 1,3 – 1,8 lần so với nhóm chứng
PĐTC 5.21.1 và 5.22.3 cho thấy tác động nhanh và kéo dài, với hiệu quả bắt đầu từ phút thứ 20 sau tiêm Cụ thể, PĐTC 5.5.1 duy trì tác động suốt 60 phút, trong khi PĐTC 5.22.3 kéo dài đến 90 phút Đặc biệt, sau 20 phút tiêm, PĐTC 5.22.3 ghi nhận thời gian đông máu kéo dài gấp 1,8 lần so với nhóm chứng.
PĐTC 5.21.1 có tác động yếu và chậm hơn, với hiệu quả bắt đầu sau 120 phút từ khi tiêm Thời gian đông máu kéo dài chỉ 1,4 lần so với nhóm chứng.
Tác động lên quá trình chảy máu của các PĐTC
Kết quả khảo sát cho thấy rằng các PĐTC khảo sát có tác động rõ rệt đến thời gian chảy máu, với mức độ tăng từ 2,9 đến 7,2 lần so với nhóm chứng Trong số các PĐTC, PĐTC 5.5.1 và 5.22.3 thể hiện tác động mạnh nhất, trong khi PĐTC 5.21.1 có tác động yếu nhất.
Cả 2 PĐTC 5.5.1 và 5.22.3 đều thể hiện tác động kéo dài thời gian chảy máu trong suốt 1 giờ đầu thử nghiệm Đáng chú ý, tại thời điểm 30 phút sau tiêm thuốc, PĐTC 5.5.1 có thời gian chảy máu dài gấp 7,2 lần nhóm chứng
Ngược lại, PĐTC 5.21.1 thể hiện tác động yếu nhất và ngắn nhất trong số các PĐTC được khảo sát PĐTC này chỉ cho tác động trong 20 phút đầu.
