Nội dung bản trích yếu Bệnh Parkinson là bệnh thoái hóa thần kinh tiến triển thường gặp ở những người trên 65 tuổi, với tỷ lệ mắc bệnh ở Việt Nam khoảng 1,6%. Phương pháp điều trị đầu tay là sử dụng các thuốc tiền chuyển hóa của dopamin như levodopa. Tuy nhiên điều trị nội khoa bằng thuốc thường người bệnh chỉ đáp ứng tốt trong 5 – 10 năm đầu do gặp phải hiện tượng kháng thuốc điều trị. Vì vậy, đây là nghiên cứu nhằm tiếp cận hướng điều trị mới đó là sử dụng tế bào gốc có khả năng biệt hóa thành nơron tiết dopamin để thay thế các nơron bị thoái hóa. Nghiên cứu được tiến hành trên đối tượng là 776 phôi chuột cống trắng từ 10,5 đến 14,5 ngày tuổi và 201 phôi – thai người từ 6 đến 8 tuần tuổi với chất liệu nghiên cứu là mẫu tế bào gốc ngoại bì thần kinh của các phôi đó nhằm hướng đến hai mục tiêu chính là (1) Phân lập, tăng sinh, biệt hóa và bảo quản lạnh tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi chuột cống trắng thành tế bào dạng tiết dopamin; (2) Phân lập, tăng sinh và biệt hóa tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi người thành tế bào dạng tiết dopamin. Thiết kế nghiên cứu thực hiện qua hai giai đoạn, giai đoạn 1 thực nghiệm trên phôi chuột cống trắng và giai đoạn 2 thực nghiệm trên phôi người. Mô hình nghiên cứu được thiết kế gồm các bước: thu thập phôi, phân lập mẫu mô sàn não giữa, tạo dịch treo tế bào gốc. Sau khi tạo được dịch treo tế bào, một phần được nuôi cấy tăng sinh tạo nơron tiết dopamin. Sử dụng môi trường nuôi cấy tế bào gốc thần kinh (M-NECS): môi trường nuôi cấy cơ bản DMEM/F12 tỷ lệ 1:1 có bổ sung thêm các yếu tố: Fetal Bovine Serum (FBS) 10%; Epithelial Grow Factor (EGF) 20ng/ml và basic Fibroblast Grow Factor – 2 (bFGF-2) (20ng/ml), (invitrogen, Mỹ); Penicillin - Streptomycin (100IU/ml) (Thermo Scientific, Mỹ); Amphotericine B (0,25µg/ml); Progesterone (20nM), Putrescine (62nM), muối Selenit (30nM), (Sigma, Mỹ); Insulin – Transferine – Selenium (25ng/ml) (Gibco, Mỹ). Các tế bào sau nuôi cấy được thu hoạch và định danh bằng các phương pháp mô học như nhuộm Hematoxyline – Eosine, nhuộm Giemsa để đánh giá hình thái tế bào, nhuộm Cajal II để đánh giá sự hiện diện của các xơ thần kinh trong tế bào, nhuộm Hóa mô miễn dịch với marker đặc hiệu cho nơron tiết dopamin là Vimentin và Tyroxin Hydroxylase (TH), đếm mật độ tế bào bắt màu với marker TH để xác định tỷ lệ nơron tiết dopamin trong mẫu tế bào thu hoạch được. Một phần khác sẽ được bảo quản lạnh trong môi trường cơ bản DMEM có bổ sung 10% Dimethyl Sulfoxide (DMSO) sau đó đánh giá tỷ lệ sống của tế bào sau rã đông cũng như khả năng nuôi cấy của tế bào sau bảo quản lạnh. Sau quá trình nghiên cứu, chúng tôi thu được một số kết quả sau: Đối với mục tiêu (1), các kết quả nghiên cứu cho thấy khả năng phân lập và nuôi cấy mẫu tế bào gốc thần kinh phôi chuột tốt nhất ở tuổi phôi 12,5 đến 13,5 ngày tuổi. Tỷ lệ phân lập thành công 100% ở nhóm tuổi phôi này với số lượng tế bào thu được khoảng 1,34 ± 0,048 x 105 tế bào/ml. Các tế bào sau nuôi cấy có đặc điểm của tế bào của mô thần kinh với nhiều tế bào hình sao với các nhánh bào tương tỏa ra xung quanh liên hệ với các tế bào gần kề. Nhuộm Cajal II thấy hình ảnh các xơ thần kinh trong tế bào bắt màu nâu vàng rõ. Sử dụng marker TH để đánh dấu nơron tiết dopamin, quan sát thấy nhiều tế bào dương tính với TH trong mẫu nuôi cấy. Tỷ lệ nơron dương tính với TH khoảng 5,38 ± 3,56%. Bảo quản lạnh các tế bào gốc thần kinh phôi sau phân lập trong môi trường cho tỷ lệ sống 64,9%. Đối với mục tiêu (2), việc phân lập, tăng sinh và biệt hóa tế bào gốc thần kinh phôi – thai người để tạo nơron tiết dopamin có thể thực hiện được bằng nguồn phôi được lấy từ kỹ thuật giảm thiểu thai trong điều trị hỗ trợ sinh sản. Tuổi phôi thích hợp cho phân lập và nuôi cấy từ 6,5 đến 7,5 tuần tuổi. Các tế bào sau nuôi cấy cũng là các tế bào của mô thần kinh và dương tính với marker TH – thể hiện sự tồn tại của nơron tiết dopamin trong mẫu thu hoạch được. Đây là một đề tài nghiên cứu rất mới. Tuy có được thành công bước đầu đã nuôi tạo được các nơron tiết dopamin nhưng vẫn còn vài khó khăn đặc biệt trong việc nghiên cứu trên phôi người. Như việc khó khăn trong phân lập các phôi sau giảm thiểu do đặc điểm không toàn vẹn của phôi. Vì vậy cần thêm những nghiên cứu trong tương lai để hoàn thiện quy trình nuôi cấy, tăng tỷ lệ tế bào tiết dopamin sau nuôi cấy cũng như tăng tỷ lệ tế bào sống sau bảo quản lạnh tế bào gốc ngoại bì thần kinh để có thể sẵn sàng nguồn tế bào tiến tới ứng dụng thử nghiệm trên động vật và xa hơn là điều trị trên lâm sàng.
TỔNG QUAN
Đặc điểm tế bào gốc thần kinh
Tế bào gốc thần kinh được Atlman và cộng sự mô tả lần đầu tiên năm
Kể từ năm 1962, nhiều nguồn gốc tế bào đã được nghiên cứu để tạo ra nơron tiết dopamin, bao gồm tế bào gốc trung mô từ tủy xương và tế bào vùng hành khứu ở vỏ não Tuy nhiên, những dòng tế bào này gặp nhiều hạn chế trong việc sản xuất nơron tiết dopamin trong thực nghiệm Hiện nay, các nhà khoa học đang chú trọng vào những dòng tế bào có tiềm năng cao hơn, như tế bào gốc não giữa phôi, tế bào gốc phôi giai đoạn sớm và tế bào gốc vạn năng cảm ứng (iPSCs).
Hình 1.1 Các nguồn tế bào khác nhau trong điều trị bệnh Parkinson [6]
Tất cả các loại tế bào gốc thần kinh đều có giá trị trong nghiên cứu y học, nhưng mỗi dòng tế bào lại có những tiềm năng và giới hạn riêng Tế bào gốc thần kinh ở phôi và thai nhi đóng vai trò thiết yếu trong việc hình thành các cấu trúc thần kinh, trong khi tế bào gốc thần kinh ở cơ thể trưởng thành chủ yếu thực hiện chức năng tái tạo và sửa chữa mô, tạo ra các tế bào thay thế cho những tế bào bị thiếu hụt do sinh lý hoặc bệnh lý trong các mô biệt hóa.
Khi nghiên cứu tế bào gốc, cần phân biệt rõ ba khái niệm quan trọng: "tế bào gốc" (Stem cell), "tế bào đầu dòng" (progenitor cell) và các loại tế bào khác liên quan Tế bào gốc có khả năng tự tái tạo và phát triển thành nhiều loại tế bào chuyên biệt, trong khi tế bào đầu dòng là những tế bào có khả năng phát triển thành một số loại tế bào nhất định, nhưng không có khả năng tự tái tạo vô hạn Việc hiểu rõ sự khác biệt này là rất quan trọng trong nghiên cứu và ứng dụng tế bào gốc.
Tế bào tiền thân (precursor cell) trong mô thần kinh là những tế bào có khả năng tự đổi mới, biệt hóa thành ba dòng tế bào thần kinh (nơron, tế bào ít nhánh và tế bào sao) và tái tạo mô thần kinh Khi khả năng tự đổi mới bị hạn chế và tế bào đã cam kết vào một số phận biệt hóa cụ thể, chúng trở thành các tế bào đầu dòng (progenitor cell) Thuật ngữ "tiền thân" chỉ những tế bào ở giai đoạn trung gian trong quá trình phát triển.
Tế bào gốc thần kinh là những tế bào chưa biệt hóa
Tế bào gốc có đặc điểm nổi bật là không mang cấu trúc đặc hiệu mô, cho phép chúng thực hiện nhiều chức năng khác nhau Cụ thể, tế bào gốc thần kinh là những tế bào chưa phát triển các cấu trúc cần thiết để dẫn truyền xung động thần kinh, như hệ thống ống siêu vi và các synap.
Tế bào gốc thần kinh có thể tự tái tạo
Tế bào gốc thần kinh, giống như các loại tế bào gốc khác, có khả năng tự làm mới và tăng sinh thông qua quá trình phân chia đối xứng và bất đối xứng Phân chia đối xứng tạo ra hai tế bào gốc, giúp tăng cường quần thể tế bào gốc, trong khi phân chia bất đối xứng sản sinh một tế bào bắt đầu quá trình biệt hóa và một tế bào giữ nguyên tính gốc Quá trình này rất quan trọng để duy trì quần thể tế bào gốc thần kinh suốt đời sống của cá thể.
Tế bào gốc thần kinh có khả năng biệt hóa
Quá trình tế bào gốc chuyển thành các tế bào chức năng riêng biệt được gọi là biệt hóa, diễn ra khi tế bào gốc nhận tín hiệu từ môi trường bên trong và bên ngoài Tế bào gốc thần kinh có khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau, nhờ vào sự kích thích của môi trường nội và ngoại sinh Chúng thực hiện phân chia tế bào bất đối xứng, trong đó một tế bào biệt hóa trong khi tế bào còn lại giữ tính gốc Tế bào gốc thần kinh chủ yếu biệt hóa thành các nơron, tế bào hình sao và tế bào ít nhánh.
Quá trình hình thành và biệt hóa nơron tiết dopamin in vivo
Trong quá trình phát triển phôi, khi máng thần kinh khép lại, thành ống thần kinh hình thành từ một hàng tế bào biểu mô gọi là biểu mô thần kinh Não giữa phát triển đơn giản hơn so với các vùng khác, với sự dày lên của thành ống do sự tăng sinh mạnh của các tế bào biểu mô Ban đầu, thành ống có dạng biểu mô trụ giả tầng, với bào tương trải khắp và nhân tế bào ở các mức độ khác nhau Các nhân tế bào đang phân chia nằm ở lớp sâu, tạo thành lớp sinh sản, trong khi những tế bào đã hoàn thành phân chia di cư ra vùng ngoại vi và tiếp tục phân chia Sau khi não giữa hình thành, các tế bào ở sàn não giữa tăng sinh và phân lớp thành ba lớp: lớp nội tủy, lớp áo và lớp màn rìa Một số tế bào ở lớp nội tủy giữ tính gốc, trong khi phần lớn di chuyển ra ngoài, ngừng phân chia và bắt đầu quá trình biệt hóa nhờ các tín hiệu từ yếu tố phiên mã và yếu tố chế tiết.
Hình 1.2 Sự tăng sinh tế bào ở ống thần kinh [9]
A: Biểu mô thần kinh; B: Tăng sinh tế bào của biểu mô thần kinh I: Lớp nội tủy II: Lớp áo
1- Nguyên bào thần kinh; 2- Nguyên bào xốp thần kinh;
3- Nhánh bào tương của tế bào xuyên tâm
Các tế bào đầu dòng tiết dopamin ở não giữa chủ yếu tập trung tại vùng sinh sản, với sự biểu hiện của các gen Lmx1a, Lmx1b, Foxa2, Msx1/2, Ngn2 và Shh trong giai đoạn sớm Trong giai đoạn này, các tế bào đầu dòng mDA sẽ phát triển chuyên biệt, phân chia và tiến hành những bước cuối cùng của quá trình biệt hóa trong kỳ sau của tế bào.
Các tế bào đầu dòng tiết dopamin chuyển hóa thành các tế bào dopamin chưa trưởng thành (immature dopaminergic neurons) từ khoảng E10.5 đến E13.5 ở chuột, và từ tuần thứ 5 – 6 sau thụ thai ở người, đạt đỉnh vào tuần 6 – 8 và dừng lại ở tuần 10 – 11 Các nguyên bào thần kinh của nơron dopamin rời khỏi vùng sinh sản, di chuyển qua các nhánh tế bào thần kinh xuyên tâm để xâm nhập vào vùng trung gian Trong quá trình di cư từ lớp nội tủy ra bề mặt não, các nguyên bào thần kinh này tiếp tục biệt hóa thành các tế bào mDA trưởng thành, đồng thời duy trì biểu hiện các gen quan trọng như Foxa1/2, Lmx1a/b, En1/2.
Hình 1.3 Các lớp của lá đáy não giữa và sự biểu hiện các gen liên quan đến sự phát triển của tế bào mDA
Lá đáy não giữa bao gồm ba lớp chính: lớp sinh sản chứa các tế bào đầu dòng mDA, lớp trung gian nơi các tế bào mDA chưa trưởng thành di cư, và lớp áo nơi các tế bào mDA trưởng thành biểu hiện các gen liên quan đến sinh tổng hợp dopamine.
Quá trình hình thành và phát triển của tế bào tiết dopamin bắt đầu từ khoảng ngày thứ 8 ở chuột và tuần thứ 5 sau thụ tinh ở người Các tế bào này xuất hiện ban đầu ở vùng sàn não giữa, sau đó di cư đến các vị trí như liềm đen, vùng dưới đồi, hành khứu và võng mạc thông qua nhiều bước phát triển và biệt hóa Những hiểu biết về lĩnh vực này đã gia tăng đáng kể trong những năm gần đây, góp phần quan trọng vào việc tìm kiếm các dòng tế bào tối ưu cho điều trị bệnh Parkinson.
Tế bào gốc não giữa và nơron tiết dopamin: ứng dụng trong điều trị
Quá trình phát triển và biệt hóa của nơron tiết dopamin đã giúp các nhà khoa học xác định vị trí của các tế bào gốc tiết dopamin Mô não giữa ngoại bì ống thần kinh phôi là một trong những loại mô đầu tiên được nghiên cứu, vì nơi đây chứa các tế bào tiết dopamin và các tế bào đầu dòng có khả năng biệt hóa thành nơron tiết dopamin.
Năm 1979, tác giả Perlow và cộng sự đã tiến hành ghép những mảnh mô sàn não giữa phôi chuột vào thể vân chuột đã được gây Parkinson bằng 6-
Nghiên cứu OHDA cho thấy sự cải thiện triệu chứng lâm sàng ở chuột sau 1 tháng ghép, với 5/29 chuột giảm 70% số vòng quay so với nhóm chứng Tuy nhiên, kỹ thuật ghép mô chứa tế bào gốc vào não gặp nhiều hạn chế, bao gồm tỷ lệ sống sót thấp và sự cải thiện triệu chứng không đồng nhất Những vấn đề này có thể do sự kém nuôi dưỡng của tế bào trong mô ghép, thiếu tiếp xúc với mạch máu và dịch não tủy, cũng như hạn chế phát triển sợi trục Đến những năm 1980, nhóm tác giả Bjorklund đã thay đổi phương pháp, sử dụng dịch treo tế bào gốc từ mô sàn não giữa để tiêm vào thể vân, cho thấy kết quả khả quan với tỷ lệ khỏi bệnh cao ở chuột Parkinson.
Nghiên cứu cho thấy chuột sau khi ghép ổn định giữa các lô, với cấu trúc thể vân được quan sát bằng kỹ thuật hóa mô Các tác giả ghi nhận sự tồn tại của tế bào ghép ở 11/15 mẫu, cho thấy sự sống còn và khả năng liên kết với mô chủ Đặc biệt, có sự di cư của các nơron lên đến 0,5mm, thậm chí một số mẫu đạt tới 1mm từ vị trí tiêm.
Sự thành công của kỹ thuật tiêm tế bào gốc sàn não vào thể vân đã thúc đẩy các nhà khoa học tiến hành thử nghiệm trên bệnh nhân tình nguyện Năm 1988, tác giả Madrazo và cộng sự lần đầu tiên báo cáo hai trường hợp ghép thành công hỗn hợp tế bào gốc thần kinh giàu nơron tiết dopamin vào não bệnh nhân tình nguyện, dẫn đến cải thiện triệu chứng rối loạn vận động Tuy nhiên, những báo cáo về các ca bệnh trong giai đoạn đầu vẫn chưa rõ ràng do thiếu bằng chứng về tác dụng của các tế bào sau khi ghép lên não bệnh nhân.
Năm 1990, nhóm tác giả Lindvall và cộng sự đã công bố nghiên cứu lâm sàng về việc điều trị bệnh nhân bằng cách tiêm tế bào gốc phôi người.
Sau 2 tháng điều trị, các tác giả ghi nhận sự cải thiện về vận động và giấc ngủ Họ đã sử dụng kỹ thuật chụp Positron Emission Tomography (PET) với đồng vị phóng xạ 6-L-[18F] fluorodopa (FDOPA) để theo dõi hiệu quả điều trị FDOPA, có cấu trúc tương tự L-DOPA, có khả năng vượt qua hàng rào máu não và tiếp cận các nơron tiết dopamin, từ đó phản ánh số lượng và chức năng của các nơron này Kết quả sau 5 tháng cho thấy có sự tăng tín hiệu huỳnh quang trên phim chụp, chỉ ra sự gia tăng số lượng nơron tiết dopamin trong não sau khi ghép so với trước ghép.
Hình 1.4 Hình ảnh chụp PET với 6-L-[ 18 F] fluorodopa ở vùng nhân bèo nhạt và bèo sẫm
Mầu đỏ là vùng có tín hiệu mạnh Màu xanh là vùng không có tín hiệu [15]
Trong một thử nghiệm lâm sàng lớn với 34 bệnh nhân Parkinson, tác giả Olanow (1992) đã chia bệnh nhân thành hai nhóm: nhóm điều trị bằng tiêm tế bào gốc não giữa phôi người và nhóm không điều trị (giả dược) Nhóm điều trị được chia thành hai nhóm nhỏ: tiêm tế bào từ 1 phôi và từ 4 phôi Sử dụng thang điểm UDPRS để đánh giá triệu chứng trước và sau điều trị, sau 2 năm theo dõi, không có sự khác biệt về chỉ số UDPRS giữa hai nhóm điều trị và không điều trị (p=0,093 và 0,346) Tuy nhiên, trong nhóm bệnh nhân có chỉ số UDPRS trước điều trị ≤ 49 (Parkinson nhẹ), nhóm điều trị cho thấy sự cải thiện đáng kể so với nhóm giả dược (p = 0,005), đặc biệt là ở nhóm được tiêm 4 phôi.
Phân lập, nuôi cấy và bảo quản lạnh tế bào gốc sàn não giữa phôi
Nghiên cứu mô não của 5 bệnh nhân tử vong sau 5 năm điều trị cho thấy sự tăng biểu hiện marker TH ở nhóm tiêm 4 phôi so với nhóm tiêm 1 phôi và nhóm chứng Điều này cho thấy hiệu quả điều trị Parkinson bằng tế bào tiết dopamine phân lập từ sàn não giữa liên quan đến số lượng tế bào được tiêm Do nguồn mô phôi thai đồng loại có hạn, các nhà khoa học cần nuôi cấy tăng sinh các nơron tiết dopamine in vitro để tạo ra hỗn hợp tế bào giàu dopamine phục vụ cho điều trị.
1.4 Phân lập, nuôi cấy tế bào gốc sàn não giữa phôi
Phân lập tế bào gốc thần kinh thường trải qua ba bước chính: trích thủ mô, phân ly tế bào và làm thuần khiết tế bào Quá trình lấy mẫu mô, đặc biệt là từ não, rất phức tạp và yêu cầu người thực hiện phải có kỹ năng chuyên môn cao Các nhà nghiên cứu đã phát triển nhiều quy trình phân lập khác nhau tùy thuộc vào vị trí lấy mẫu và giai đoạn phát triển của động vật hoặc con người Tuy nhiên, tất cả các phương pháp này đều dựa trên những đặc tính riêng biệt của tế bào gốc thần kinh.
Nguồn gốc của mô ảnh hưởng đến loại tế bào phân lập, sự phát triển và khả năng biệt hóa của chúng Nhiều khác biệt rõ rệt đã được ghi nhận giữa các mẫu mô não từ các loài khác nhau như chuột nhắt, chuột cống và con người, cũng như từ các giai đoạn biệt hóa trong quá trình phát triển của một loài cụ thể.
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, vị trí trích xuất tế bào gốc thần kinh là yếu tố quan trọng nhất quyết định kết quả phân lập, không phụ thuộc vào các yếu tố khác.
Phân lập và nuôi cấy tế bào gốc từ não động vật thực nghiệm yêu cầu sự hiểu biết sâu sắc về vị trí của các ổ tế bào gốc thần kinh Việc sử dụng toàn bộ não hoặc mảnh mô não lớn có thể dẫn đến một quần thể không đồng nhất với nhiều loại tế bào khác nhau, do các tế bào gốc đến từ các vùng khác nhau Một số nghiên cứu đã chỉ ra sự hiện diện của tế bào gốc đa tiềm năng ở những vùng không điển hình của não trưởng thành, như thể vân Lois và Alvarez-Buylla cho rằng các tế bào này có thể xuất phát từ những vùng thần kinh lân cận Do đó, cần áp dụng kỹ thuật định vị chính xác để thu thập mẫu não từ các khu vực quan tâm trước khi tiến hành cắt lát mỏng bằng bộ vi thao tác dưới kính lúp.
Sau khi lấy mẫu mô não, việc bảo quản mẫu là rất quan trọng Quy trình phân lập cần được thực hiện trong vài giờ để đảm bảo số lượng tế bào gốc thần kinh sống không bị giảm theo thời gian.
Hiện nay, các nhà nghiên cứu chủ yếu áp dụng hai phương pháp tách tế bào, bao gồm tách tế bào bằng enzym và tách tế bào bằng cơ học Phương pháp tách tế bào bằng enzym sử dụng các enzym để phân hủy màng tế bào, giúp tách rời các tế bào một cách hiệu quả.
Các tế bào gốc thần kinh được bao quanh bởi lưới ngoại bào, chủ yếu gồm các phân tử như Lecticans, acid hyaluronic, tenascin-C và Tenascin-R Những phân tử này không chỉ tương tác lẫn nhau mà còn kết nối với các phân tử trên màng tế bào, tạo ra môi trường hỗ trợ cho sự phát triển và chức năng của tế bào.
Để tách tế bào gốc thần kinh khỏi mô, người ta sử dụng các protease nhằm làm suy yếu lưới ngoại bào Quá trình này bắt đầu bằng việc chia mô thành những mảnh nhỏ, giúp tăng diện tích tiếp xúc với protease Hai enzym chủ yếu được sử dụng trong quy trình này là trypsin và papain.
Trong nghiên cứu phân ly tế bào, trypsin là enzyme được sử dụng phổ biến nhất, thường kết hợp với acid ethylenediaminetetra acetic (EDTA) để làm suy yếu liên kết giữa các tế bào Thời gian ủ enzyme có thể thay đổi từ 10 đến 90 phút tùy theo từng tác giả Ngoài trypsin, một số enzyme khác như hyaluronidase, collagenase và dipase cũng được áp dụng, có thể sử dụng đơn độc hoặc kết hợp với nhau Đặc biệt, Desoxiribonulease I (DNase I) thường được thêm vào để loại bỏ DNA nhầy từ sự ly giải tế bào, vì chất này có thể ảnh hưởng đến khả năng sống của tế bào trong các thí nghiệm sau.
Để enzym hoạt động hiệu quả, cần sử dụng hệ đệm để điều chỉnh pH và kích hoạt enzym Kháng sinh và kháng nấm nên được thêm vào dung dịch phân ly tế bào nhằm ngăn ngừa nhiễm khuẩn và nhiễm nấm Sau khi tách tế bào, việc sử dụng chất ức chế protease là cần thiết để ngăn chặn phản ứng enzym, trong đó huyết thanh bào thai bò (FBS) thường được dùng cho papain, còn trypsin có thể kết hợp với ovomucoid, protein đậu nành hoặc chất ức chế từ tụy Đối với mô não từ phôi hay thai, nên sử dụng nồng độ enzym thấp hơn và thời gian ngắn hơn do cấu trúc lỏng lẻo Tách tế bào ảnh hưởng trực tiếp đến tỷ lệ sống của tế bào gốc thần kinh, vì vậy lựa chọn enzym phù hợp cho từng loại mô não là rất quan trọng Nghiên cứu của Maric và cộng sự năm 1998 cho thấy tách tế bào bằng papain cho tỷ lệ sống cao nhất trên mô não phôi thai chuột Tuy nhiên, việc tách tế bào bằng enzym có thể làm thay đổi các marker bề mặt, gây ra hiện tượng âm tính giả trong nhuộm hóa mô miễn dịch và phân loại tế bào huỳnh quang kích hoạt (FACS) Một số nghiên cứu cũng chỉ ra rằng trypsin có thể làm tăng dương tính với các marker bề mặt chỉ điểm khối u do thay đổi trạng thái glycosyl hóa, trong khi marker CD133 nhạy cảm với trypsin ở tế bào người nhưng không ở tế bào của loài gặm nhấm.
Bảng 1.1 Những marker bề mặt tế bào thần kinh nhạy cảm với enzyme
Enzym Marker nhạy cảm Marker ít nhạy cảm
Papain PSA-NCAM, CD24, BMP IA,
BMP IB CD15, O4, CD81 b Tách tế bào bằng cơ học
Tách tế bào gốc thần kinh trong mô thường không hiệu quả chỉ bằng enzym, do đó, các nhà nghiên cứu thường kết hợp với phương pháp tách tế bào bằng cơ học, mặc dù phương pháp này có thể gây chết một lượng tế bào đáng kể Nguyên nhân chính là do việc sử dụng pipet thủy tinh có kích thước không đồng đều, vì vậy, kỹ thuật tách tế bào bằng pipet thủy tinh nên được hạn chế Thay vào đó, việc sử dụng pipet với kích thước giảm dần có thể giúp giảm thiểu tế bào chết Ngoài ra, tế bào có thể dính vào thủy tinh trong quá trình thao tác, điều này có thể được khắc phục bằng cách sử dụng pipet tráng silicone hoặc pipet nhựa thương mại Một số nghiên cứu cũng thêm bước loại bỏ mảnh vụn từ dịch treo tế bào sau khi tách, nhằm loại bỏ mô không phân ly và mảnh vụn hoại tử, nhưng bước này có thể làm giảm số lượng tế bào sống do bị giữ lại trong bộ lọc Do đó, khuyến cáo sử dụng bộ lọc có DNAse I để loại bỏ chất nhầy và pha loãng dịch treo tế bào với môi trường để tối ưu hóa quá trình tách tế bào.
Sự không thống nhất về loại và kích thước bộ lọc giữa các tác giả là điều đáng chú ý, với một số người sử dụng gạc vô trùng hoặc các loại màng lọc tế bào Kích thước lỗ lọc cũng rất đa dạng, từ 40 μm đến 100 μm, điều này ảnh hưởng đến việc làm thuần nhất quần thể tế bào gốc.
Quần thể tế bào sau khi tách ra thường không đồng nhất và có mức độ biệt hóa khác nhau, do đó cần phân tách các nhóm tế bào riêng biệt Phân loại nhóm tế bào thường dựa vào hình thái, một đặc điểm liên quan chặt chẽ đến tính gốc Tuy nhiên, chỉ dựa vào hình thái chưa đủ để đạt được một quần thể đồng nhất Hiện nay, nhiều phương pháp kỹ thuật mới đã được phát triển để thu được quần thể tế bào nhất định, đóng vai trò quan trọng trong việc phân lập tế bào gốc thần kinh Các phương pháp này giúp làm thuần nhất quần thể tế bào gốc thần kinh.
Phân loại tế bào dựa vào tính chất kết dính là phương pháp hiệu quả để thuần nhất quần thể tế bào Sự bám dính khác nhau của các loại tế bào trên đĩa nuôi cấy, nhờ vào các phân tử kết dính đặc biệt, cho phép phân biệt chúng thông qua việc xử lý chất nền và lựa chọn thời gian nuôi cấy Trong ba nhóm tế bào gốc thần kinh, tế bào hình sao có khả năng kết dính cao nhất, ngay cả trên đĩa nuôi cấy không được xử lý Ngược lại, tế bào ít nhánh dễ dàng bị tách ra khỏi đĩa nuôi cấy chỉ với tác động lắc nhẹ trong khoảng thời gian 12-20 giờ Phương pháp này không chỉ đơn giản và kinh tế mà còn hiệu quả trong việc lựa chọn các loại tế bào gốc cụ thể như tế bào gốc ít nhánh.
Định danh tế bào gốc thần kinh và tế bào tiết dopamin
1.5.1 Định danh tế bào gốc thần kinh
1.5.1.1 Về hình thái a Hình thái vi thể
Nhuộm tế bào bằng các phương pháp như H-E, Giemsa hay Cajal là cách đơn giản để nhận diện tế bào gốc thần kinh Những tế bào này có tỷ lệ nhân/bào tương lớn, ít bào quan và chưa phát triển các cấu trúc cần thiết cho chức năng dẫn truyền thần kinh như sợi trục và sợi nhánh.
Dưới kính hiển vi điện tử, tế bào gốc thần kinh xuất hiện với hình dạng đa diện hoặc tròn, có nhân lớn và sáng màu, trong đó màng nhân thường có vị trí ấn lõm vào bên trong.
Tỷ lệ nhân/bào tương lớn Các bào quan thường nghèo nàn, chỉ có một số ti thể nhỏ, lưới nội bào và xơ trung gian [78]
1.5.1.2 Về các marker phân tử
Các marker phân tử dùng để xác định tế bào gốc bao gồm gene và các sản phẩm của chúng như protein, với tính đặc hiệu cho từng loại tế bào Các marker này được chia thành hai nhóm chính: marker trên bề mặt màng tế bào và marker bên trong tế bào.
Các marker trên bề mặt màng tế bào là các phân tử protein gắn liền với màng, có vai trò kết dính tế bào Trong khi đó, các marker bên trong tế bào bao gồm các gene và các phân tử protein do tế bào sản xuất, tồn tại trong bào tương Việc phát hiện các marker này chủ yếu dựa vào nguyên lý kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu với các phân tử protein, hoặc thông qua các đoạn gen “mồi” đối với ADN hoặc ARN.
Nestin là một loại xơ trung gian quan trọng trong cấu trúc bộ khung tế bào, thuộc nhóm IV của các xơ trung gian Các xơ trung gian được phân chia thành năm nhóm lớn: nhóm I và II chứa các xơ keratin, nhóm III bao gồm vimentin, desmin, peripherin và GFAP (Glial fibrillary acidic protein), nhóm IV có Nestin và alpha-internexin, trong khi nhóm V gồm các xơ trung gian cấu tạo nên bộ khung của nhân tế bào.
Nestin là một marker quan trọng trong nghiên cứu tế bào gốc thần kinh, được xác nhận qua nhiều nghiên cứu Tác giả Dahlstrand và cộng sự đã phát hiện rằng Nestin biểu hiện mạnh mẽ ở vùng tấm thần kinh trong phôi chuột từ 7,75 ngày đến khi sinh ra, đặc biệt là ở các tế bào dọc ống thần kinh vào ngày 10,5 Sau khi chuột con ra đời, biểu hiện của Nestin giảm ở các tế bào đã biệt hóa như nơron vận động và nơron đại não, và được thay thế bởi các loại xơ trung gian khác như neurofilament và GFAP Nghiên cứu của Messam và cộng sự năm 2002 cũng chỉ ra rằng Nestin không chỉ dương tính ở tế bào gốc mà còn ở các tế bào tăng sinh chuyển tiếp từ tế bào đầu dòng thần kinh.
Vimentin là một loại xơ trung gian quan trọng trong cấu trúc bộ khung tế bào, đóng vai trò trong việc vận chuyển protein giữa nhân và màng tế bào Kể từ những năm 1980, vimentin đã được sử dụng như một marker để đánh dấu tế bào gốc thần kinh Nghiên cứu của Tapscott và cộng sự (1981) cho thấy sự hiện diện của vimentin ở các tế bào vùng ống thần kinh phôi gà sau 33-38 giờ thụ tinh Tương tự, Fedoroff và cộng sự (1983) đã phát hiện vimentin ở vùng não phôi chuột 14 ngày, với các tế bào dương tính mạnh và âm tính với marker GFAP Tuy nhiên, ở chuột mới sinh, các tế bào lại dương tính với cả hai marker này, cho thấy sự hạn chế của vimentin khi nó cũng có mặt ở các tế bào đã trưởng thành Nghiên cứu của Stagaard và cộng sự (1989) về biểu hiện marker vimentin ở tế bào não phôi người từ 4-16 tuần cho thấy ở giai đoạn 4-6 tuần, hầu hết tế bào ngoại bì thần kinh dương tính với vimentin, trong khi ở giai đoạn 7-8 tuần, các tế bào thần kinh đã biệt hóa và biểu hiện thêm các marker khác như GFAP và neurofilament.
Vimentin là một loại protein quan trọng, đặc biệt trong các tế bào có nguồn gốc từ trung mô như tế bào cơ và tế bào trung mô Hiện nay, vimentin được ứng dụng rộng rãi trong chuyên ngành miễn dịch khối u để phân biệt giữa khối u biểu mô (carcinoma) và khối u trung mô (sarcoma) Đáng chú ý, xơ vimentin xuất hiện sớm hơn các loại xơ khác trong quá trình phát triển và biệt hóa tế bào thần kinh.
Musashi1, hay còn gọi là Msi1, là một loại protein gắn với RNA, đóng vai trò quan trọng trong quá trình phân chia bất đối xứng của tế bào gốc thần kinh, được nghiên cứu từ những năm 1990 Protein này thể hiện dương tính ở cả tế bào gốc phôi và tế bào gốc thần kinh ở chuột trưởng thành Tuy nhiên, Msi1 và nestin thường không cùng dương tính trong cùng một tế bào, dẫn đến giả thuyết rằng chúng có thể là marker của hai loại tế bào gốc khác nhau.
Yếu tố sao mã – SOX (SRY related HMG – box) được Sinclair và cộng sự mô tả lần đầu vào năm 1990, và hiện nay đã có hơn 20 gen được công nhận, tạo thành "SOX family" "SOX family" được chia thành 8 nhóm từ A đến H dựa trên trình tự amino acid ở vùng HMG tương ứng Trong đó, SOX1, SOX2 và SOX3 thuộc nhóm B1, được cho là có vai trò quan trọng trong sự phân chia và biệt hóa của tế bào gốc thần kinh.
Bên cạnh SOX, PAX6 là yếu tố phiên mã quan trọng trong việc điều hòa sự tăng sinh và biệt hóa nơron, với tăng biểu hiện PAX6 đồng nghĩa với sự gia tăng quần thể tế bào gốc thần kinh βIII-tubulin, một protein cấu thành ống siêu vi, được mã hóa bởi gen TUBB3 trên nhiễm sắc thể số 16, chủ yếu hiện diện ở nơron và tế bào biểu mô tinh hoàn Protein này xuất hiện ở những nơron chưa trưởng thành đang trong quá trình biệt hóa và được sử dụng như một marker để phân biệt nơron với tế bào thần kinh đệm, vì không có biểu hiện marker này ở các tế bào thần kinh đệm.
Doublecortin (DCX) là một loại protein quan trọng trong quá trình hình thành ống siêu vi và có mặt trong bào tương của nơron Protein này tham gia vào việc hình thành sợi trục ở các nơron chưa trưởng thành Biểu hiện của DCX giảm dần trong các giai đoạn phát triển sau của nơron, do đó nó được sử dụng như một marker để đánh dấu các tế bào thần kinh chưa trưởng thành, cùng với các marker khác như CD133 và CD15.
CD133 (AC133) là một protein xuyên màng, thường được sử dụng như một marker để đánh dấu tế bào gốc tủy xương và tế bào gốc thần kinh Nghiên cứu của Uchida và cộng sự năm 2000 cho thấy khoảng 90% tế bào vũng não phôi người từ 7 ngày tuổi có biểu hiện CD133 dương tính.
Trong nghiên cứu kéo dài 16 tuần, các tác giả đã sử dụng miễn dịch dòng chảy tế bào (FACS) để phân lập hai dòng tế bào CD133 (-) và CD133 (+) cho việc nuôi cấy Đáng chú ý, chỉ những giếng có CD133 (+) mới phát triển thành cụm tế bào thần kinh, sau đó biệt hóa thành nơron (đánh dấu bằng β-tubulin III) và tế bào thần kinh đệm (đánh dấu bằng GFAP) Điều này cho thấy CD133 là một lựa chọn mới cho nghiên cứu tế bào gốc thần kinh Tuy nhiên, một hạn chế của CD133 là marker này hiện chỉ áp dụng cho tế bào phôi người.
CD15, hay còn gọi là LewiX, là một loại protein nằm trên bề mặt tế bào Protein này được tìm thấy chủ yếu trong tế bào gốc phôi và các tế bào tạo thành cụm.
“neurosphere”, chịu trách nhiệm hình thành nên toàn bộ hệ thần kinh sau này
Bảo quản lạnh tế bào gốc thần kinh và nơron tiết dopamin
Để triển khai liệu pháp tế bào gốc hiệu quả, việc nuôi cấy, tăng sinh và biệt hóa tế bào cần được kết hợp với kỹ thuật lưu giữ và bảo quản lạnh Bảo quản lạnh tế bào ở nhiệt độ thấp là phương pháp quan trọng giúp bảo tồn cấu trúc và khả năng sống của tế bào, đảm bảo nguồn tế bào sẵn sàng cho điều trị Các kỹ thuật bảo quản lạnh đang không ngừng phát triển, nâng cao chất lượng tế bào và tỉ lệ sống sót sau thời gian dài lưu giữ.
Commented [D4]: Nên viết ngắn gọn
Quá trình bảo quản lạnh tế bào, đặc biệt là tế bào thần kinh, bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như chất bảo vệ lạnh, phương pháp hạ nhiệt độ và rã đông, cùng với mật độ tế bào Tế bào thần kinh trong các mẫu phân lập hoặc nuôi cấy có những đặc điểm đặc biệt, bao gồm sự hiện diện của nhiều tế bào ở các giai đoạn biệt hóa khác nhau và sự tồn tại của các "cụm" tế bào bên cạnh các tế bào đơn lẻ Do đó, nghiên cứu về bảo quản lạnh tế bào thần kinh cần chú ý đến những đặc điểm này.
Nghiên cứu cho thấy tế bào gốc thần kinh sau khi bảo quản lạnh vẫn giữ được tính “gốc” và khả năng phân chia, tăng sinh, biệt hóa thành nơron Việc lựa chọn kỹ thuật bảo quản lạnh phù hợp đã được tiến hành, trong đó DMSO được xác định là chất bảo vệ lạnh hiệu quả với nồng độ từ 7 - 10% giúp tăng tỷ lệ sống của tế bào sau rã đông Hiện có hai phương pháp hạ nhiệt độ là đông lạnh chậm (1℃/phút) và đông lạnh nhanh (vitrification), nhưng không có sự khác biệt rõ rệt về các marker phân tử và khả năng biệt hóa của tế bào giữa hai phương pháp này Tuy nhiên, phương pháp hạ nhiệt độ siêu chậm 0,5℃/phút cho kết quả thu hồi nơron thấp hơn đáng kể Do đó, cần tìm ra tốc độ hạ nhiệt lý tưởng cho từng loại tế bào và môi trường bảo quản để tối ưu hóa quy trình, nhằm hạn chế hình thành tinh thể đá và giảm tác động có hại của chất bảo vệ lạnh.
Trong một nghiên cứu gần đây của Rodriguez-Martinez về bảo quản lạnh tế bào gốc thần kinh não chuột, nhóm tác giả đã so sánh hiệu quả giữa việc bảo quản lạnh tế bào gốc thần kinh đơn lẻ và cụm tế bào, cũng như ở các giai đoạn biệt hóa khác nhau Kết quả cho thấy tỷ lệ sống sót của tế bào sau rã đông cao hơn ở nhóm tế bào đơn lẻ, nhưng khả năng phân chia và biệt hóa của các cụm tế bào lại tốt hơn khi được ghép vào não chuột thực nghiệm Nhóm tác giả lý giải rằng các tế bào đơn lẻ tiếp xúc tốt hơn với chất bảo vệ lạnh, nhưng việc tách rời các tế bào gốc thần kinh làm mất đi sự liên kết với các chất cận tiết trong "ổ vi môi trường", điều này ảnh hưởng đến sự phân chia và biệt hóa của chúng.
Nghiên cứu cho thấy rằng "cụm" tế bào gốc thần kinh có khả năng tăng cường khả năng phân chia và biệt hóa của tế bào so với các tế bào đơn lẻ Đặc biệt, nhóm tác giả không phát hiện dấu hiệu sinh u ở các tế bào gốc sau khi bảo quản và ghép lại trên chuột, ngay cả sau một năm theo dõi.
Nghiên cứu về bảo quản lạnh tế bào gốc thần kinh của người đã đạt được những kết quả khả quan trong vài năm gần đây, với tỷ lệ sống và khả năng biệt hóa cao của tế bào sau bảo quản Tuy nhiên, để ứng dụng rộng rãi trong lâm sàng, các nhà nghiên cứu đang tìm kiếm kỹ thuật bảo quản loại trừ hoàn toàn sản phẩm từ động vật như FBS và giảm thiểu độc tính của chất bảo vệ lạnh.