(LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu chiết tách và kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu lá trầu không ở tỉnh bà rịa – vũng tàu

TỔ NG QUAN LÝ THUY Ế T

Khái quát v ề h ọ H ồ tiêu [1]

Họ Hồ tiêu (Piperaceae) là một họ thực vật chứa trên 2.000 loài, được nhóm trong

Các loại cây thuộc họ 9 chi là cây bụi và dây leo phổ biến ở khu vực nhiệt đới, nổi bật với hoa có mùi thơm mạnh mẽ Trong số đó, các loài cây có giá trị kinh tế cao bao gồm tiêu, trầu, và lá lốt, như được minh họa trong hình 1.1.

Hình 1 1:M ộ t s ố loài cây thu ộ c h ọ h ồ tiêu 1.1.1 Phân loại khoa học [1]

Cây trầu, có tên khoa học là Piper betle, được biết đến với nhiều tên gọi khác nhau trên thế giới như trầu không, betel Baum (Đức), árbol de betel (Tây Ban Nha), arbre de betel (Pháp), và pokok sirih (Malaisia).

Loài trầu có nguồn gốc từ Đông Nam Á và được trồng rộng rãi ở các quốc gia như Ấn Độ, Indonesia, Sri Lanka, Việt Nam và Malaysia Giống trầu "Magahi", xuất phát từ vùng Magadha gần Patna, Bihar, Ấn Độ, được xem là loại lá trầu tốt nhất Tại Việt Nam, cây trầu được trồng trên nhiều vùng miền với quy mô khác nhau, từ việc trồng riêng lẻ tại các hộ gia đình cho đến việc hình thành các vườn trầu quy mô lớn.

Cây trầu không, hay còn gọi là cây trầu, là một loại cây gia vị và thuốc quý Đặc trưng với màu xanh tươi, cây dây leo này có tuổi thọ lâu năm, lá hình trái tim bóng mượt và hoa đuôi sóc màu trắng nổi bật.

1.1.4 Thành phần hóa học của lá trầu [1]

Các công trình nghiên cứu trước đây cho thấy trong lá trầu chứa các thành phần sau:

Lá trầu chứa tinh dầu với 23 thành phần chính, bao gồm 3-Allyl-6-methoxyphenyl acetate (14,95%), 4-Allyl-1,2-diacetoxybenzene (8,98%), Chavicol (4,57%), Eugenol (9,03%), Beta-caryophyllene (7,06%) và Linalool (1,55%) Tinh dầu có màu vàng nhạt, hương thơm nồng, và vị nóng cay khi nếm.

- Nhiều nghiên cứu gần đây còn cho biết lá trầu còn chứa cả chất tanin, đường khử, pectin 10%, flavonoid, alkaloid, phytosterol, steroid, axit hữu cơ

1.1.5 Lợi ích của cây trầu [14]

- Lá dùng để xông hơi giúp phụ nữ sau sinh kháng khuẩn vùng kín

Lá trầu không có tác dụng khử trùng tự nhiên, giúp bảo vệ trẻ sơ sinh khỏi các vi khuẩn gây bệnh Ngoài ra, lá còn hỗ trợ chữa phát ban, giảm ho và có thể được sử dụng để mát xa, giúp giảm chướng bụng và khó tiêu cho trẻ.

Tại Thái Lan và Trung Quốc, lá trầu không được sử dụng để làm giảm cơn đau răng Khi nhai lá trầu cùng với vôi, nó có tác dụng sát trùng răng miệng, hỗ trợ điều trị viêm mũ chân răng và giúp răng chắc khỏe hơn.

- Ăn trầu giúp không bị bệnh đường tiêu hóa, kí sinh trùng ở ruột.

- Nước sắc lá trầu để rửa hoặc đắp trị vết thương, bỏng, lở loét, mụn nhọt, chàm

- Lá trầu ngâm trong nước sôi dùng nhỏ mắt chữa viêm kết mạc

Lá trầu không không chỉ được biết đến với công dụng khử trùng và làm sạch hơi thở, mà còn được sử dụng như một chất kích thích trong y học Ayurveda, nơi chúng được coi là thuốc kích dục tự nhiên.

- Tại Malaysia chúng được sử dụng để điều trị chứng đau đầu, viêm khớp và các thương tổn khớp

Tại Indonesia, các loại thảo mộc được sử dụng như trà và có tác dụng như thuốc kháng sinh Chúng cũng được pha chế trong trà để điều trị chứng khó tiêu, đồng thời được sử dụng trong thuốc mỡ và thuốc hít để giảm đau đầu Ngoài ra, thảo mộc còn hỗ trợ điều trị chứng táo bón, thông mũi và giúp tăng cường tiết sữa.

Người Việt Nam đã từ lâu sử dụng Trầu Không và Cau để tạo ra món ăn truyền thống mang đậm ý nghĩa văn hóa và nhân văn, với câu nói "miếng trầu là đầu câu chuyện" thể hiện sự gắn kết và giao tiếp trong đời sống hàng ngày.

T ổ ng quan v ề tinh d ầ u [5]

Tinh dầu đã được con người biết đến và sử dụng từ thời thượng cổ, với các loại cây có tinh dầu thường được phơi khô Đến thế kỷ 15, tinh dầu trở nên phổ biến hơn, được dùng để làm thơm cho tóc và da mặt, cũng như trong việc chữa bệnh và trong đời sống hàng ngày Từ thế kỷ 17 đến thế kỷ 19, tinh dầu không chỉ được sử dụng trong trang điểm và y học mà còn mở rộng ra cả ngành công nghiệp.

Từ thế kỷ 20 đến đầu thế kỷ 21, ngành công nghiệp sản xuất tinh dầu đã phát triển mạnh mẽ nhờ vào sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật Tinh dầu hiện nay trở thành sản phẩm thiết yếu trong cuộc sống con người, được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực như hương liệu, thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm.

Tinh dầu là hỗn hợp các hợp chất dễ bay hơi, có thể mang mùi thơm dễ chịu hoặc mùi hắc khó chịu Chúng được chiết xuất từ các bộ phận của thực vật thông qua quá trình chưng cất và chiết xuất nguyên liệu.

Tinh dầu là sản phẩm cuối cùng của quá trình trao đổi chất trong cây, không được tái sử dụng trong hoạt động sống của chúng Mỗi loại tinh dầu có mùi vị riêng biệt, phụ thuộc vào thành phần hợp chất có trong nguyên liệu Hệ thực vật chứa khoảng 3000 loài tinh dầu, trong đó có 150 – 200 loài có giá trị công nghiệp, được sử dụng trong sản xuất xà phòng, hương liệu cho bánh kẹo và nước giải khát Ngoài ra, tinh dầu còn có nhiều ứng dụng trong y học, giúp giảm stress và làm tá dược trong thuốc.

Có hai loại tinh dầu: tinh dầu nguyên chất và tinh dầu không nguyên chất:

Tinh dầu nguyên chất hoàn toàn không chứa độc tố và hóa chất bảo quản, đảm bảo an toàn cho người sử dụng Sản phẩm này mang lại hiệu quả nhanh chóng trong quá trình điều trị.

+ Tinh dầu không nguyên chất: Là tinh dầu được pha từ tinh dầu nguyên chất với các chất hóa học khác mà vẫn giữ được hương của tinh dầu

1.2.3 Tính chất vật lí và thành phần hóa học của tinh dầu [5]

1.2.3.1 Tính chất vật lý của tinh dầu [5]

Tinh dầu thường ở dạng lỏng khi nhiệt độ bình thường, có mùi thơm nhẹ và ít màu sắc, ngoại trừ tinh dầu chứa aluzen có màu xanh Với tỉ trọng nhỏ hơn nước, tinh dầu nhẹ hơn nước và có chỉ số khúc xạ cao Chúng có khả năng bay hơi và ít tan trong nước, nhưng lại làm cho nước có mùi thơm dễ chịu Tinh dầu là hỗn hợp phức tạp, do đó không có nhiệt độ sôi cố định, nhưng chúng tan tốt trong cồn, ete, dung môi hữu cơ và các chất béo.

Để xác định tính chất vật lý của tinh dầu, người ta thường đo các chỉ số như tỷ trọng, chiết suất, tỷ lệ hòa tan trong cồn 90 độ C ở 25 độ C, nhiệt độ sôi, năng suất quay cực và màu sắc.

Hầu hết các loại tinh dầu có tỷ trọng nhỏ hơn 1, khiến chúng thường nhẹ hơn nước Tuy nhiên, một số tinh dầu như tinh dầu quế và tinh dầu đinh hương lại có khối lượng riêng lớn hơn nước.

Tinh dầu thường không tan hoặc chỉ tan ít trong nước, nhưng chúng lại hòa tan tốt trong nhiều dung môi hữu cơ như este và cồn Mặc dù thành phần hóa học của từng loại tinh dầu có sự khác biệt, nhưng nhìn chung, chúng có nhiệt độ sôi dao động từ 80°C đến 150°C, dễ bay hơi và mang hương thơm đặc trưng.

Tinh dầu thường không màu hoặc có màu vàng nhạt, trong khi một số loại tinh dầu như tinh dầu ngải cứu và tinh dầu quế có màu sắc đặc trưng do sự hiện diện của các hợp chất màu trong quá trình chiết xuất, chẳng hạn như chlorophyll và carotenoid Mùi và vị của tinh dầu chủ yếu được tạo ra từ các cấu tử bị oxy hóa.

1.2.3.2 Các thành phần hóa học trong tinh dầu [5]

Tinh dầu là chất lỏng tinh chế từ các bộ phận của thực vật như lá, thân, hoa, vỏ và rễ, thường qua phương pháp chưng cất bằng hơi hoặc nước Được ví như nhựa sống của cây, tinh dầu mang trong mình sức sống và năng lượng, mạnh gấp 100 lần so với thảo dược khô.

- Hidrocacbon: Các hidrocacbon thường gặp trong tinh dầu là những terpen

(C10H16)n mạch hở hoặc mạch vòng

Bất kỳ một loại tinh dầu nào cũng đều có những thành phần sau:

Monoterpenes là hợp chất thường có trong nhiều loại tinh dầu, với công thức phân tử C10H16 mạch hở Một số ví dụ tiêu biểu bao gồm miaxene và oximene, được tìm thấy trong tinh dầu hoa nguyệt quế.

- Monoterpenes là chất khử trùng và thuốc bổ trong tự nhiên, chúng được lọc không khí tốt và có mặt trong hầu hết các loại tinh dầu

 Sesquiterpene: Mặc dù không phải là dễ bay hơi như Monoterpenes, các Sesquiterpene mạch thẳng và vòng tiêu biểu là Farnesene, Zingiberene

- Sesquiterpene có khoảng 15 nguyên tử cacbon trong đó Và có một số tác dụng làm dịu, là chống viêm và chống nhiễm trùng

 Phenol: Một số chất phenol trích từ các loại tinh dầu như: Thymol, Estragol,

Các chất khử trùng chủ yếu là các hóa chất có nguồn gốc từ thực vật, có khả năng kích thích cơ thể Phenol, khi được sử dụng với liều lượng nhỏ, có tác dụng tích cực, nhưng nếu sử dụng với liều cao, nó có thể trở thành chất độc đối với hệ thần kinh và gây kích ứng da.

• Ancol: Một số ancol quan trọng trích từ tinh dầu thường gặp như: Menthol, α –

Nhiều loại tinh dầu chứa ancol, có tác dụng sát trùng, kháng khuẩn và chống nấm Chúng cũng có lợi cho hệ thần kinh và kích thích phản ứng miễn dịch trong cơ thể, tương tự như rượu, thuốc kháng sinh và thuốc bổ.

 Este: Các este bốc hơi nhanh và tạo độ ngát cho hương Một số este có trong tinh dầu: etyl anthranilate, benzyl axetat,

Có tính chất chống co thắt, kháng khuẩn và chống viêm, sản phẩm này nhẹ nhàng khi sử dụng trên da, đồng thời hỗ trợ hiệu quả trong việc tái cân bằng hệ thần kinh.

Tính ch ấ t v ậ t lý và thành ph ầ n hóa h ọ c c ủ a tinh d ầ u Tr ầ u không

1.3.1 Tính chất vật lý của tinh dầu Trầu không [15]

Tinh dầu Trầu không là dạng chất lỏng trong suốt, thơm mùi đặc trưng, màu vàng đến nâu sẫm Các thông số vật lí như sau:

B ả ng 1.1: Thông s ố v ậ t lý c ủ a tinh d ầ u lá Tr ầ u không ở 30 0 C

1.3.2 Thành phần hóa học của tinh dầu Trầu không [1], [2], [3]

Chavicol, hay còn gọi là p-allylphenol, là một hợp chất hữu cơ thuộc nhóm phenylpropene Cấu trúc hóa học của chavicol bao gồm một vòng benzen có nhóm hydroxy và nhóm propenyl Chavicol xuất hiện dưới dạng chất lỏng không màu và thường được tìm thấy cùng với terpen trong tinh dầu trầu.

 Khối lượng phân tử: 134,18 g/mol

Eugenol là một hợp chất guaiacol với chuỗi allyl, thuộc nhóm allylbenzene, có dạng lỏng nhờn không màu đến vàng nhạt và có mùi thơm đặc trưng Chất này được chiết xuất từ các loại tinh dầu, đặc biệt là từ dầu đinh hương, nhục đậu khấu, quế, húng quế và lá nguyệt quế Nồng độ của eugenol rất cao, đạt 80% trong ngọn, 90% trong dầu nụ đinh hương và 82% trong dầu lá đinh hương, mang lại hương thơm dễ chịu, cay nồng giống như đinh hương.

 Khối lượng phân tử: 164,204 g/mol

Beta-caryophyllene là một sesquiterpene tự nhiên, thuộc lớp terpen với công thức phân tử C15H24, bao gồm ba đơn vị isopren Giống như monoterpen, sesquiterpen có thể xuất hiện dưới dạng vòng hoặc chứa các vòng Chúng thường được tìm thấy trong thực vật và côn trùng, đóng vai trò như các tác nhân phòng thủ hoặc pheromone Beta-caryophyllene là thành phần chính của nhiều loại tinh dầu, đặc biệt là tinh dầu đinh hương từ hoa Syzygium aromaticum và tinh dầu của Cannabis sativa Nó thường xuất hiện dưới dạng hỗn hợp với isocaryophyllene.

Caryophyllene, còn được biết đến với tên gọi α-humulene, là một đồng phân mở vòng nổi bật với cấu trúc bao gồm một vòng cyclobutane và một liên kết ngang trong vòng 9 nhóm, điều này khá hiếm gặp trong tự nhiên Hợp chất này đóng vai trò quan trọng trong việc tạo nên hương vị đặc trưng của hạt tiêu đen.

 Khối lượng phân tử: 204,357 g/mol

Linalool là một chất lỏng không màu với mùi hương nhẹ nhàng, xuất hiện trong nhiều loại tinh dầu như quýt, bạc hà, hoa hồng, cây bách, chanh và quế Ngoài ra, linalool còn được tìm thấy trong một số loại nấm Chất này được sử dụng rộng rãi trong thương mại, chủ yếu nhờ vào hương thơm dễ chịu mà nó mang lại.

 Khối lượng phân tử: 254,25g/mol

4-Allyl-1,2-diacetoxybenzene, hay còn gọi là Methyleugenol, là một hợp chất hóa học tự nhiên thuộc nhóm phenylpropene và phenylpropanoid Hợp chất này là methyl ether của eugenol và đóng vai trò quan trọng trong hành vi cũng như sự thụ phấn của côn trùng.

Nó được tìm thấy trong cấc loại tinh dầu khác nhau

 Khối lượng phân tử: 178,23g/mol

1.3.3 Ứng dụng của tinh dầu Trầu không [14]

Tinh dầu lá Trầu không nổi bật với hoạt tính kháng sinh mạnh, có khả năng ức chế nhiều chủng vi khuẩn như tụ cầu khuẩn, liên cầu khuẩn, trực khuẩn coli, trực khuẩn lị và phẩy khuẩn tả Ngoài ra, tinh dầu này cũng thể hiện tác dụng kháng nấm mạnh mẽ đối với nhiều loại nấm khác nhau.

- Tinh dầu trầu: xoa bóp khi đau nhức xương khớp, xông đèn tinh dầu giải stress, giảm đau đầu

- Trong lĩnh vực chăm sóc sắc đẹp tinh dầu dùng làm tinh chất trị mụn trong kem

- Trong dược phẩm tinh dầu được dùng làm nước súc miệng

Trong lĩnh vực y học, tinh dầu Trầu không đang ngày càng được chú trọng và phát triển trong việc sản xuất các sản phẩm dung dịch vệ sinh phụ nữ.

Các phương pháp chiế t tách tinh d ầ u [5]

Dựa trên cách thực hành, các phương pháp sản xuất tinh dầu được chia thành bốn loại, mặc dù mỗi phương pháp có sự khác biệt, nhưng quy trình sản xuất vẫn có những điểm chung quan trọng.

 Tinh dầu thu được phải có mùi thơm tự nhiên như nguyên liệu

 Quy trình khai thác phải phù hợp nguyên liệu

 Tinh dầu phải được lấy triệt để khỏi nguyên liệu với chi phí thấp nhất

- Nguyên tắc ly trích của tất cả các phương pháp nói trên đều dựa vào những đặc tính của tinh dầu như:

 Lôi cuốn theo hơi nước ở nhiệt độ dưới 100 0 C

 Hòa tan dễ dàng trong dung môi hữu cơ

 Dễ bị hấp thu ngay ở thể khí

1.4.1 Phương pháp chưng cất hơi nước [18]

Phương pháp này sử dụng thẩm thấu, hòa tan và khuếch tán để chiết xuất các hợp chất hữu cơ trong tinh dầu từ mô khi tiếp xúc với hơi nước nóng Khi nguyên liệu tiếp xúc với hơi nước bão hòa, tế bào chứa tinh dầu sẽ trương phồng, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình khuếch tán diễn ra hiệu quả.

Khi chưng cất mô thực vật chứa sáp, nhựa và acid béo chuỗi dài, quá trình này cần diễn ra trong thời gian dài Những hợp chất này làm giảm áp suất hơi chung của hệ thống, dẫn đến việc khuếch tán trở nên khó khăn hơn.

Lý thuyết chưng cất định nghĩa là quá trình tách rời các cấu phần của hỗn hợp chất lỏng dựa trên sự khác biệt về áp suất hơi Khi chưng cất một hỗn hợp gồm hai chất lỏng không hòa tan, áp suất hơi tổng cộng là tổng của hai áp suất hơi riêng phần, dẫn đến nhiệt độ sôi của hỗn hợp phụ thuộc vào áp suất hơi tổng cộng Nhiệt độ sôi của hỗn hợp luôn thấp hơn nhiệt độ sôi của từng hợp chất riêng lẻ Ví dụ, ở áp suất 760 mmHg, nước sôi ở nhiệt độ nhất định, cho thấy sự khác biệt này trong quá trình chưng cất.

Nước sôi ở 100°C và benzen sôi ở 80°C, và chúng không hòa tan vào nhau Khi đun hỗn hợp này dưới áp suất 760 mmHg, nó sẽ sôi ở 69°C cho đến khi còn hỗn hợp hai pha lỏng với bất kỳ tỉ lệ nào Giản đồ nhiệt độ sôi theo áp suất cho thấy, tại 69°C, áp suất hơi của nước là 225 mmHg và của benzen là 535 mmHg.

Phương pháp chưng cất hơi nước, nhờ vào khả năng làm giảm nhiệt độ sôi, đã trở thành phương pháp đầu tiên được sử dụng để tách tinh dầu từ nguyên liệu thực vật.

 Những ảnh hưởng chính trong sựchưng cất hơi nước:

Khi nguyên liệu được làm vỡ vụn, chỉ một số mô chứa tinh dầu bị vỡ, cho phép tinh dầu thoát ra ngoài theo hơi nước Phần lớn tinh dầu còn lại sẽ dần dần ra ngoài bề mặt nguyên liệu thông qua quá trình hòa tan và thẩm thấu Đồng thời, nước thẩm thấu vào nguyên liệu và tinh dầu tiếp tục hòa tan vào nước này Quy trình này lặp đi lặp lại cho đến khi toàn bộ tinh dầu trong các mô được giải phóng ra ngoài.

Sự hiện diện của nước là rất quan trọng trong quá trình chưng cất bằng hơi nước quá nhiệt, vì vậy cần tránh để nguyên liệu bị khô Tuy nhiên, việc sử dụng quá nhiều nước cũng không có lợi, đặc biệt khi tinh dầu chứa các thành phần dễ tan trong nước.

Để đảm bảo hơi nước có thể xuyên qua lớp nguyên liệu một cách đồng đều và dễ dàng, cần làm cho nguyên liệu được vỡ vụn tối đa và có độ xốp nhất định.

Các hợp chất dễ hòa tan trong nước thường được chiết xuất trước khi các thành phần khác trong tinh dầu được chưng cất bằng hơi nước.

Các cấu phần ester trong tinh dầu dễ bị thủy giải thành acid và alcol khi bị đun nóng lâu trong nước Để hạn chế hiện tượng này, quá trình chưng cất hơi nước cần được thực hiện trong thời gian ngắn nhất có thể.

Nhiệt độ cao có thể phân hủy tinh dầu, vì vậy việc sử dụng hơi nước quá nhiệt (trên 100°C) chỉ nên thực hiện ở giai đoạn cuối của quá trình chưng cất, sau khi đã loại bỏ các thành phần dễ bay hơi Hầu hết các tinh dầu đều không bền dưới tác động của nhiệt, do đó, cần giảm thiểu thời gian chịu nhiệt độ cao để bảo toàn chất lượng của tinh dầu.

Tóm lại, ba ảnh hưởng này, mặc dù được xem xét riêng biệt, thực chất lại có mối liên hệ chặt chẽ và đều quy về tác động của nhiệt độ Khi nhiệt độ tăng, sự khuếch tán thẩm thấu và khả năng hòa tan tinh dầu trong nước đều gia tăng, tuy nhiên, quá trình phân hủy cũng tăng theo.

 Ưu và nhược điểm của phương pháp chưng cất lôi cuốn hơinước:

- Phương pháp này đơn giản, dễ làm

- Thiết bị rẻ tiền, gọn và dễ chế tạo

- Phù hợp với những cơ sở sản xuất nhỏ, vốn đầu tư ít

- Quy trình kỹ thuật tương đối đơn giản

- Không đòi hỏi vật liệu phụ như các phương pháp tẩm trích, hấp phụ

- Thời gian chưng cất tương đối nhanh

- Khó điều chỉnh các thông số kỹ thuật như tốc độ, nhiệt độ chưng cất

- Không hiệu quả với những nguyên liệu có hàm lượng tinh dầu thấp

- Chất lượng tinh dầu có thể bị ảnh hưởng nếu tinh dầu có những cấu tử dễ bị phân hủy

- Trong nước chưng luôn luôn có một lượng tinh dầu tương đối lớn Những tinh dầu có nhiệt độ sôi cao thường cho hiệu suất rất kém

 Các phương pháp chưng cất hơi nước:

 Chưng cất bằng nước và hơi nước

 Chưng cất bằng hơi nước

Trong quá trình chưng cất, cần đảm bảo nước phủ kín nguyên liệu nhưng vẫn để lại khoảng không gian lớn phía trên để tránh hiện tượng văng chất nạp khi nước sôi Nhiệt độ có thể được cung cấp bằng củi hoặc bếp gia nhiệt Nếu chất nạp quá mịn và lắng xuống đáy nồi, có thể gây cháy khét, do đó nồi cần được trang bị cánh khuấy để trộn đều nguyên liệu Phương pháp chưng cất này không phù hợp cho tinh dầu dễ bị thủy giải, nhưng lại lý tưởng cho nguyên liệu xốp và rời rạc Ngoài ra, những thành phần có nhiệt độ sôi cao và dễ tan trong nước sẽ khó hóa hơi trong lượng nước lớn, dẫn đến sản phẩm tinh dầu thiếu hụt các hợp chất quan trọng.

1.4.1.2 Chưng cất bằng nước và hơi nước [18]

Trong phương pháp chưng cất này, nguyên liệu được đặt trên một vỉ đục lỗ và nồi cất được đổ sao cho nước không chạm đến vỉ Nhiệt có thể được cung cấp từ ngọn lửa trực tiếp hoặc hơi nước từ nồi hơi Phương pháp này là một dạng chưng cất bằng hơi nước ở áp suất thường, giúp giảm thiểu sản phẩm phân hủy so với chưng cất bằng hơi nước trực tiếp Việc chuẩn bị nguyên liệu rất quan trọng, vì hơi nước cần tiếp xúc tối đa với chất nạp; do đó, chất nạp cần có kích thước đồng đều để tránh tình trạng vón cục Luồng hơi nước đầu tiên mang tinh dầu có thể bị ngưng tụ và rơi ngược lại vào nước, gây thất thoát Tốc độ chưng cất không quan trọng như trong chưng cất bằng nước, nhưng tốc độ nhanh có lợi để ngăn ngừa quá ướt và tăng hiệu suất So với chưng cất bằng nước, phương pháp này ít tạo ra sản phẩm phân hủy, nhưng nhược điểm là cần nhiều hơi nước để hóa hơi hoàn toàn, dẫn đến thời gian lâu Sau mỗi lần chưng cất, nước bên dưới vỉ cần được thay thế để tránh mùi cho mẻ sản phẩm tiếp theo.

1.4.1.3 Chưng cất bằng hơi nước [18]

Các phương pháp đánh giá hoạ t tính kháng khu ẩ n [17]

1.7.1 Phương pháp khuếch tán đĩa

Phương pháp thử hoạt tính ức chế vi khuẩn là phương pháp của Hadacek et al

Chủng vi khuẩn được kích hoạt từ ống chủng gốc trên môi trường LB đặc, sau đó được cấy chuyển vào 5ml môi trường TSB lỏng và lắc ở nhiệt độ 37°C qua đêm Để chuẩn bị đĩa thử hoạt tính, 200μL dịch khuẩn với nồng độ 4-5 × 10^8 CFU/ml được cấy trải lên bề mặt đĩa petri chứa môi trường LB đặc, sau đó để khô và đục 5-6 giếng có đường kính khoảng 6mm, cách nhau 2mm.

Chuẩn bị tinh dầu thử nghiệm bằng cách hòa tan tinh dầu trong Dimethyl Sulfoxide (DMSO 2%) và TWEEN 80 0,2% để đạt nồng độ mong muốn Tiến hành bổ sung 50μL dịch chiết vào các giếng thạch trên đĩa petri và giữ ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ để dịch chiết khuếch tán ra môi trường nuôi cấy vi khuẩn Sau đó, đặt các đĩa vào tủ ấm ở 37 độ C trong 24 giờ Đối chứng dương sử dụng dung dịch kháng sinh (Ampicilin 10𝜇g/ml, Tetracyclin 30 𝜇g/ml, Amoxilin 10𝜇g/ml), trong khi đối chứng âm là DMSO 2% và TWEEN 80 0,2% Hoạt tính ức chế khuẩn được đánh giá bằng cách đo bán kính vòng ức chế vi sinh vật, sử dụng công thức BK (mm) = D - d, trong đó D là đường kính vòng vô khuẩn và d là đường kính lỗ khoan thạch Thí nghiệm được lặp lại ba lần để lấy giá trị trung bình.

Gi ớ i thi ệ u m ộ t s ố ch ủ ng vi khu ẩ n [2], [6], [16]

Bacillus cereus là một loại vi khuẩn gram dương, hình que, hiếu khí, có khả năng sinh nha bào và được phát hiện lần đầu tiên trong một ca nhiễm độc thực phẩm vào năm 1955 Từ năm 1972 đến 1986, đã có 52 trường hợp ngộ độc thực phẩm do Bacillus cereus được báo cáo, chiếm khoảng 2% tổng số ca bệnh thực phẩm, mặc dù thực tế con số này có thể cao hơn nhiều.

Theo phân loại khoa học, Bacillus cereus thuộc:

Trực khuẩn, gram dương, tạo nội bào tử Kớch thước 0,5 - 1,5 àm x 2 - 4 àm Vi khuẩn không tạo giáp mô, không có khả năng di động

Vi khuẩn Bacillus cereus phân bố nhiều trong tự nhiên, nhiễm vào các loại thức ăn qua đêm hay trữ lạnh lâu, thường gây ngộ độc thực phẩm

 Đặc điểm nuôi cấy: Là loại vi khuẩn dễ mọc, hiếu khí và kị khí tùy nghi, sống ở nhiệt độ thích hợp 5 – 50 0 C, tối ưu 35 – 40 0 C, độ pH 4,5 - 9,3, thích hợp 7

+ Trên môi trường NA hay TSB sau 24 giờ tạo khóm lớn, nhăn nheo, xù xì + Trên môi trường BA tạo dung huyết rộng

+ Trên môi trường MYP (Mannitol Egg Yolk Polymixin): khóm hồng chung quanh có vòng sáng

Hình 1 5: Vi khu ẩ n Bacilus cereus trên kính hi ể n vi và trên môi trườ ng th ạ ch MP

+ Trên môi trường Mossel (thạch cereus selective agar): khóm to hồng chung quanh có vòng sáng

+ Trên môi trường canh NB, TSB: đục tạo váng, sau cặn lợn cợn

+ Trên môi trường đường: lên men glucose trong điều kiện hiếu khí và kị khí, không lên men mannitol

 Độctố: vi khuẩn sản sinh 2 loại độc tố

Độc tố gây tiêu chảy (Type 1) là một loại protein do vi khuẩn sản sinh trên thực phẩm như thịt, rau quả và gia vị Chất độc này có khả năng hủy hoại biểu bì và niêm mạc ruột, dẫn đến tình trạng tiêu chảy nghiêm trọng, có thể đe dọa đến tính mạng người bệnh.

Độc tố gây nôn mửa (Type 2) là loại độc tố được sản sinh bởi vi khuẩn Staphylococcus aureus, thường xuất hiện trong thực phẩm như gạo, cơm nguội và các loại đậu Đặc điểm nổi bật của độc tố này là tính chất phospholipit ổn định cao, không bị phân hủy ở nhiệt độ cao cũng như trong môi trường dịch dạ dày.

Staphylococcus aureus, được Robert Koch phát hiện vào năm 1878 từ mủ ung nhọt, đã trở thành một trong những chủng vi khuẩn quan trọng trong lịch sử vi sinh vật học Louis Pasteur cũng đã nghiên cứu về tụ cầu khuẩn trong giai đoạn đầu của ngành này, góp phần làm rõ vai trò của vi khuẩn trong các bệnh nhiễm trùng.

- Giống Staphylococcus có hơn 20 loài khác nhau, trong đó có 3 loài tụ cầu có vai trò trong y học:

+ Staphylococcus aureus (S aureus): Tụ cầu vàng được xem là tụ cầu gây bệnh

+ Staphylococcus epidermidis (Tụ cầu da)

Staphylococcus aureus phát triển mạnh mẽ trong môi trường thông thường với nhiệt độ tối ưu từ 18 – 40 độ C và pH 7,2, nhưng phát triển tốt nhất ở 25 độ C Vi khuẩn này có khả năng sống trong điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý Sau 5 – 6 giờ, S aureus có thể làm đục môi trường canh thang, và sau 24 giờ, sự đục trở nên rõ ràng hơn Trên môi trường đặc, khuẩn lạc của S aureus có hình tròn, lồi, bóng láng và có thể có màu vàng đậm, vàng cam hoặc trắng, với kích thước tương đối lớn sau 24 giờ Đặc biệt, S aureus có thể phát triển trong môi trường có hoạt độ thấp hơn so với các loài vi khuẩn khác hoặc trong điều kiện có nồng độ muối cao.

Khi được nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, vi sinh vật này sẽ tạo ra sắc tố vàng sau 1 - 2 ngày và tổng hợp enterotoxin hiệu quả nhất ở nhiệt độ trên 15 độ C, đặc biệt là trong khoảng 35 – 37 độ C.

Staphylococcus aureus là một vi khuẩn phổ biến, thường sống ký sinh mà không gây hại Tuy nhiên, khi chúng xâm nhập hoặc xuyên qua da, chúng có thể gây ra nhiều loại nhiễm trùng khác nhau, từ nhiễm trùng da, loét và phỏng da đến các nhiễm trùng nghiêm trọng hơn trong máu, phổi hoặc các mô khác.

 Tính chất sinh hoá và đề kháng:

Tụ cầu vàng là loại vi khuẩn có khả năng chịu nhiệt và kháng khuẩn tốt hơn so với các vi khuẩn khác Chúng có thể sống trong môi trường khô và ở nồng độ NaCl cao lên đến 9% Nhiều chủng tụ cầu vàng cũng cho thấy khả năng kháng lại penicillin và các loại kháng sinh khác.

Hình 1 6: Vi khu ẩ n Staphylococus aureus trên kính hi ể n vi và trên môi trườ ng th ạ ch MSA

S aureus exhibits DNase activity and is catalase positive, converting hydrogen peroxide into water and oxygen It is also phosphatase positive and capable of fermenting mannitol, trehalose, and sucrose, while producing acid Additionally, desoxyribonuclease is an enzyme that breaks down DNA All strains of S aureus are sensitive to novobiocin.

+ Các tụ cầu có nhiều loại kháng nguyên: protein, polysaccharide, acid teichoic ở vách tế bào.

Vách tế bào của tụ cầu chứa kháng nguyên polysaccharide và kháng nguyên protein A trên bề mặt Dựa vào các kháng nguyên này, người ta có thể phân loại tụ cầu thành các nhóm khác nhau Tuy nhiên, phản ứng huyết thanh không có giá trị trong việc chẩn đoán loại vi khuẩn này.

Khả năng gây bệnh của tụ cầu vàng (S aureus) xuất phát từ sự phát triển nhanh chóng và khả năng lan tỏa rộng rãi trong mô, cùng với việc sản xuất nhiều độc tố và enzyme Một số chủng S aureus có khả năng tổng hợp enterotoxin khi nhiễm vào thực phẩm, đặc biệt là trong môi trường có nhiệt độ trên 15 độ C Độc tố ruột enterotoxin do S aureus sản xuất là một protein ổn định nhiệt, đạt mức tối đa khi vi khuẩn phát triển ở nhiệt độ 35 – 37 độ C và có thể tồn tại ở nhiệt độ 100 độ C từ 30 đến 700 phút.

• Protease phân giải protein của tế bào chủ

• Deoxyribonuclease (DNase) phân giải DNA và các enzyme sửa đổi acid béo (FAME) c) Escherichia coli

Theodor Escherich là người đầu tiên phát hiện ra vi khuẩn coli vào năm 1885 trong nghiên cứu về bệnh tiêu chảy ở trẻ em Ông đặt tên cho vi khuẩn này là Bacterium coli do nó sống trong ruột già Phát hiện của ông được trình bày trong bài thuyết trình "Vi khuẩn đường ruột ở trẻ sơ sinh" tại Hiệp hội Hình thái và Sinh lý học Đến năm 1886, sau 18 tháng nghiên cứu, Escherich xuất bản cuốn sách "Darmbakterien des Sọuglings und ihre Beziehungen zur Physiologie der Verdauung".

Escherichia coli là vi khuẩn gram âm, kỵ khí không bắt buộc, có hình dạng roi, thường sống trong phần dưới của ruột động vật máu nóng Mặc dù đa số các chủng không gây bệnh, nhưng một số loại có khả năng gây ra tiêu chảy và nhiễm trùng sinh mủ.

Dưới kính hiển vi, vi khuẩn E coli có hình dạng que, với chiều dài từ 1 μm đến 5 μm Một số loài E coli có khả năng di chuyển bằng roi, trong khi một số ít khác không có khả năng di động và ở yên một chỗ Đặc biệt, E coli không thể tạo bào tử như nhiều loại vi khuẩn khác.

Sinh trưởng ở 15 – 40 0 C nhưng nhiệt độ thích hợp nhất là 37 0 C, pH từ 6,4 – 7,4

Mọc tốt trên môi trường thạch EMB, sau 24 giờ hình thành những khuẩn lạc tròn, ướt, hồng tím khoảng 2 – 3 mm

 Tính chất sinh hóa và đề kháng:

+ Có thể lên men chuyển hóa đường thành acid lactic

+ Hầu hết các loại vi khuẩn E coli đều có khả năng nitrat thành nitrit, sinh hơi + Chịu được nhiệt, không bị hủy khi đun ở 100 0 C trong 2 giờ

+ Kháng cồn, không bị hủy khi tiếp xúc với cồn 50%

+ Rất độc, chỉ cần 0,05mg có thể giết chuột nhắc trong vòng 24 giờ

Hình 1 7: Vi khuẩn Escherichia coli trên kính hiển vi và trên môi trường thạch EMB

Một số chủng E coli sản sinh ra độc tố Shiga, gây ra triệu chứng tiêu chảy và có khả năng dẫn đến bệnh nghiêm trọng Những chủng E coli này thường được gọi là STEC (phát âm là "S-TECK").

THỰ C NGHI Ệ M

Đối tượ ng, d ụ ng c ụ thi ế t b ị và hóa ch ất, phương pháp nghiên c ứ u

Nghiên cứu này sử dụng lá Trầu không được trồng tại xã Nghĩa Thành, Suối Nghệ, huyện Châu Đức, tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu làm nguyên liệu để chiết tinh dầu.

-Nguyên liệu tươi, không bị nấm mốc, đạt độ trưởng thành và không bị sâu bệnh

2.1.2 Dụng cụ thiết bị và hóa chất a) Dụng cụ thiết bị

Thiết bị Số lượng Thiết bị Số lượng

Nồi inox dung tích 5 lít 1 Nhiệt kế 1 Ống sinh hàn ruột thẳng 1 Đũa thủy tinh 1

Bộ Clevenger 1 Phễu chiết (250ml) 1

Cân phân tích (0.001g) 1 Ống đong (500ml) 1

Bình định mức(500ml) 1 Erlen (150ml) 2

Tủ lạnh 1 Cốc thủy tinh (500ml,

Bếp điện 1 Bóp cao su 1 Đĩa petri 20 Pipet ( 10ml, 5ml) 2

Giấy tròn kháng khuẩn 50 lỗ Ống nghiệm 20 Ống tiêm 1ml/1cc 3 Màng bọc thực phẩm 1 cuộn

Hình 2 1: Lá Trầu không b) Hóa chất:

2.1.3 Phương pháp nghiên cứu Để đạt được mục đích đặt ra của đề tài, đề tài nghiên cứu dựa trên các bài báo nghiên cứu khoa học khác, nội dung nghiên cứu như sau:

Nghiên cứu về chiết xuất tinh dầu sử dụng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước đã được thực hiện, với các điều kiện khảo sát bao gồm tỉ lệ dung môi so với nguyên liệu, thời gian ngâm và thời gian chưng cất.

-Nghiên cứu phương pháp xác định chỉ tiêu hóa – lý của tinh dầu

Nghiên cứu thành phần hóa học chính trong tinh dầu trầu không được thực hiện dựa trên kết quả từ các nghiên cứu khoa học trước đó, sử dụng phương pháp sắc ký khí khối phổ GC/MS Phương pháp chưng cất hơi nước cổ điển là phương pháp chiết xuất tinh dầu phổ biến nhất hiện nay và được áp dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp.

X ử lý nguyên li ệ u

Khi thu hoạch lá trầu không, cần chọn những lá già, tươi, đạt độ trưởng thành, không bị sâu bệnh hay nấm mốc, và nên hái vào sáng sớm Sau đó, lá được rửa sạch, để ráo nước và cắt nhỏ Cuối cùng, cần cân chính xác 500g lá trầu không và cho vào nồi chưng cất.

D ự ki ế n quy trình chi ế t xu ấ t tinh d ầ u tr ầ u không

Lá Trầu không được rửa sạch, cắt nhỏ sơ bộ, cho vào nồi chưng cất chứa nước cất, đậy kín, ngâm trong khoảng thời gian thích hợp

Tiến hành chưng cất hỗn hợp nguyên liệu đã chuẩn bị, trong đó hơi nước và tinh dầu sẽ bay hơi và ngưng tụ qua ống sinh hàn, được chứa trong cột thiết bị Clevenger Sau khi để yên, nước sẽ phân lớp ở phía dưới và tinh dầu ở phía trên; khi cột đầy, cần xả bớt phần nước ngưng, giữ lại tinh dầu trong cột Khi thu tinh dầu, nên bỏ một ít ở đầu và cuối quá trình để tránh lẫn nước ngưng, đảm bảo tinh dầu thu được không bị tạp chất, từ đó ảnh hưởng đến việc xác định hợp chất và công thức.

Thêm Na2SO4 khan vào bình chứa tinh dầu thô, vừa thêm vừa khuấy đều cho đến

Quy trình công nghệ chiết tách tinh dầu lá Trầu bao gồm việc để yên cho đến khi các tinh thể Na2SO4 bắt đầu rời ra và tinh dầu nổi lên trên Sau đó, tinh dầu sẽ được cho vào bình chiết để thu hồi phần tinh dầu đã loại bỏ nước.

Tinh dầu cần được bảo quản trong lọ tối màu để tránh tác động của ánh sáng Ánh sáng UV có thể làm hỏng các phân tử trong tinh dầu, dẫn đến sự hình thành gốc tự do và ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm Khi tinh dầu tiếp xúc với tia cực tím, một số thành phần có thể gia tăng trong khi những thành phần khác lại giảm đi đáng kể.

Ti ế n hành kh ả o sát các y ế u t ố ảnh hưởng đế n hi ệ u su ấ t tinh d ầ u

2.4.1 Khảo sát tỷ lệnước/nguyên liệu

Nước đóng vai trò quan trọng trong quá trình chiết xuất tinh dầu bằng cách thẩm thấu vào các mô nguyên liệu, hòa tan và khuếch tán các hợp chất hữu cơ Điều này giúp phá vỡ hệ keo trong tinh dầu, tạo điều kiện cho tinh dầu dễ dàng thoát ra Nếu thể tích dung môi không đủ, tinh dầu sẽ không khuếch tán hiệu quả, dẫn đến thời gian chưng cất kéo dài Thời gian tiếp xúc nhiệt lâu có thể khiến tinh dầu bị ngả vàng, giảm chất lượng Do đó, tỉ lệ nước trong quá trình chiết xuất ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu suất thu hồi tinh dầu.

Hình 2 2: H ệ th ống chưng cấ t tinh d ầ u lá Tr ầ u không t ạ i phòng thí nghiệm tinh dầu

Trong quá trình thực nghiệm, việc xác định lượng nước bổ sung khi ngâm nguyên liệu là rất quan trọng để đánh giá khả năng phân ly tinh dầu Yếu tố này ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả của quá trình chưng cất Đồng thời, lượng nước bổ sung cũng quyết định thời gian chưng cất tối ưu cho sản phẩm.

Thực nghiệm này được tiến hành với lượng nước/nguyên liệu theo đổi theo các tỉ lệ: 3/1; 4/1; 5/1; 6/1; 7/1

Để tiến hành chiết xuất tinh dầu từ lá trầu, trước tiên cần cân 500g lá trầu đã xử lý và cắt nhỏ, sau đó thêm nước với các tỷ lệ khác nhau như 3/1, 4/1, 5/1, 6/1, và 7/1 (v/w) Ngâm hỗn hợp trong khoảng 1 giờ để tăng diện tích tiếp xúc giữa lá và nước, từ đó thúc đẩy quá trình khuếch tán tinh dầu Tiếp theo, chuyển toàn bộ vào nồi chưng cất và lắp đặt hệ thống chưng cất trong 4 giờ dưới áp suất khí quyển Cuối cùng, ghi lại thể tích tinh dầu thu được trong cột ngưng tụ và so sánh với các thể tích khác nhau để xác định tỷ lệ nước/nguyên liệu tối ưu nhất.

Sơ đồ 2 2: Quy trình chi ết tách xác đị nh t ỷ l ệ nướ c/nguyên li ệ u

2.4.2 Khảo sát thời gian ngâm hỗn hợp

Thời gian ngâm là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến thể tích tinh dầu thu được, vì quá trình thẩm thấu của nước và khuếch tán các thành phần tinh dầu ra môi trường không thể diễn ra ngay lập tức, mà cần một khoảng thời gian nhất định để đạt hiệu quả tối ưu.

Sau khi xác định tỉ lệ nước/nguyên liệu thích hợp, dung dịch sẽ được ngâm chung với lá trầu

 Thực nghiệm: Xác định thời gian ngâm nhằm tìm ra thời gian mà lượng tinh dầu khi chưng cất được nhiều nhất

Thực nghiệm này được tiến hành theo thời gian ngâm thay đổi lần lượt là: 1h; 1,5h; 2h; 2,5h; 3h

Để tiến hành chiết xuất tinh dầu từ lá trầu, đầu tiên cần chuẩn bị 500g lá trầu đã qua xử lý, sau đó cắt nhỏ và ngâm trong nước với tỷ lệ 4/1 (v/w) Nguyên liệu được ngâm trong thời gian khảo sát, mỗi giờ thực hiện một mẻ riêng Tiếp theo, chuyển hỗn hợp vào nồi chưng cất và lắp đặt hệ thống chưng cất dưới áp suất khí quyển trong 4 giờ Khi hỗn hợp được gia nhiệt, hơi sẽ bay lên và đi qua ống sinh hàn, nơi tinh dầu sẽ ngưng tụ khi gặp lạnh, tạo thành hai lớp: lớp tinh dầu ở trên và lớp nước ở dưới Cuối cùng, đọc thể tích tinh dầu thu được.

Quy trình chiết tách tinh dầu được thực hiện bằng cách ngâm trong cột ngưng tụ có chia vạch thể tích, cho phép xác định thời gian ngâm tối ưu Bằng cách so sánh thể tích tinh dầu thu được ở các thời gian ngâm khác nhau, chúng ta có thể lựa chọn thời gian ngâm hiệu quả nhất để tối ưu hóa sản lượng tinh dầu.

2.4.3 Khảo sát thời gian chưng cất hỗn hợp

Thời gian chưng cất là yếu tố quyết định đến lượng tinh dầu thu được Nếu chưng cất quá ngắn, tinh dầu sẽ không được trích ly hoàn toàn, dẫn đến giảm thể tích sản phẩm Ngược lại, chưng cất quá lâu không chỉ tốn thời gian và năng lượng mà còn làm biến đổi màu sắc, mùi hương và chất lượng của tinh dầu.

Thực nghiệm nhằm xác định thời gian chưng cất tối ưu để thu được lượng tinh dầu tối đa, giúp tiết kiệm thời gian nghiên cứu và giảm thiểu lượng điện năng tiêu thụ trong quá trình gia nhiệt.

Thực nghiệm này được tiến hành theo thời gian chưng cất thay đổi lần lượt là: 180 phút; 210 phút; 240 phút; 270 phút; 300 phút

Để tiến hành thí nghiệm, đầu tiên, lấy 500g lá trầu đã được xử lý và cắt nhỏ Tiếp theo, thêm nước vào với tỷ lệ 4/1 (v/w) và ngâm nguyên liệu trong 1,5 giờ Sau khi ngâm, chuyển hỗn hợp vào nồi chưng và lắp đặt hệ thống chưng cất trong các khoảng thời gian 180, 210, 240 và 270 phút.

Sơ đồ 2 4: Quy trình chi ết tách xác đị nh th ời gian chưng cấ t

Trong quá trình chưng cất, hỗn hợp được gia nhiệt trong 300 phút dưới áp suất khí quyển, sau đó bay hơi và đi qua ống sinh hàn Tại đây, tinh dầu sẽ ngưng tụ khi gặp lạnh, tạo thành hai lớp: lớp tinh dầu ở trên và lớp nước ở dưới Đo thể tích tinh dầu thu được trong cột ngưng tụ có chia vạch thể tích và so sánh với các lần chưng cất khác nhau để xác định thời gian chưng cất tối ưu nhất.

Phương pháp xác đị nh m ộ t s ố ch ỉ s ố lí hóa c ủ a tinh d ầ u lá Tr ầ u không 37 1 Đánh giá c ả m quan

Phân tích chất lượng tinh dầu có thể thực hiện bằng cách quan sát các dấu hiệu bên ngoài như mùi, vị, màu sắc và độ trong suốt Những yếu tố này không chỉ giúp nhận diện tinh dầu mà còn phản ánh tính tinh khiết và độ an toàn của sản phẩm.

Màu sắc và độ trong suốt của tinh dầu được xác định bằng cách cho tinh dầu vào ống thủy tinh trong suốt 20 ml, lắc nhẹ và quan sát Ghi nhận các tính chất, cường độ màu sắc và độ trong suốt Nếu tinh dầu vẫn còn vẩn đục và không trong suốt, điều này cho thấy sự hiện diện của tạp chất và nước.

Mùi hương là một trong những đặc điểm quan trọng của tinh dầu Để xác định mùi, bạn có thể nhỏ một giọt tinh dầu lên giấy lọc hoặc bôi một ít lên mu bàn tay, sau đó ngửi cách vị trí có tinh dầu khoảng 20-30 mm Nên lặp lại việc ngửi mùi mỗi 15 phút trong vòng một giờ để ghi nhận và đánh giá bản chất cũng như cường độ của mùi hương.

Vị là một yếu tố quan trọng phản ánh đặc tính của tinh dầu, với mỗi loại tinh dầu mang một vị riêng biệt Để xác định vị của tinh dầu, người dùng có thể áp dụng phương pháp nếm, từ đó ghi nhận các đặc điểm như bản chất vị (ngọt, đắng,…) và cường độ vị (dịu, thoảng,…).

-Tỷ trọng của tinh dầu là tỷ số của khối lượng tinh dầu ở 25 o C với khối lượng của cùng một thể tích nước cất cùng ở nhiệt độ 25 o C

Để tiến hành thí nghiệm, trước tiên, cân ống tiêm có vạch chia chuẩn dung tích 1ml chính xác tới 0,001g để ghi lại kết quả G Sau đó, hút nước cất vào ống tiêm đến vạch 0,1ml, lưu ý không để bọt khí trong ống Đặt ống tiêm ở nhiệt độ 25 oC trong khoảng 30 phút và cân để có kết quả G1 Tiếp theo, đổ hết nước đi và vẩy cho khô, sau đó hút tinh dầu vào ống tiêm đến vạch 0,1ml Đặt ống tiêm ổn nhiệt ở 25 oC và tiến hành cân để ghi lại kết quả G2 Lặp lại quy trình này ba lần và ghi lại giá trị trung bình.

G: Khối lượng của ống tiêm không, (g)

G1: Khối lượng của ống tiêm khi có nước, (g)

G2: Khối lượng của ống tiêm khi có tinh dầu, (g)

Sau khi xác định tỷ trọng của tinh dầu, bước tiếp theo là tiến hành đo lường một số chỉ số hóa lý quan trọng Tất cả các chỉ số này được xác định dựa trên tinh dầu vừa được tách ra.

Phương pháp đị nh tính các thành ph ầ n trong d ị ch chi ế t lá Tr ầ u không 38 2.7 Phương pháp xác đị nh t ỷ l ệ kh ối lượ ng tinh d ầ u [5]

Cho vào ống nghiệm 3ml dịch chiết, sau đó cho từ từ thuốc thử theo thành ống nghiệm để yên, quan sát Dùng thuốc thử Wagner

 Nếu có alkaloid sẽ xuất hiện tủa màu nâu

Cho 3 ml dịch chiết vào trong 2 ống nghiệm Phương pháp này gồm thử nghiệm với dung dịch NaOH 10% và thử nghiệm với dung dịch FeCl 3 [11]

Thử nghiệm với dung dịch NaOH 10% cho thấy sự hiện diện của flavonoids trong dịch chiết Cụ thể, khi thêm 2 ml dung dịch NaOH 10% vào 3 ml hỗn hợp và lắc đều, nếu xuất hiện dung dịch màu vàng và sau đó chuyển sang không màu khi thêm acid hydrochloric, điều này chứng tỏ flavonoids có mặt trong mẫu thử.

Thí nghiệm với FeCl3 được thực hiện bằng cách nhỏ 3 giọt dung dịch FeCl3 bão hòa vào 3 ml hỗn hợp và lắc đều Sự chuyển màu của dung dịch sang màu xanh đen là minh chứng cho sự hiện diện của flavonoids trong dịch chiết.

Lắc 5ml ether và lấy lớp dịch phía trên Hút 1ml dịch chiết cho vào ống nghiệm, sau đó thêm từ từ 1ml dung dịch NaOH 10% và lắc nhẹ Phản ứng sẽ dương tính nếu lớp kiềm chuyển sang màu đỏ sim.

Cho 3 ml dịch chiết vào trong 2 ống nghiệm Phương pháp này thử nghiệm với thuốc thử Salkowski

Thuốc thử Salkowski: H2SO4 đậm đặc, nhỏ từ từ vào 3ml dịch chiết

 Nếu xuất hiện màu đỏ đậm, xanh, xanh tím là phản ứng dương tính

Trong thử nghiệm đầu tiên, 1ml dịch chiết được pha trộn với 2ml dung dịch NaCl và lắc đều Sau đó, 2ml hỗn hợp này được chuyển vào ống nghiệm, tiếp theo là thêm 3 giọt máu động vật bằng ống tiêm Ống nghiệm được đảo nhẹ nhàng và để yên trong 15 phút Sự lắng xuống của các tế bào hồng cầu chứng minh sự hiện diện của saponin trong dịch chiết.

Thử nghiệm 2 được thực hiện bằng cách lấy 3ml dịch chiết hòa tan trong nước cất, sau đó lắc mạnh trong 30 giây và để yên trong 30 phút Sự hình thành bọt khí không tan trong hỗn hợp cho thấy có sự hiện diện của saponin trong dịch chiết.

Lấy 2ml dịch chiết hòa tan trong 10 ml dung dịch cồn 50% Hút 4ml hỗn hợp vừa pha cho vào ống nghiệm:

Thử nghiệm FeCl3 cho thấy khi nhỏ 3 giọt dung dịch vào mẫu, màu sắc chuyển sang xanh lam hoặc xanh đen đậm, điều này chứng tỏ sự hiện diện của tannin trong mẫu.

2.7 Phương pháp xác định tỷ lệ khối lượng tinh dầu [5]

Sau khi chưng cất, tinh dầu sẽ lắng trong ống ngưng tụ cho đến khi tách thành hai pha riêng biệt: pha trên là tinh dầu và pha dưới là nước Để xác định thể tích tinh dầu, cần đọc chỉ số trên ống ngưng tụ có vạch đo thể tích Tiếp theo, tiến hành xác định tỉ lệ khối lượng của tinh dầu đã tách chiết.

Tỉ lệ khối lượng tinh dầu thu được theo công thức: η = 𝑉 𝑇𝐷 𝑚 𝑑 𝑇𝐷

Trong đó: η : Tỷ lệ khối lượng thu hồi tinh dầu (%)

𝑉𝑇𝐷 : thể tích tinh dầu thu được (ml)

𝑑 𝑇𝐷 : tỷ trọng của tinh dầu (g/ml)

𝑚 𝑁𝐿 : khối lượng nguyên liệu đem đi chưng (g)

Phương pháp xác định, đị nh danh các c ấ u t ử , thành ph ầ n hóa h ọ c có

Tại Viện Hàn Lâm Khoa Học Và Công Nghệ Việt Nam, các cấu tử trong tinh dầu lá Trầu không đã được phát hiện thông qua thiết bị sắc ký khí – ghép khối phổ Việc định danh các thành phần tinh dầu được thực hiện bằng phần mềm so sánh phổ full-MS và MS/MS của từng cấu tử với các phổ chuẩn trong thư viện.

Mức độ phù hợp giữa các chất trong mẫu nghiên cứu và chất đề nghị được xác định bằng đại lượng tương thích, với độ tương thích cao hơn đồng nghĩa với kết quả định danh chính xác hơn Khi phổ khối của chất phân tích trùng khớp hoàn toàn với phổ khối của chất chuẩn trong thư viện, độ tương thích đạt giá trị 1.000 Độ tương thích trên 800 được coi là có độ tin cậy cao trong kết quả phân tích.

Phương pháp xác đị nh ho ạ t tính kháng khu ẩ n c ủ a tinh d ầ u b ằng phương pháp đo đườ ng kính vòng kháng khu ẩ n [7]

- Môi trườ ng : Môi trường tăng sinh và tồn trữ TSB, môi trường thử hoạt tính kháng khuẩn MHA

- Chu ẩ n b ị độ đụ c McFarland 0,5 : độ đục này được chế bằng cách lấy 0,5ml BaCl2

Trộn 0,48M với 99,5ml H2SO4 0,35N, sau đó chia vào các ống có đường kính tương tự ống nghiệm chuẩn bị hỗn dịch vi khuẩn Các ống này cần được hàn kín và bảo quản ở nơi tối trong tủ lạnh, có thể sử dụng trong vòng 6 tháng Độ đục này tương ứng với

10 8 CFU/ml (Colony Forming Unit – đơn vị hình thành khuẩn lạc)

 Dung dịch 2% tinh dầu: tinh dầu được hòa tan trong DMSO 2% và TWEEN 80

- 0,2% với cỏc nồng độ khỏc nhau là: 1024 àl/ml, 512 àl/ml, 256 àl/ml, 128 àl/ml

 Dung dịch đối chứng âm gồm DMSO 2% và Tween 80 – 0,2% (tỷ lệ 1:1)

 Dung dịch đối chứng dương gồm các kháng sinh: Ampicilin 10𝜇g/ml, Tetracyclin

- Chu ẩ n b ị ch ủ ng vi sinh v ậ t th ử nghi ệ m:

 Các loại vi khuẩn sử dụng xác định hoạt tính kháng khuẩn: gồm ba chủng Gram âm (Salmonella typhi - ATCC 14028, Pseudomonas aeruginosa - ATCC 9027,

Escherichia coli – ATCC 25922); và hai chủng Gram dương (Staphylococus aureus - ATCC 6538, Bacillus cereus - VTCC 1005)

Cấy ria vi khuẩn tạo khuẩn lạc trên môi trường thạch MHA và bảo quản chúng trong ống thạch nghiêng ở nhiệt độ 4°C Từ ống lưu trữ, chọn 2-3 khuẩn lạc và chuyển vào ống nghiệm chứa 5ml môi trường TSB đã được khử trùng, sau đó nuôi cấy tĩnh ở 37°C.

Sau khi nuôi Staphylococcus aureus trong 24 giờ, huyền phù vi sinh vật được ly tâm để tách sinh khối Sinh khối này sau đó được pha loãng bằng nước cất vô trùng đến đạt độ đục 0,5 Mc Farland Nếu huyền phù quá đục, thêm nước cất; nếu chưa đủ đục, bổ sung thêm vi khuẩn, tạo ra hỗn dịch vi khuẩn khoảng 10^8 CFU/ml.

Để tiến hành thí nghiệm, trước tiên, dựng micropipet hút 100µl vi khuẩn với mật độ tế bào 10^8 CFU/ml và cấy lên bề mặt đĩa thạch MHA cho đến khi khô Sau đó, sử dụng đĩa giấy 6mm vô trùng đã thấm bão hòa dung dịch 2% tinh dầu, đặt lên bề mặt thạch đã cấy vi khuẩn và đè nhẹ để cố định Đĩa giấy ở giữa sẽ thấm dung dịch đối chứng âm, trong khi các đĩa xung quanh thấm dung dịch tinh dầu 2% và dung dịch đối chứng dương là kháng sinh Cuối cùng, chuyển các đĩa petri vào tủ lạnh ở 10°C trong khoảng 4 – 8 giờ để tinh dầu khuếch tán ra thạch, sau đó nuôi ở 37°C trong 16 – 18 giờ.

Sau 24 giờ nuôi cấy Staphylococcus aureus, kết quả được ghi nhận bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn Đường kính vòng vô khuẩn (D-d) được tính bằng cách lấy đường kính vòng kháng trừ đi đường kính đĩa giấy Mỗi nồng độ được thực hiện lặp lại 3 lần, và đường kính vòng kháng khuẩn được đo bằng đơn vị milimet (mm).

Phương pháp xử lí s ố li ệ u

- Xử lí số liệu bằng phần mềm MS Excel 2016

- Vẽ đồ thị bằng phần mềm MS Excel 2016

- Tính toán tỷ trọng bằng máy tính cầm tay Casio 570FX

Hình 2 3: Mô tả cách đo vòng tròn kháng khuẩn (Hudzicki, 2009)

KẾ T QU Ả TH Ự C NGHI Ệ M

KẾ T LU Ậ N VÀ KI Ế N NGH Ị