ta chỉ khảo sát trong 4 giờ nên khi cho nhiều nước sẽ làm thời gian bay hơi lâu hơn, lượng tinh dầu thu được sẽ thấp hơn.
3.1.2. Kết quảxác định thời gian ngâm ảnh hưởng đến tỷ lệ thu tinh dầu Bảng 3. 3: Các thông số sử dụng để khảo sát thời gian ngâm
STT Tên thông số Giá trị thông số
1 Tỷ lệnước/nguyên liệu 4/1
2 Thời gian ngâm Khảo sát
3 Thời gian chưng cất 240 phút
Thời gian ngâm sẽ thay đổi từ 60 phút cho đến khi lượng tinh dầu thu được giảm dần. Để lựa chọn được thời gian ngâm tối ưu cho quá trình chưng cất tinh dầu lá Trầu không, ngoài biểu đồ thể hiện tỷ lệ tinh dầu thu được phụ thuộc vào thời gian ngâm, ta còn phải dựa vào chất lượng tinh dầu tạo ra trong quá trình chưng cất để quyết định thời gian ngâm tối ưu cho quá trình chưng cất tinh dầu lá Trầu không.
Bảng 3. 4: Kết quả khảo sát thời gian ngâm ảnh hưởng đến tỷ lệ tinh dầu Thời gian Thời gian
ngâm ( phút) 60 90 120 150 180
Lượng tinh
Qua biểu đồ 3.2: Ta thấy ngoài việc tỷ lệ thu tinh dầu được cao còn phải xét đến khảnăng lôi cuốn của hơi nước ở các thời gian ngâm khác nhau và chất lượng tinh dầu. Các yếu tố này quyết định và ràng buộc lẫn nhau.
3.1.3. Kết quảxác định thời gian chưng cất ảnh hưởng đến tỷ lệ thu tinh dầu Bảng 3. 5: Các thông số sử dụng để khảo sát thời gian chưng cất Bảng 3. 5: Các thông số sử dụng để khảo sát thời gian chưng cất
STT Tên thông số Giá trị thông số
1 Tỷ lệnước/nguyên liệu 4/1
2 Thời gian ngâm 90 phút
3 Thời gian chưng cất Khảo sát
Kết quả thực nghiệm cho thấy hơi tinh dầu xuất hiện ở (60 – 80) 0C. Nhiệt độ chưng cất pha hơi khoảng 92,50C, tại nhiệt độ này tinh dầu cuốn theo hơi nước bay lên và ngưng tụ cùng với hơi nước, đồng thời nhiệt độ giữổn định trong suốt thời gian chưng cất.
Bảng 3. 6: Kết quả khảo sát thời gian chưng cất ảnh hưởng đến tỷ lệ tinh dầu
Thời gian
chưng (phút) 180 210 240 270 300 Lượng tinh
dầu 0,7ml 1ml 1,4ml 1,5ml 1,5ml
Biểu đồ 3. 2: Thể hiện lượng tinh dầu thu được phụ thuộc vào thời gian ngâm
1.3 1.4 1.3 1.1 0.8 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 60 90 120 150 180
Lượng tinh dầu thu được
Các dữ liệu ở bảng 3.6: Quá trình chưng cất sẽ khảo sát trong khoảng thời gian 180 – 300 phút, vì hơi nước bắt đầu bay hơi khoảng sau 120 phút tính từ lúc mở bếp đun và sau 300 phút thì lượng tinh dầu không thay đổi nhiều do hơi nước bay lên không còn tinh dầu nữa. Và lượng tinh dầu thu được nhiều nhất là khi chưng cất 270 phút. Lí do không lấy số liệu ở 300 phút là vì nếu chưng thêm 30 phút nữa mà tinh dầu vẫn như cũ thì chúng ta nên lấy số liệu ở 270 phút, chưng thêm chỉ tốn thời gian, có khi còn ảnh hưởng đến chất lượng tinh dầu (để tinh dầu ở nhiệt độ cao trong thời gian dài sẽ làm biến đổi một số thành phần).
Qua biểu đồ 3.3: Lượng tinh dầu sẽtăng dần khi ta tăng thời gian chưng cất. Tăng nhanh trong khoảng 180 phút đến 240 phút, sau 300 phút thì không thấy tăng thể tích tinh dầu nữa. Vậy nên thời gian chưng cất được chọn là 270 phút.
0.7 1 1.4 1.5 1.5 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 180 210 240 270 300 Lư ợn g t inh dầu thu đư ợc (m l)
Thời gian chưng cất Lượng tinh dầu thu được
3.2. Đề xuất quy trình chưng cất tinh dầu lá Trầu không
Thuyết minh quy trình:
Chuẩn bị nguyên liệu: Lá Trầu không đã qua chọn lọc (không sâu bệnh, nấm mốc, đạt độtrưởng thành) đem đi rửa sạch, đểráo nước, sau đó đem cân chính xác 500g lá và cắt nhỏ. Cho tỷ lệnước/nguyên liệu là 4/1 (v/w). Sau đó tiến hành:
- Ngâm với nước cất: chuyển toàn bộ lá đã cắt và nước vào nồi inox của thiết bị chưng cất, ngâm trong 90 phút.
- Chưng cất: tiến hành chưng cất dưới áp suất khí quyển, nhiệt độhơi nước 92,50C trong 270 phút để thu hồi tinh dầu. Hỗn hợp nước và tinh dầu bay hơi ngưng tụ ở ống sinh hàn khi gặp lạnh. Tinh dầu và hơi nước sẽđược chứa ở bộ phận ngưng tụ của thiết bị. để yên cho hỗn hợp phân thành hai lớp, cho lớp tinh dầu chảy qua bình chiết được tinh dầu thô.
- Làm khan: cho Na2SO4 vào bình chiết đựng tinh dầu thô, vừa cho vừa khuấy cho đến khi thấy các tinh thể Na2SO4 bắt đầu rời ra.
- Sản phẩm tinh dầu thu được cho vào lọ tối màu, tránh ánh sáng chiếu vào. Các tia
UV trong ánh sáng làm phá vỡ các phân tử, thúc đẩy hình thành các gốc tự do gây ảnh hưởng đến chất lượng tinh dầu. Bảo quản tinh dầu ở nhiệt độ 2 – 40C.
3.3. Kết quảxác định một số chỉ số lí hóa của tinh dầu lá Trầu không 3.3.1. Đánh giá cảm quan 3.3.1. Đánh giá cảm quan
a/ Màu sắc và độ trong suốt: có màu vàng nhạt, trong suốt không bị vẫn đục.
b/ Mùi: nồng, đặc trưng của tinh dầu Trầu không,
c/Vị: cay 3.3.2. Tỷ trọng
Bảng 3. 7: Kết quả trung bình cộng của ba lần cân ống tiêm đểđo tỷ trọng tinh dầu TB cộng TB cộng Ống tiêm không(G) 2,986 2,935 3,005 2,975 Ống tiêm chứa nước cất(G1) 4,14 4,081 4,135 4,118 Ống tiêm chứa tinh dầu Trầu không(G2) 4,013 3,97 4,023 4,002
Hình 3. 1: Mẫu tinh dầu chiết được tại phòng thí nghiệm tại phòng thí nghiệm
𝑑 = 𝐺−𝐺2
𝐺−𝐺1 = 2,975−4,0022,975−4,118 = 0,898
G: Khối lượng của ống tiêm không, (g). G1: Khối lượng của ống tiêm khi có nước, (g). G2: Khối lượng của ống tiêm khi có tinh dầu, (g).
3.4. Kết quảđịnh tính các thành phần trong dịch chiết lá Trầu không
Để xác định sơ bộ thành phần các chất có trong mẫu tinh dầu Trầu không khảo sát, tôi tiến hành định tính một số hợp chất có trong mẫu như đã trình bày ở phần 2.8 Kết quả ghi nhận được thể hiện ở bảng 3.8.
Bảng 3. 8: Kết quảđịnh tính các thành phần trong dịch chiết lá Trầu không
Thí nghiệm Kết quả Kếtluận
1.Định tính Ankaloid Thuốc thử Wagner - 2.Định tính Flavonoids Thử nghiệm NaOH 10% +
Thử nghiệm FeCl3 + 3.Định tính Anthraquinones Phản ứng Bomtra eger + 4.Định tính Steroid Thử nghiệm H2SO4đđ + 5.Định tính Saponin Thử nghiệm 1: + Thử nghiệm 2: + 6.Định tính Tanin
Thử nghiệm FeCl3
+
Nhận xét:Từ 6 thử nghiệm khảo sát định tính như trình bày, có 5 thử nghiệm có kết quả dương tính: Flavonoids; Anthraquinones; Steroid; Saponin; Tanin. Theo nghiên cứu của Nguyễn Nho Dũng (2011) thì dịchchiết lá trầu có chứa Ankaloid, nhưng theo nghiên cứu ở trên không có. Nguyên nhân có thể là do khác giống, khác điều kiện canh tác, đất đai, thời tiết nên dẫn đến kết quả không có sự giống nhau.
3.5. Kết quảxác định tỷ lệ khối lượng tinh dầu
Tỉ lệ khối lượng tinh dầu thu được theo công thức:
η = 𝑉𝑇𝐷 .𝑑𝑇𝐷
𝑚𝑁𝐿 = 1,5 .1,046500 = 0,27%
Trong đó:
η : Tỷ lệ khối lượng thu hồi tinh dầu (%) 𝑉𝑇𝐷 : thể tích tinh dầu thu được (ml)
𝑑𝑇𝐷 : tỷ trọng của tinh dầu (g/ml)
3.6. Kết quảxác định thành phần hóa học của mẫu tinh dầu là Trầu không đã được tối ưu bằng phương pháp sắc ký ghép khối phổ GC/MS được tối ưu bằng phương pháp sắc ký ghép khối phổ GC/MS
3.6.1. Sắc ký đồ tinh dầu lá Trầu không
Nhận xét: Qua kết quả trên sắc ký đồ, tôi nhận thấy có 18 giá trị có thời gian lưu khác nhau, điều đó có nghĩa trong mẫu tinh dầu lá Trầu không thu được có chứa 18 cấu tử, ứng với 18 hợp chất. Các cấu tửở những điểm peak: 14,994; 28,801; 21,47 có thời gian lưu cách xa nhau và có cường độtương đối lớn, chứng tỏ đây là những cấu tử có hàm lượng cao nhất trong tinh dầu. Các cấu tử còn lại có cường độ tương đối thấp nên có hàm lượng không đáng kể trong tinh dầu lá Trầu không. Cũng có một số cấu tử có thời gian lưu rất gần nhau, chúng có thểlà đồng phân của nhau như các cấu tửở peak: 21,592; 21,792.
3.6.2. Thành phần hóa học trong tinh dầu lá Trầu không
Bảng 3. 9: Kết quả phân tích thành phần hóa học của tinh dầu lá Trầu không
TT RT Tên chất lượHàm ng Mass
Độtương hợp khối phổ 1 5.079 -Pinene 0.629 136 945 2 6.840 Eucalyptol 0.642 154 941 3 7.093 β-Ocimene 0.493 136 952 4 8.212 Linalool 0.323 154 928 5 11.899 p-Allylphenol 0.755 134 911 6 14.289 Chavicol, acetate 2.337 176 957 7 14.994 Eugenol 33.142 164 938 8 15.198 -Copaene 0.334 204 915 9 15.563 β-Elemen 0.655 204 909 10 15.736 Methyleugenol 0.274 178 923 11 16.314 Caryophyllene 3.118 204 948 12 17.140 Humulene 0.794 204 943 13 17.653 -Muurolene 2.159 204 938 14 17.802 Germacrene D 5.017 204 942 15 18.172 (+)-Bicyclogermacrene 3.041 204 910 16 18.351 β-Bisabolene 0.672 204 823 17 18.800 Aceteugenol 28.801 206 918 18 18.920 (E)--Bisabolene 0.256 204 902 19 20.233 (-)-Globulol 0.381 222 915 20 20.425 (+)-Viridiflorol 0.375 222 905 21 20.637 Rosifoliol 0.166 222 858 22 21.207 1,10-Diepicubenol 0.178 222 856 23 21.470 2-(Acetyloxy)-4- allylphenyl acetate 14.749 234 901 24 21.592 -Cadinol 0.167 222 899 25 21.792 -Cadinol 0.543 222 911
Nhận xét: Theo bảng phân tích thành phần hóa học của mẫu tinh dầu lá Trầu không cho thấy có tổng cộng 25 cấu tửđược định danh, nhưng ở sắc ký đồ chỉ thể hiện 18 điểm peak có tên trên biểu đồ. Có lẽnguyên nhân là do điểm peak của các cấu tử còn lại có cường độ quá thấp nên không thể hiện được tên của các cấu tử lên biểu đồ. Kết quả bảng phân tích cho thấy thành phần tinh dầu của lá Trầu không tại Châu Đức, TP.Bà Rịa gồm 25 cấu tử và thành phần chính chủ yếu là: Eugenol chiếm 33,142%; Aceteugenol chiếm
28,801%; 2-(Axetyloxy)-4-allylphenyl acetate chiếm 14,749%; Germacrene D chiếm 5,017%; Caryophyllene chiếm 3,118%; (+)-Bicyclogermacrene chiếm 3,041%; Chavicol,acetate chiếm 2,337%; 𝛾-Muurolene chiếm 2,159%.
Kết quả chạy sắc ký phổ cho thấy diện tích peak của Eugenol có diện tích lớn nhất, vì vậy trong mẫu tinh dầu thì Eugenol là thành phần chủ yếu.
3.6.3. So sánh thành phần hóa học trong tinh dầu lá Trầu huyện Châu Đức, thành phố Bà Rịa với một sốvùng khác đã công bốở Việt Nam thành phố Bà Rịa với một sốvùng khác đã công bốở Việt Nam
Sau khi có kết quả thành phần hóa học tinh dầu Trầu không ở Châu Đức, Tp. Bà rịa tôi tiến hành so sánh thành phần hóa học tinh dầu Trầu không với các vùng khác đã công bốở Việt Nam. Thành phần tinh dầu ở Châu Đức, Tp. Bà rịa có 25 cấu tử, thành phần tinh dầu lá Trầu ở Hậu Giang có trên 8 cấu tử, thành phần tinh dầu lá Trầu ở Quãng Nam có 49 cấu tử, thành phần tinh dầu lá Trầu ở Hóc Môn, Tp. Hồ Chí Minh có 51 cấu tử và thành phần các cấu tửđược trình bày ở bảng 3.9.
Bảng 3. 10: So sánh thành phần hóa học trong tinh dầu lá Trầu ở huyện Châu Đức với các vùng khác ở Việt Nam STT Hợp chất Hàm lượng % I II III IV 1 Eugenol 33,142 - - - 2 Methyleugenol 0,274 34,55 8,34 6,31 3 Aceteugenol 28,801 20,14 16,55 13,68 4 Germacrene D 5,017 - 5,21 4,12 5 𝛾-Muurolene 2,159 1,33 - - 6 𝛼-Cadiol 0,543 5,51 - -
Trong đó: (I) Trầu ởChâu Đức, Tp.BR, (II) Trầu ở Hậu Giang [3], (III) Trầu ở Quãng Nam [1], (IV) Trầu ở Hóc Môn, Tp.HCM [1]
Nhận xét: Đối chiếu thành phần hóa học của tinh dầu lá Trầu ở huyện Châu Đức với các vùng khác ở Việt Nam tôi nhận thấy có sự khác nhau về các hợp chất trong bốn tinh dầu ở các vùng khác nhau. Trong khi hợp chất chủ yếu của tinh dầu lá Trầu ở huyện Châu Đức là Eugenol (33,142%) thì Methyleugenol (35,55%) là thành phần chiếm hàm lượng cao nhất trong tinh dầu lá Trầu ở Hậu Giang; và ở Quãng Nam với Hồ Chí Minh thì Aceteugenol lại chiếm hàm lượng cao nhất lần lượt là: 16,55% và 13,68%. Có sự
khác nhau trên có thểlà do điều kiện khí hậu, thỗnhưỡng và phương pháp trích ly tinh dầu. Ngoài ba hợp chất chính của Eugenol thì còn có ba hợp chất nữa là: Germacrene D, 𝛾-Muurolene, 𝛼-Cadiol, chứng tỏ tinh dầu tách chiết được ở phòng thí nghiệm Trường Đại học Bà Rịa – Vũng Tàu đem phân tích tại Viện Hàn Lâm Khoa Học Và Công Nghệ Việt Nam chính là tinh dầu Trầu không.
3.7. Kết quảxác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu bằng phương pháp đo đường kính vòng kháng khuẩn đo đường kính vòng kháng khuẩn
Khả năng kháng khuẩn được xác định dựa trên khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn được thể hiện qua đường kính kháng khuẩn được tạo ra trên đĩa Petri được trình bày ở bảng 3.8.
Bảng 3. 11: Đường kính vòng kháng khuẩn của tinh dầu lá Trầu không (mm)
STT Nồng độ µl/ml B. cereus E. coli S. typhi S. areus P. aeruginosa 1 1024 8,33±1,11 3,00±0,00 3,5±0,5 4,33±1,11 5,33±2,44 2 512 5,33±1,55 2,67±0,44 2,5±0,5 2,33±0,44 3,00±0,0 3 256 5,00±1,00 1,00±0,00 - 2,33±0,44 1,00±0,00 4 128 4,00±0,67 - - 1,3±1,00 - 5 Tetracyclin 2,67±0,89 4,00±0,00 5,00±0,00 8,00±0,00 6,00 ±0,00 6 Ampicilin 7,33±0,44 4,00±0,00 - - 2,00±0,00 7 Amoxycilin - - - - 3,00±0,00 8 DMSO 2% + TWEEN 80 0,2% - - - - -
Theo bảng 3.8 khi đánh giá sơ bộ về khả năng kháng khuẩn của tinh dầu lá Trầu không trên từng chủng vi khuẩn tôi rút ra một số nhận xét như sau:
1024 µl/ml có hoạt tính kháng khuẩncao nhất với kết quả là 8,33±1,11mm, hai nồng độ 512µl/ml và 256µl/ml không chênh lệch đáng kể kết quả lần lượt là 5,33±1,55 mm và 5,00±1,00mm. Nồng độ còn lại là 128µl/ml kết quả thu được là 4,00±0,67mm. Kết quả cho thấy hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu lá Trầu khôngđối với chủng B. cereus tương đối cao, nhận thấy tinh dầu lá Trầu không có khả năng kháng chủng này tốt kể cả ở nồng độ thấp. Hình 3. 3: Khảnăng kháng B. cereus của tinh dầu lá Trầu không (1): 1024 µl/ml, (2): 512µl/ml, (3): 256µl/ml, (4): 128µl/ml, (5): Tetracyclin, (6): Ampicilin, (7): DMSO 2% + Tween 80 0,2%
Trên chủng vi khuẩn E. coli, sau khi tiến hành khảo sát thì nhận thấy ở hai nồng độ 1024µl/ml và 512µl/ml khả năng kháng khuẩn không chênh lệch nhiều, chỉ ở mức 3,00±0,00mm và 2,67±0,44 mm. Nồng độ 256µl/ml khả năng kháng chỉ đạt 1,00±0,00mm và không kháng ở nồng độ 128µl/ml. Qua kết quả cho thấy, hoạt tính kháng vi khuẩn E. colicủa tinh dầu lá Trầu không rất thấp so với các chủng vi khuẩn còn lại.
(1): 1024 µl/ml, (2): 512µl/ml, (3): 256µl/ml, (4): 128µl/ml, (5): chứng âm DMSO 2% + Tween 80 0,2%, (6): chứng dương gồm 3 loại (a) Amoxylin, (b) Ampicilin, (c) Tetracyclin
Trên chủng vi khuẩn S. typhi, sau khi tiến hành khảo sát ta nhận thấy tinh dầu lá Trầu không chỉ kháng được vi khuẩn S. typhiở hai nồng độ 1024µl/ml và 512µl/ml, kết quả lần lượt là: 3,5±0,5mm và 2,5±0,5mm. Còn ở nồng độ 256µl/ml và 128µl/ml thì không có khả năng kháng S. typhi. Như vậy, qua kết quả cho thấy khả năng kháng vi khuẩn S. typhi của tinh dầu lá Trầu không cũng rất kém.
(1): 1024 µl/ml, (2): 512µl/ml, (3): 256µl/ml, (4): 128µl/ml, (5): chứng âm DMSO 2% + Tween 80 0,2%, (6): chứng dương gồm 3 loại (a) Amoxylin, (b) Ampicilin, (c) Tetracyclin
Trên chủng vi khuẩn S. aureus, các nồng độ khảo sát giảm dần vòng kháng khuẩn lần lượt là: 1024 µl/ml ứng với 4,33±1,11mm, 512 µl/ml và 256 µl/ml có cùng vòng kháng là