NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH NHÂN NHANH CÂY ARTICHOKE TRONG ĐIỀU KIỆN INVITRO

Artichoke (Cynara scolymus L.) thuộc họ Asteraceae là một loại cây thân thảo lâu năm (Bianco, 2000). Người ta thường sử dụng cây Artichoke như một loại dược phẩm vì nó có chứa hàm lượng cao các hợp chất phenolic, đặc biệt là cynarine (Pandino và cs., 2011); các hợp chất phenolic rất quan trọng cho cơ thể con người vì chúng có liên quan đến phòng chống ung thư, bệnh tim mạch, loãng xương, đái tháo đường và các bệnh thoái hóa thần kinh (Clifford, 2006). Artichoke được du nhập vào Việt Nam từ đầu thế kỷ XX và được trồng ở Sa Pa, Tam Đảo và nhiều nhất ở Đà Lạt (wikipedia). Cây Artichoke không chỉ là thương hiệu đặc sản mà còn là sản phẩm thế mạnh có hiệu quả kinh tế cao (bông Artichoke tươi lúc cao điểm có giá là 350.000 đồngkg) ở Đà Lạt nói riêng và trên thế giới nói chung. Hiện nay, nhân giống cây Artichoke chủ yếu thông qua tách chồi và sử dụng lại gốc cây mẹ (Falco và cs., 2015), nên lượng cây giống cần để cung cấp cho các hộ nông dân còn hạn chế. Do đó, nhân giống in vitro cây Artichoke có ưu điểm tạo ra những cây con sạch bệnh, khỏe mạnh và chất lượng cao với quy mô thương mại.Vì vậy, chúng em thực hiện đề tài: “Nghiên cứu quy trình nhân nhanh cây Artichoke trong điều kiện invitro.” nhằm đưa ra quy trình nhân giống cây Artichoke đạt năng suất về số lượng cũng như chất lượng.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Vật liệu

Nguồn mẫu cho thí nghiệm nhân nhanh chồi

Tại phòng thí nghiệm Công nghệ thực vật Đại học Yersin Đà Lạt, chúng tôi sử dụng các nguồn mẫu chồi Artichoke có sẵn, với kích thước từ 1,0 đến 1,5 cm Các chồi này được cắt bỏ lá để làm vật liệu cho thí nghiệm nhân nhanh chồi.

Nguồn mẫu cho thí nghiệm ra rễ in vitro

Các chồi có kích thước ≥ 2 cm sau giai đoạn nhân nhanh được cấy chuyền vào môi trường MS không bổ sung CĐHSTTV trong 10 ngày để cải thiện chất lượng chồi nuôi cấy Sau đó, các chồi này được cắt bỏ các lá già, chỉ giữ lại 2 - 3 lá, làm vật liệu nuôi cấy cho thí nghiệm ra rễ in vitro.

2.1.2 Giá thể nuôi cấy in vitro

Giá thể sử dụng trong nghiên cứu này là agar thương mại (Công ty cổ phần rau quả Việt Xô, Hải Phòng, Việt Nam)

Môi trường nghiên cứu sử dụng là môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962), có thể bổ sung hoặc không bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thực vật như cytokinin và auxin, tùy thuộc vào mục đích thí nghiệm pH của môi trường được điều chỉnh về 5.8 và được hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121°C, áp suất 1 atm trong 20 phút.

Các chồi được cấy trên môi trường khác nhau (MS, ắ MS, ẵ MS, ẳ MS) với thành phần bổ sung gồm 1 mg/L Kin, 0.5 mg/L BA, 30 g/L sucrose, 8 g/L agar thương mại, và pH được điều chỉnh về 5.8 (Ancora et al., 2010).

Các chồi được cấy trên môi trường khoáng tốt nhất ở thí nghiệm trên có bổ sung

Trong nghiên cứu này, nồng độ BA được sử dụng là 0,0; 0,3; 0,7; 0,9 và 1,0 mg/L kết hợp với nồng độ Kin là 0,0; 0,5; 1,0; 1,5 và 2,0 mg/L, cùng với 30 g/L sucrose, 8 g/L agar thương mại và pH được điều chỉnh về 5.8 Đối với môi trường ra rễ, môi trường MS được bổ sung IBA với các nồng độ 0; 2,0; 4,0; 6,0; 8,0 mg/L.

30 g/L sucrose và 8 g/L agar thương mại, pH được điều chỉnh về 5.8

2.1.4 Thiết bị và dụng cụ khác

Tủ cấy, cân phân tích, máy đo pH

Dụng cụ: Dao cấy, đĩa cấy, pank cấy, kéo, túi nuôi cấy nylon 120 x 250 mm không thoáng khí đã chiếu xạ vô trùng, cốc đong 20 mL và 50 mL,

Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm

2.2.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường khoáng lên sự nhân nhanh chồi cây Artichoke nuôi cấy in-vitro

Mục đích của thí nghiệm là khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ chất khoáng đến khả năng nhân nhanh chồi của cây Atichoke giống tím trong điều kiện nuôi cấy in vitro.

Trong thí nghiệm, các chồi được cấy vào túi nuôi cấy nylon chứa các môi trường khác nhau (MS, ắ MS, ẵ MS, ẳ MS) với sự bổ sung chất điều hòa sinh trưởng 1mg/L Kin, 0.5 mg/L BA, 30 g/L sucrose và 8 g/L agar thương mại, đạt pH 5,8 Mật độ nuôi cấy được thiết lập là 3 chồi/túi.

Chỉ tiêu theo dõi: Chiều cao cây (cm), số lá/cây, số chồi, khối lượng tươi (g), khối lượng khô (g) Kết quả được thu nhận sau 6 tuần nuôi cấy

2.2.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của cytokinin (BA kết hơp Kin) lên sự nhân nhanh chồi cây Artichoke nuôi cấy in-vitro

Mục đích thí nghiệm: Thí nghiệm được tiến hành nhằm khảo sát ảnh hưởng của

BA kết hợp Kin đến khả năng nhân nhanh chồi của cây Atichoke giống tím nuôi cấy in vitro

Trong thí nghiệm, các chồi được cấy trên môi trường khoáng tối ưu, bổ sung BA với các nồng độ 0,0; 0,3; 0,7; 0,9 và 1,0 mg/L, kết hợp với Kin ở nồng độ 0,0; 0,5; 1,0; 1,5 và 2,0 mg/L Môi trường còn chứa 30 g/L sucrose, 8 g/L agar thương mại và pH được điều chỉnh ở mức 5.8 Mật độ nuôi cấy là 3 chồi mỗi túi.

Chỉ tiêu theo dõi: Chiều cao cây (cm), số lá/cây, số chồi, khối lượng tươi (g), khối lượng khô (g) Kết quả được thu nhận sau 6 tuần nuôi cấy

2.2.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của auxin IBA đến khả năng tạo rễ cây Artichoke in-vitro hoàn chỉnh

Mục đích thí nghiệm: Thí nghiệm được tiến hành nhằm khảo sát ảnh hưởng của

IBA đến khả năng ra rễ của cây Atichoke giống tím nuôi cấy in vitro

Thí nghiệm được thực hiện với chồi dài 2 - 4 cm, có 2 - 3 lá thật, làm mẫu để khảo sát khả năng ra rễ Chồi được cấy vào túi chứa môi trường MS có bổ sung IBA với các nồng độ 0, 2,0, 4,0, 6,0 và 8,0 mg/L, cùng với 30 g/L sucrose và 8 g/L agar thương mại, điều chỉnh pH ở mức 5.8 Mỗi túi nuôi cấy chứa 9 cây.

Trong nghiên cứu này, các chỉ tiêu theo dõi bao gồm chiều cao cây (cm), số lượng rễ mỗi cây, chiều dài rễ (cm), số lá mỗi cây, khối lượng tươi (g) và khối lượng khô (g) Kết quả sẽ được thu thập sau 6 tuần nuôi cấy.

2.2.2 Phương pháp xử lý số liệu

Tất cả các thí nghiệm được thực hiện theo cách ngẫu nhiên hoàn toàn, với mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần, mỗi lần gồm 5 bịch và mỗi bịch chứa 3 mẫu Dữ liệu thu thập được đã được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel.

2016 và phần mềm SPSS 16.0 với phép thử Duncan và phép thử LSD (mức ý nghĩa p

Thời gian và địa điểm thực hiện nghiên cứu

2.3.1 Thời gian Đề tài được thực hiện từ tháng 2 năm 2021 đến tháng 5 năm 2021

2.3.2 Địa điểm Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực vật Đại học Yersin Đà Lạt (27 Tôn Thất Tùng, Phường 8, Tp Đà Lạt, Tỉnh Lâm Đồng).

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Kết quả ảnh hưởng của môi trường khoáng lên sự nhân nhanh chồi cây

Sau 6 tuần nuôi cấy trên các môi trường khoáng khác nhau để nhân nhanh chồi, hiệu quả nhân chồi cây Artichoke giống tím đã được ghi nhận và trình bày ở bảng 3.1 và hình 3.1 Ở thí nghiệm này số lượng chồi thu được nhiều nhất ở nghiệm thức nuôi cấy trờn mụi trường khoỏng ẳ MS tổng số chồi/cụm đạt 4,1 chồi/cụm, số lượng chồi giảm dần khi các mẫu được cấy trong các môi trường có nồng độ khoáng tăng, cụ thể , mụi trường khoỏng ẵ MS cho ra 3,26 tổng số chồi/cụm, mụi trường khoỏng ắ MS cho ra 1,8 tổng số chồi/cụm, môi trường khoáng MS cho ra 1,33 tổng số chồi/cụm Nhưng chiều cao chồi và chiều cao lỏ lại khỏ thấp Hơn nữa, ở mụi trường khoỏng ắ MS chỉ cao hơn 0,5 tổng số chồi/cụm nhưng chiều cao chồi và chiều cao lá lại sấp sỉ bằng môi trường khoỏng ẳ MS Mặc dự, mụi trường khoỏng ẳ MS cho kết quả tốt sau quỏ trỡnh nuôi cấy nhưng vẫn có ưu nhược điểm riêng

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của môi trường khoáng lên khả năng nhân nhanh chồi cây

Artichoke giống tím sau 6 tuần nuôi cấy

MS 1,33b* 1,21ab 1,58b 0,18b 0,2c 0,12b ắ MS 1,8b 1,4a 2,27a 0,24a 0,34bc 0,17b ẵ MS 3,26a 1,04b 1,94ab 0,17b 0,48ab 0,23b ẳ MS 4,1a 1,4a 1,8b 0,22ab 0,6a 0,4a

Ghi chú: *Những ký tự khác nhau (a, b, c…) trong cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa với độ tin cậy P ≤ 0,05 trong phép thử Duncan

Hình 3.1 Ảnh hưởng của môi trường khoáng lên khả năng nhân chồi cây Artichoke giống tím sau 6 tuần nuôi cấy.

Kết quả ảnh hưởng của cytokinin (BA kết hợp Kin) đến sự nhân nhanh chồi cây

- Ảnh hưởng của các nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Artichoke nuôi cấy in-vitro

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của BA lên khả năng nhân nhanh chồi cây Artichoke giống tím sau 6 tuần nuôi cấy

BA 1,0 2,8bcd 1,06bcde 1,5cd 0,18c 0,26cde

Hình 3.2 Ảnh hưởng của BA lên khả năng nhân nhanh chồi cây Artichoke giống tím sau 6 tuần nuôi cấy

Trong nghiên cứu về giống Artichoke tím, nghiệm thức bổ sung 1,5 mg/L BA cho thấy số lượng chồi thu được cao nhất, gấp 3,2 lần so với đối chứng Tuy nhiên, chất lượng chồi như chiều cao, chiều dài lá, chiều rộng lá và tỷ lệ tích lũy chất khô lại giảm đáng kể trong môi trường có chứa BA Hơn nữa, các chồi được nhân nhanh với 1,5 mg/L và 2,0 mg/L BA xuất hiện hiện tượng thủy tinh thể Mặc dù bổ sung BA kích thích tăng số lượng chồi, nhưng lại ảnh hưởng tiêu cực đến chất lượng của chúng.

- Ảnh hưởng của các nồng độ KIN đến khả năng nhân nhanh chồi cây Artichoke nuôi cấy in-vitro

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của KIN lên khả năng nhân nhanh chồi cây Artichoke giống tím sau 6 tuần nuôi cấy

KIN0,3 4abcd 1,62ab 2,18bc 0,32c 0,42bcde 0,02a

Hình 3.3 Ảnh hưởng của KIN lên khả năng nhân chồi cây Artichoke giống tím sau 6 tuần nuôi cấy

Nghiên cứu cho thấy, môi trường bổ sung KIN với nồng độ 0,5 mg/L đạt hiệu quả nhân chồi cao gấp 1,9 lần so với đối chứng, tạo ra chồi đồng đều, lớn và khỏe mạnh với lá màu xanh đậm Tuy nhiên, khi tăng nồng độ KIN lên 1 mg/L, hiệu quả nhân chồi và các chỉ tiêu sinh trưởng bắt đầu giảm Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây về vai trò của KIN trong việc thúc đẩy sự phát triển chồi trong giai đoạn nhân nhanh.

- Ảnh hưởng của BA 0,5 mg/L kết hợp KIN ở nồng độ (0,0; 0,5; 1,0; 1,5 và 2,0) mg/L lên khả năng nhân nhanh chồi cây Artichoke nuôi cấy in-vitro

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của BA 0,5 mg/L kết hợp KIN ở nồng độ (0,0; 0,5; 1,0; 1,5 và

2,0) mg/L lên khả năng nhân nhanh chồi cây Artichoke giống tím sau 6 tuần nuôi cấy

Hình 3.4 Ảnh hưởng của BA 0,5 mg/L kết hợp KIN ở nồng độ (0,0; 0,5; 1,0; 1,5 và

Sau 6 tuần nuôi, nồng độ 2,0 mg/L đã ảnh hưởng đến khả năng nhân chồi của cây Artichoke giống tím Trong môi trường bổ sung BA 0,5 mg/L kết hợp với KIN ở các nồng độ 0,0; 0,5; 1,0; 1,5 và 2,0 mg/L, số lượng chồi thu được cao nhất ở nghiệm thức BA 0,5 mg/L kết hợp KIN 0,9 mg/L, đạt gấp 2,9 lần so với đối chứng.

Nồng độ BA 0,5 mg/L khi không kết hợp đã dẫn đến sự giảm đáng kể các chỉ tiêu chất lượng chồi, bao gồm chiều cao chồi, chiều dài lá, chiều rộng lá và tỷ lệ tích lũy chất khô của cụm chồi (Bảng 3.2.3).

- Ảnh hưởng của BA 1,0mg/L kết hợp KIN ở nồng độ (0,0; 0,5; 1,0; 1,5 và 2,0) mg/L lên khả năng nhân nhanh chồi cây Artichoke nuôi cấy in-vitro

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của BA 1,0 mg/L kết hợp KIN ở nồng độ (0,0; 0,5; 1,0; 1,5 và

2,0) mg/L lên khả năng nhân nhanh chồi cây Artichoke giống tím sau 6 tuần nuôi cấy

Nghiên cứu cho thấy, sau 6 tuần nuôi, nồng độ 2,0 mg/L đã ảnh hưởng đến khả năng nhân chồi của cây Artichoke giống tím Môi trường bổ sung BA 1,0 mg/L kết hợp với KIN ở các nồng độ 0,0; 0,5; 1,0; 1,5 và 2,0 mg/L cho kết quả tốt nhất khi sử dụng BA 1,0 mg/L kết hợp KIN 0,3 mg/L và BA 1,0 mg/L kết hợp KIN 0,9 mg/L, với số lượng chồi thu được gấp 3 lần so với đối chứng Tuy nhiên, khi chỉ sử dụng môi trường có BA 1,0 mg/L mà không kết hợp, chất lượng chồi như chiều cao, chiều dài lá, chiều rộng lá và tỷ lệ tích lũy chất khô của cụm chồi đã giảm đáng kể.

Bảng 3.2.5 Ảnh hưởng của BA 1,5 mg/L kết hợp KIN ở các nồng độ (0,0; 0,5;

1,0; 1,5 và 2,0) mg/L lên khả năng nhân nhanh chồi cây Artichoke giống tím sau 6 tuần nuôi cấy

Nghiên cứu cho thấy, sau 6 tuần nuôi cấy, nồng độ BA 1,5 mg/L kết hợp với KIN 0,3 mg/L mang lại số lượng chồi cao nhất cho cây Artichoke giống tím, gấp 4,1 lần so với đối chứng Môi trường nuôi cấy này không chỉ tăng cường số lượng chồi mà còn cải thiện đáng kể các chỉ tiêu chất lượng như chiều cao chồi, chiều dài và chiều rộng lá, cũng như tỷ lệ tích lũy chất khô của cụm chồi Hình thái chồi nuôi cấy trên môi trường bổ sung cho thấy sự phát triển vượt trội, minh chứng cho hiệu quả của các hormone điều hòa sinh trưởng trong quá trình nhân giống cây Artichoke.

BA kết hợp KIN, có kích thước không đồng đều nhau, chồi vừa, yếu và lá có màu ngả sang vàng

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của BA 2 mg/L kết hợp KIN ở nồng độ (0,0; 0,5; 1,0; 1,5 và 2,0) mg/L lên khả năng nhân nhanh chồi cây Artichoke giống tím sau 6 tuần nuôi cấy

Hình 3.7 Ảnh hưởng của BA 2 mg/L kết hợp KIN ở nồng độ (0,0; 0,5; 1,0; 1,5 và

Nghiên cứu cho thấy, khi bổ sung BA 2,0 mg/L kết hợp với KIN ở các nồng độ khác nhau (0,0; 0,5; 1,0; 1,5 và 2,0 mg/L), số lượng chồi cây Artichoke giống tím tăng cao nhất ở nghiệm thức BA 1,5 mg/L kết hợp KIN 0,5 mg/L, đạt gấp 3,6 lần so với đối chứng Hầu hết các nghiệm thức trong môi trường nuôi cấy này đều có sự gia tăng đáng kể về chất lượng chồi, bao gồm chiều cao chồi, chiều dài lá, chiều rộng lá và tỷ lệ tích lũy chất khô Tuy nhiên, mặc dù BA thúc đẩy sự gia tăng số lượng chồi, nhưng lại làm giảm chất lượng của chồi được nhân nhanh.

Cytokinin đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của thực vật, giúp thúc đẩy phân chia và mở rộng tế bào cũng như kích thích sinh tổng hợp protein Do đó, cytokinin được ứng dụng rộng rãi trong việc nhân nhanh chồi và nâng cao hiệu quả vi nhân giống Trong số các loại cytokinin, BA và KIN là hai loại phổ biến nhất được sử dụng trong vi nhân giống cây Artichoke (El-Zeiny và cs., 2013; Catacora và cs., 2019).

BA và KIN đều có tác động tích cực đến hiệu quả nhân nhanh chồi cây Artichoke Tuy nhiên, BA thúc đẩy sự hình thành chồi Artichoke nhiều hơn so với KIN Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Brutti và cộng sự (2000) cũng như El-Zeiny và các cộng sự.

Nghiên cứu về cây Artichoke giống tím cho thấy, mặc dù BA kích thích gia tăng số lượng chồi, nhưng cũng gây hiện tượng thủy tinh thể, làm giảm chất lượng chồi, chứng tỏ BA không phù hợp cho giai đoạn nhân nhanh Cactacora và cộng sự (2019) đã chỉ ra rằng, chồi của ba giống Artichoke (L - 142, L - 70, L - 200) có tỷ lệ thủy tinh thể cao trên môi trường bổ sung BA Ngược lại, KIN không chỉ tăng số lượng chồi mà còn cải thiện đáng kể chất lượng chồi, với nhiều nghiên cứu khẳng định KIN có tác dụng tích cực trong giai đoạn nhân nhanh Do đó, chồi Artichoke giống tím chất lượng cao được nhân nhanh trên môi trường bổ sung 0,5 mg/L KIN sẽ là nguồn vật liệu cho các thí nghiệm tiếp theo Kết quả cho thấy, hiệu quả nhân chồi và chất lượng chồi cây Artichoke phụ thuộc vào điều kiện môi trường nuôi cấy và loại giống (kiểu gen).

Kết quả ảnh hưởng của auxin IBA đến khả năng tạo rễ cây Artichoke in-vitro hoàn chỉnh

Sau 6 tuần nuôi cấy trên môi trường bổ sung IBA, hiệu quả ra rễ cây Artichoke giống tím đã được ghi nhận và trình bày ở bảng 3.3 và hình 3.3

Nghiên cứu cho thấy, nồng độ 4,0 mg/L IBA mang lại hiệu quả ra rễ cao nhất với tỷ lệ 67,7%, gấp 30,77 lần so với đối chứng, trong khi các nồng độ thấp hơn 6,0 và 8,0 mg/L IBA chỉ đạt 7,7% và 51,1% Đặc biệt, nồng độ 2,0 mg/L IBA dẫn đến hiệu quả ra rễ giảm mạnh chỉ còn 7,7%, với rễ có cấu trúc xốp, dễ gãy và bị hoại tử Ngược lại, rễ phát triển bình thường ở nồng độ IBA cao hơn, đặc biệt là ở 4,0 mg/L, rễ vừa to vừa dài Chất lượng cây cũng được cải thiện rõ rệt với các chỉ tiêu như chiều cao cây, chiều dài rễ, khối lượng tươi và khối lượng khô tốt hơn so với đối chứng và các nghiệm thức khác.

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của IBA lên khả năng ra rễ cây Artichoke giống tím sau 6 tuần nuôi cấy

6 IBA 6,4ab 51,1ab 0,77bc 1,03ab 0,07a

Hình 3.8 Ảnh hưởng của IBA lên khả năng ra rễ cây Artichoke giống tím sau 6 tuần nuôi cấy.

Định dạng
Số trang	37
Dung lượng	1,61 MB