TỔNG QUAN
VÀI NÉT VỀ CHÈ XANH
1.1.1 Cây chè - Camellia sinensis (L.) O.Kuntze.
Cây chè, Camellia sinensis (L.) O.Kuntze thuộc chi Chè - Camellia, họ Chè -
Theaceae, thuộc ngành Hạt kín Angiospermatophyta, lớp Ngọc lan (hai lá mầm) Magnoliopsida, phân lớp Sổ Dilleniidae, bộ Chè Theales Năm 1753, Carl Von
Linnaeus, nhà khoa học Thụy Điển, đã phân loại chè thành hai giống chính: Thea bokea (chè đen) và Thea viridis (chè xanh), với nguồn gốc từ Vân Nam, Trung Quốc Hai giống chè này sau đó đã được phổ biến rộng rãi tại Việt Nam, Nhật Bản, Ấn Độ và nhiều quốc gia khác ở Châu Á.
Chè là cây xanh lưu niên, thường mọc thành bụi hoặc cây nhỏ, được xén tỉa để chiều cao dưới 2 mét nhằm thu hoạch lá Lá chè có kích thước từ 4-15 cm chiều dài và 2-5 cm chiều rộng Cây chè sở hữu rễ cái dài và hoa có màu trắng ánh vàng với đường kính khoảng 2,5 cm.
4 cm với 7 - 8 cánh hoa mọc ở kẽ lá, mùi thơm nhiều nhị Quả là một nang, thường có
3 ngăn nhƣng chỉ có một hạt do các hạt khác
Hình 1.1: Búp chè xanh teo đi
Hàng năm, sản lượng chè toàn cầu đạt 2,5 triệu tấn, trong đó 80% đến từ Châu Á, chủ yếu là Trung Quốc, Ấn Độ và Sri Lanka Tại Việt Nam, chè được trồng ở 33 tỉnh, với các vùng trồng chủ yếu như Phú Thọ, Tuyên Quang, Hà Giang, Thái Nguyên, Quảng Nam, Đà Nẵng, Lâm Đồng và Đắc Lắc Đến năm 2013, tổng diện tích trồng chè cả nước khoảng 125.000 ha, sản lượng đạt hơn 500.000 tấn, trong đó 70% là chè đen xuất khẩu, còn lại là chè xanh và các sản phẩm chè khác Năm 2013, Việt Nam đứng thứ 5 thế giới về xuất khẩu chè, với kim ngạch xuất khẩu đạt trên 110 thị trường khác nhau.
200 triệu đô la Mỹ Các thị trường lớn nhất của chè xanh Việt Nam là Pakistan, Đài Loan, Nga, Ba Lan, Trung Quốc, Hoa Kỳ [7-8].
1.1.2 Chè xanh trong thực phẩm và dƣợc phẩm Đồ uống trong văn hóa châu Á :
Chè là sản phẩm được chế biến từ búp, cuống và các lá non của cây chè Tùy thuộc vào các phương pháp chế biến khác nhau, chè được phân thành hai loại chính.
Chè xanh có màu nước pha xanh vàng, với vị đậm dịu và hương thơm tự nhiên đặc trưng Quy trình chế biến chè xanh bao gồm việc diệt men có sẵn trong nguyên liệu, sau đó vò và sấy để tạo ra sản phẩm cuối cùng.
Chè đen được chế biến qua quá trình lên men, không chỉ giúp giữ lại men mà còn tạo ra những biến đổi sinh hóa cần thiết, mang lại màu sắc và hương vị đặc biệt cho sản phẩm Nước pha chè đen có màu đỏ nâu sáng, vị dịu và hương thơm nhẹ nhàng.
Ngoài hai loại chè tiêu thụ chủ yếu hiện nay, còn có các loại chè khác như chè đỏ và chè vàng Các loại chè được ướp hương thường được gọi là chè hương, trong khi chè ở dạng cánh rời được gọi là chè rời Chè ở dạng bánh được gọi là chè bánh, và chè dạng bột (nước pha chè được cô đặc rồi sấy khô) được gọi là chè bột hay chè hòa tan Các loại chè này không chỉ được tiêu thụ mà còn được ứng dụng trong lĩnh vực dược và thực phẩm.
Nghiên cứu về cơ chế tác dụng sinh lý của chè đã bắt đầu phát triển mạnh mẽ từ thế kỷ 20, với các tác dụng trước đây thường được quy cho caffeine và vitamin C Từ thập niên 1970, những nghiên cứu về hóa sinh và hợp chất thiên nhiên đã chỉ ra vai trò quan trọng của catechin trong chè Nhiều công bố đã xác nhận tác dụng của polyphenol trong chè xanh đối với các bệnh ung thư, tim mạch, tiết niệu và tiêu hóa.
Alzheimer, bệnh Parkison, v.v ; ngoài ra polyphenol chè xanh còn có tác dụng làm giảm sự nhiễm độc do kim loại, do phóng xạ…[1, 10, 11].
Nghiên cứu tại trung tâm dinh dưỡng Unilever ở Hà Lan cho thấy, một số bệnh viện đã công nhận trà là thực phẩm có lợi cho sức khỏe Các nhà khoa học phát hiện rằng, việc uống đều đặn 3 chén trà mỗi ngày giúp giảm đáng kể khối lượng và hoạt động của các gốc tự do oxy hóa trong huyết thanh.
Chè xanh không chỉ giúp giải khát mà còn cung cấp dinh dưỡng và ngăn ngừa bệnh nhờ vào các hoạt chất sinh học trong lá chè Nguyên liệu này đã trở thành phần không thể thiếu trong nhiều món ăn và đồ uống như bánh kem chè xanh, bánh gatô chè xanh, và sandwich chè xanh, được ưa chuộng tại Việt Nam, Nhật Bản, Hàn Quốc, Anh, Mỹ và Úc Đặc biệt, Nhật Bản nổi bật với nhiều sản phẩm chế biến từ chè xanh, trong đó có chế phẩm Thea-flan (giàu catechin) và polyphenol chè xanh, góp phần nâng cao giá trị dinh dưỡng trong ẩm thực.
Bảng 1 1: Ứng dụng của chế phẩm polyphenol chè xanh trong chế biến thực phẩm
Hàm lƣợng sử dụng Lĩnh vựcsử dụng Công dụng đối với các sản phẩm
-Dầu ăn thông thường (dầu thực vật, dầu đậu tương, dầu cọ, mỡ lợn );
- Thực phẩm chứa dầu (snack food, 0,01-0,5% 0,002-0,2%
Chất bảo quản thực phẩm rán, margarin ); chống ôxi hóa
- Dầu có chứa các axít béo bão hòa 0,1 - 1,0 % 0,2 - 0,3 % phân tử lƣợng lớn;
- Kéo dài thời gian sử dụng của các 0,01-0,5% thực phẩm chế biến từ hải sản;
- Thực phẩm khô nhƣ bột cá; 0,01 - 0,1 %
-Chống nhạt màu của các chất màu 0,01-0,5% 0,05-0,3% tự nhiên.
Kiểm soát mầm - Tất cả thực phẩm thông thường 0,1 - 0,5 % 0,05 - 0,3 % bệnh
Khử mùi - Thực phẩm chống hôi miệng (bánh 0,1 - 0,5 % ≤0,2% kẹo, kẹo cao su)
- Đồ uống cho sức khỏe 0,1 - 0,3 %
- Chống sâu răng, viêm lợi (kẹo, Thực phẩm y tế bánh);
-Ức chế tăng cholesterol (sử dụng trong hămbơgơ, thịt băm, xúc xích, 0,1-2% thực phẩm rán cho người ăn kiêng).
THÀNH PHẦN HOẠT CHẤT CỦA CHÈ XANH
Thành phần hóa học của chè bao gồm tannin, caffeine, protein, tinh dầu, men, sắc tố, pectin, vitamin, chất khoáng và axít hữu cơ, trong đó tannin, caffeine, sắc tố và tinh dầu là những yếu tố quyết định màu sắc và hương vị của sản phẩm Tannin, một hỗn hợp polyphenol với catechin là thành phần chủ yếu, đóng vai trò quan trọng trong quá trình sản xuất chè xanh Men polyphenol oxidase oxy hóa các polyphenol đã bị bất hoạt bởi nhiệt độ, giữ nguyên hàm lượng polyphenol trong chè xanh so với lá chè Các hợp chất phenol từ lâu đã được coi là chỉ số quan trọng để đánh giá chất lượng chè, đặc biệt là trong chè đen, giúp xác định giá trị thị trường và phân loại các giống chè khác nhau.
Chất lượng chè theo mùa được xác định chủ yếu bởi theaflavin, trong khi chè xanh chứa catechin và các gallate, cùng với các hợp chất phenol tổng số, được coi là chỉ số quan trọng để đánh giá chất lượng và giá trị của chè Do đó, việc phân tích các hợp chất phenol trong chè là rất cần thiết để xác định và mô tả các tính chất của sản phẩm này.
1.2.1 So sánh chất lƣợng nguyên liệu theo vùng trồng chè xanh ở Thái Nguyên, Phú Thọ, Mộc Châu [73]
Nghiên cứu được thực hiện vào năm 2010, tập trung vào việc lựa chọn và lấy mẫu đọt chè tươi 1 tôm 3 lá từ các vùng trồng chè ở miền Bắc như Thái Nguyên, Phú Thọ và Mộc Châu vào buổi sáng sớm Phân tích thành phần cơ giới và hàm lượng polyphenol trong chè xanh thu hái từ các vùng và vụ khác nhau đã cho ra kết quả chi tiết, được trình bày trong bảng 1.2 và bảng 1.3.
Bảng 1 2 : Thành phần cơ học nguyên liệu 1 tôm 3 lá
Vùng chè Tôm Lá 1 Lá 2 Lá 3 Cuộng Tổng g % g % g % g % g % (g)
Bảng 1 3 : Thành phần polyphenol nguyên liệu chè theo vùng và vụ thu hái
Thu 20,45 16,78 20,18 Đông 18,1 15,2 17,85 Đơn vị: % tính theo hàm lượng khô
Kết quả phân tích từ bảng 1.2 và 1.3 cho thấy không có sự chênh lệch đáng kể về trọng lượng và tỷ lệ các thành phần của đọt chè giữa các mẫu từ Thái Nguyên, Phú Thọ và Mộc Châu Tuy nhiên, chè Mộc Châu và Thái Nguyên nổi bật với độ đồng đều về màu sắc, tỷ lệ già/bánh tẻ và hương vị hơn so với chè Phú Thọ Do đó, chè xanh Thái Nguyên đã được chọn làm đối tượng nghiên cứu cho luận án.
Các catechin và hợp chất gallate của chúng, thường được gọi là catechin chè xanh, chiếm khoảng 30% trọng lượng khô Chúng thuộc phân lớp flavan-3-ol, hay còn gọi là flavanol, trong họ flavonoid Các hợp chất này có cấu trúc C6-C3-C6 độc đáo, bao gồm ba vòng phenol được ký hiệu là A, B và C, với mức độ hydroxyl hóa khác nhau Cấu trúc này và sự định hướng tương đối của các thành phần trong phân tử quyết định hoạt tính sinh học của catechin và các chất chuyển hóa của chúng.
Hình 1 1: Công thức tổng quát của Catechin
Trong cấu trúc catechin, có thể có tới 24 loại catechin khác nhau khi sắp xếp theo cấu hình tuyệt đối và các nhóm thế Tuy nhiên, cho đến nay, chỉ có 12 catechin đã được phân lập và xác định cấu trúc từ chè xanh.
Catechin là một nhóm hợp chất quan trọng trong chè xanh, bao gồm các loại như EC, C, EGC, GC, và catechin gallat như ECG, CG, GCG, EGCG Ngoài ra, hai catechin digallat là epicatechin digallat (ECDG) và epigallocatechin digallat (EGCDG) cũng thuộc nhóm catechin gallat Gần đây, các hợp chất mới như (-)-epicatechin-3-(3-O-methylgallate) và (-)-epigallocatechin-3-(3-O-methylgallate) đã được phát hiện trong chè tự nhiên Tỷ lệ phần trăm mol và hàm lượng catechin trong các loại chè khác nhau cũng như các bộ phận của chè xanh được trình bày chi tiết trong các bảng 1.4, 1.5, và 1.6.
Bảng 1 4: Các catechin đã được phân lập trong chè xanh
Stt Tên Viết tắt Tỉ lệ (% mol)
Bảng 1 5: Hàm lượng các catechin chủ yếu trong các loại chè khác nhau
Chè xanh Chè đen Chè 0oLong
Caffeine 3.83 4.74 2.91 Đơn vị: % tính theo hàm lượng khô Bảng 1 6: Thành phần catechin trong các bộ phận chè xanh [16]
Catechin Lá thứ 1 Lá thứ 2 Lá thứ 3 Lá già Cuộng
Tổng lƣợng catechin 886,69 910,31 786,11 701,82 737,40 Đơn vị: mg/g chế phẩm chiết bằng ethyl acetate
Kết quả phân tích cho thấy hàm lượng catechin trong chè xanh vượt trội hơn so với chè đen và chè ôlong, với Epigallocatechin gallat (EGCG) là thành phần polyphenol chính, chiếm khoảng 10 - 50% tổng lượng catechin EGCG nổi bật với khả năng chống ôxy hóa, chống ung thư và tính đề kháng cao nhất trong các catechin của chè xanh, có hoạt tính chống ôxy hóa gấp 100 lần vitamin C và 25 lần vitamin E Nó đã được chứng minh là hiệu quả trong việc ức chế các tác nhân gây ung thư, điều trị bệnh tim mạch và phòng ngừa xơ vữa động mạch bằng cách giảm tích tụ gốc tự do, ngăn cản ôxy hóa lipid trong máu, giảm LDL-cholesterol và tăng HDL-cholesterol Nhờ những lợi ích này, chè xanh được cho là có khả năng chống lão hóa mô và kéo dài tuổi thọ con người.
Tính chất hóa học chung của các catechin [32-36]:
Các nghiên cứu hóa học và cấu trúc chỉ ra rằng catechin cùng với các hợp chất gallate của chúng có khả năng hấp phụ quang phổ tử ngoại trong khoảng bước sóng từ 266 nm.
Trong dung môi ethanol, các catechin có bước sóng hấp phụ cực đại lần lượt là: EC tại 280 nm, GCG tại 275 nm, ECG từ 279 đến 280 nm, EGC ở 271 nm và EGCG tại 275 nm.
Catechin là một hợp chất không màu, thường xuất hiện dưới dạng tinh thể kim hoặc lăng trụ Chúng có vị chát với mức độ khác nhau và để lại hậu vị ngọt Đặc biệt, hai chất EGC và EGCG có vị chát hơi đắng khi ở dạng tự do, nhưng chuyển sang vị chát dịu khi được chuyển hóa thành các dicatechin.
Catechin là hợp chất dễ tan trong nước nóng, ancol, acetone và ethyl acetate, nhưng không tan trong benzene và chloroform Tính tan tốt trong nước và ethyl acetate của catechin đã được ứng dụng phổ biến trong ngành công nghiệp sản xuất từ hỗn hợp tannin chè xanh.
Các chất catechin phản ứng với FeCl3, tạo ra màu sắc khác nhau như xanh lá cây hoặc xanh da trời, tùy thuộc vào sự hiện diện của các nhóm hydroxyl trong cấu trúc phân tử.
Các chất catechin có tính khử mạnh nên dễ dàng bị ôxy hóa bởi dung dịch
KMnO4 trong môi trường axit và bởi dung dịch I2 trong môi trường kiềm, chúng có thể tự ôxy hóa trong không khí ẩm.
Dưới tác động của men peroxydase hoặc nhiệt độ cao, catechin trong lá chè bị ôxy hóa, dẫn đến sự hình thành các sản phẩm ôxy hóa thứ cấp Những sản phẩm này tham gia vào hàng loạt phản ứng hóa học, góp phần tạo nên hương vị đặc trưng cho các loại chè Cuối cùng, các sản phẩm ôxy hóa tích tụ lại, tạo ra các hợp chất màu vàng chuyển dần sang màu đỏ, đặc trưng cho màu nước chè đen.
Caffeine là hoạt chất chính trong chè xanh, mang lại cảm giác hưng phấn và được sử dụng phổ biến trong dược phẩm cũng như nước giải khát có gas Khi hòa tan trong nước chè nóng, caffeine tạo ra hương thơm và làm giảm vị đắng nhờ khả năng tạo muối tannate với tannin Hàm lượng caffeine trong chè xanh thay đổi theo mùa, đạt đỉnh vào tháng 7 với 4% trong chè khô Caffeine thăng hoa ở nhiệt độ 100°C, dẫn đến khoảng 10% caffeine bị mất trong quá trình sao sấy và chế biến chè xanh.
Nước : Chiếm 75 - 80 % lá chè tươi , hàm lượng nước giảm dần tưừ láđến thân
HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA EGCG VÀ CÁC CATECHIN CHÈ XANH
Chè xanh và các catechin trong chè xanh có hoạt tính chống oxy hóa, đã được thử nghiệm và đánh giá hiệu quả trong việc phòng ngừa các bệnh liên quan đến các loại oxygen phản ứng (ROS), bao gồm ung thư, bệnh tim mạch và thoái hóa thần kinh Nghiên cứu dịch tễ học và mô hình động vật cho thấy chè xanh có khả năng bảo vệ chống lại nhiều loại ung thư như ung thư vú, da, tuyến tiền liệt và phổi Ngoài ra, chè xanh và EGCG cũng có hoạt tính chống sinh thành mạch, ngăn chặn sự hình thành mạch máu của khối u, cùng với khả năng chống gây đột biến.
Chè xanh có khả năng giảm cholesterol và ngăn ngừa sự phát triển của xơ vữa động mạch Nó đã được chứng minh có tác dụng bảo vệ cơ thể chống lại các bệnh lý liên quan đến tuổi tác như Parkinson, Alzheimer và tai biến do thiếu máu cục bộ Ngoài ra, chè xanh cũng cho thấy hiệu quả chống bệnh tiểu đường trong các mô hình động vật kháng insulin.
[42, 43] và thúc đẩy tiêu hao năng lƣợng [44] Ngoài ra chè xanh còn là chất kháng khuẩn [45], chống HIV [46], chống lão hóa [47] và chống viêm [48].
Chè xanh mang lại nhiều lợi ích sức khỏe chủ yếu nhờ vào hoạt tính chống oxy hóa và khả năng tiêu diệt các gốc tự do của catechin Hoạt tính này xuất phát từ sự hiện diện của các nhóm phenolic hydroxy trên vòng B của catechin như EC và ECG, cũng như trên các vòng B và D của gallocatechin như EGC và EGCG Ba nhóm hydroxy trên vòng B đã được chứng minh là quan trọng trong việc tăng cường hoạt tính chống oxy hóa và khả năng tiêu diệt gốc tự do của catechin Bên cạnh đó, khả năng bắt giữ kim loại của catechin cũng đóng vai trò quan trọng trong hoạt tính chống oxy hóa Nghiên cứu gần đây của Mandel đã chỉ ra rằng rối loạn chuyển hóa sắt có thể là nguyên nhân chính gây bệnh Parkinson, do đó, hoạt tính bắt giữ kim loại của EGCG rất quan trọng trong việc bảo vệ tế bào thần kinh khỏi bệnh thoái hóa này.
Chè xanh không chỉ có tác dụng chống oxy hóa mà còn ảnh hưởng đến các phân tử và tế bào tham gia vào con đường truyền tín hiệu liên quan đến quá trình chết tế bào được lập trình (apoptosis) Những tác động này đã được xác nhận ở cả tế bào thần kinh và tế bào biểu mô/nội mô khối u Tuy nhiên, vẫn chưa rõ liệu các tác động này là kết quả của sự cân bằng giữa các chất pro-oxidant và antioxidant trong tế bào hay do tác động trực tiếp của EGCG và các catechin lên các phân tử mục tiêu, độc lập với hoạt tính chống oxy hóa của chúng Hơn nữa, hầu hết các cơ chế phân tử hiện tại chủ yếu dựa trên các nghiên cứu về nồng độ EGCG in vitro, mà nồng độ này thường vượt xa nồng độ thực tế trong cơ thể.
Các catechin trong trà xanh có khả năng kháng u bằng cách kìm hãm sự phát triển của tế bào khối u, ức chế các chu kỳ tế bào và ngăn chặn quá trình tạo mạch cũng như sự xâm lấn do hormone tăng trưởng EGCG đã chứng minh hiệu quả trong việc điều trị ung thư vú và ung thư tiền liệt tuyến thông qua việc ức chế các yếu tố tăng trưởng và protein p21, p27 Đồng thời, EGCG còn ức chế hoạt động của NF-κB và AP-1, hai yếu tố phiên mã quan trọng, từ đó giảm hoạt động pro-inflammatory và tăng cường khả năng chống oxy hóa Việc tiêu diệt gốc tự do của catechin trà xanh cũng góp phần ức chế NF-κB, làm giảm biểu hiện của các gen liên quan đến viêm và sự sống sót của tế bào Hơn nữa, EGCG trực tiếp ức chế hoạt tính proteasome, dẫn đến sự tích lũy các protein kìm hãm NF-κB và các protein pro-apoptosis như Bax Cơ chế này tương tự như việc ức chế nitric oxide syntase, enzyme quan trọng trong các hoạt động chống viêm Cuối cùng, trà xanh còn ngăn chặn sự hình thành mạch và xâm lấn của khối u thông qua việc bất hoạt metalloproteinase và ảnh hưởng đến thụ thể của yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu trong tế bào nội mô và tế bào khối u.
Các catechin trong tế bào thần kinh có khả năng bảo vệ tế bào ở nồng độ thấp, trong khi nồng độ cao hơn lại thể hiện khả năng tiêu diệt các tế bào ung thư.
Nhiều nghiên cứu cho thấy catechin, đặc biệt là EGCG, có khả năng bảo vệ tế bào thần kinh nhờ hoạt tính chống oxy hóa và khả năng điều chỉnh các con đường tín hiệu tế bào Ở nồng độ 1-10 µM, EGCG đã chứng minh khả năng chống lại sự chết tế bào do β-amyloid và 6-hydroxydopamine gây ra bằng cách kích hoạt protein kinase C (PKC), một yếu tố quan trọng cho sự sống còn của tế bào thần kinh Việc giảm hoạt động của PKC có thể dẫn đến sự tích tụ amyloid-β và các độc tố thần kinh khác EGCG ở liều thấp còn làm giảm sự biểu hiện của các gen proapoptotic như BAX, BAD, caspase, và p21, từ đó thể hiện hoạt tính bảo vệ hệ thần kinh Ngoài ra, EGCG cũng ảnh hưởng đến quá trình chế biến protein tiền chất amyloid (APP) thông qua việc tăng cường con đường α-secretase và ức chế con đường β-secretase, làm giảm sự tổng hợp sợi β-amyloid.
Ảnh hưởng của EGCG và các catechin trong trà xanh lên tế bào phụ thuộc vào liều lượng và loại tế bào, không chỉ đơn thuần là hoạt tính chống oxy hóa và tiêu diệt gốc tự do Hiệu quả in vivo của trà xanh liên quan chặt chẽ đến liều lượng và dược động học Với việc trà xanh được sử dụng rộng rãi để nâng cao sức khỏe, việc hiểu rõ mối quan hệ giữa hoạt tính, liều lượng và loại tế bào là rất quan trọng Mặc dù các nghiên cứu vẫn đang tiếp tục, trà xanh đã được tiêu thụ hàng thế kỷ ở châu Á mà không ghi nhận độc tính, cho thấy các catechin, đặc biệt là EGCG, có tiềm năng trở thành một lớp dược chất mới Các hoạt chất này lý tưởng nên có khả năng bảo vệ tương tự như trà xanh mà không cần thay đổi lối sống, như việc tiêu thụ nhiều tách trà mỗi ngày.
1.3.2 Hoạt tính chống ôxy hóa[11, 49]
Hoạt tính chống ôxy hóa của catechin được xác định bởi các nhóm hydroxy phenyl trên vòng C - và cấu trúc 3,4,5-trihydroxyphenyl đóng vai trò quan trọng nhất trong khả năng dọn gốc tự do Các hợp chất catechin không galloyl như EC và EGC, cùng với các este galloyl như ECG và EGCG, có hoạt độ chống ôxy hóa được sắp xếp theo thứ tự EGCG > ECG > EGC > EC Nghiên cứu của Rice-Evans cho thấy EGCG có khả năng dọn gốc tự do mạnh mẽ hơn cả vitamin C và E.
1.3.3 Hoạt tính diệt khuẩn, kháng viêm, kháng virus [45,46,48]
Tháng 8/1996 giáo sư T Shimamura tại trường đại học y khoa Showa (Nhật
Bản) đã có công trình diễn thuyết "về tác động diệt khuẩn E-coli-157" tại hội thảo chuyên đề diệt khuẩn của chè xanh.
Catechin, hợp chất tạo nên vị đắng của chè xanh, có khả năng tiêu diệt hầu hết các vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm và loại bỏ độc tố mà chúng tiết ra, đặc biệt là veratoxin từ E coli -157.
Uống chè xanh trong và sau bữa ăn có thể tối ưu hóa tác dụng của catechin, giúp tiêu diệt vi khuẩn hiệu quả Các nghiên cứu cho thấy chè xanh ngâm trong nước muối với nồng độ 2,5% - 5% sẽ phát huy tác dụng diệt khuẩn tốt hơn Khi ngâm chè xanh trong nước nóng, lượng catechin giải phóng cũng tăng lên, cải thiện khả năng diệt khuẩn Tuy nhiên, các nhà nghiên cứu khuyến cáo không nên uống chè xanh trước bữa ăn, đặc biệt là trà nóng, vì điều này có thể làm giảm cảm giác ngon miệng do dịch vị tiết ra trong miệng.
Chè xanh không chỉ được biết đến với khả năng ngăn ngừa sâu răng mà còn thu hút sự chú ý gần đây nhờ EGCG, một hợp chất có khả năng ức chế lây nhiễm HIV và kháng đa thuốc Staphylococcus aureus EGCG hoạt động bằng cách ức chế enzyme sao chép ngược HIV-1 và cản trở quá trình bám dính của virus Nghiên cứu của Kawai đã chỉ ra rằng EGCG ngăn chặn sự bám dính của virion HIV-1, gp120 và phân tử CD4 lên bề mặt tế bào miễn dịch T-help, từ đó ngăn ngừa bước đầu tiên của sự lây nhiễm HIV-1 Thêm vào đó, nghiên cứu của Chang và các cộng sự đã chứng minh rằng các catechin như epigallocatechin, epicatechin gallat và epigallocatechin gallat được chiết xuất từ chè xanh có nhiều lợi ích sức khỏe.
Camellia sinensis L - có tác dụng ức chế, gây miễn nhiễm với vi rút HIV, IC50 của epigallocatechin là 7,8; của epicatechin gallat là 0,32 và của epigallocatechin gallat là 0,63 mmol [46].
1.3.4 Một sốnghiên cứu ứng dụng các catechin phòng và trị ung thƣ [32,33]
Chè xanh chứa các polyphenol quan trọng, đặc biệt là EGCG, giúp phòng chống ung thư nhờ vào khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ Hoạt chất này ngăn chặn các peroxidase, từ đó ức chế sự sao chép nhân bản ở tế bào ung thư.
Trong giai đoạn đầu của tế bào ung thư, EGCG có khả năng ức chế AP-1, một chất dẫn truyền quan trọng trong sự phát triển của tế bào ung thư da Nó cũng ngăn chặn protein kinase, enzyme kích hoạt tế bào trong quá trình phát triển ung thư, và ức chế hoạt động của telomerase, dẫn đến việc giảm thời gian sống của tế bào ung thư.
Trong quá trình phát triển ung thư, EGCG có khả năng can thiệp và ức chế hoạt động của urokinase, một enzyme quan trọng trong sự phát triển và biến đổi của tế bào ung thư Nó cũng có tác dụng phá hủy các dạng biến đổi đặc thù của tế bào do adenovirus gây ra, cũng như ngăn chặn quá trình tổng hợp ADN trong các loại tế bào ung thư như hepatoma, leukemia và ung thư phổi.
CÁC NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ HÓA HỌC CHIẾT, TÁCH VÀ ĐIỀU CHẾ CÁC CATECHIN VÀ DẪN XUẤT
1.4.1 Các kỹ thuật công nghệ chiết catechin từ chè xanh
Hiện nay, việc chiết xuất các hợp chất catechin từ chè xanh, hay còn gọi là polyphenol chè xanh, đang được áp dụng phổ biến tại Trung Quốc và trên toàn thế giới.
[9, 50 - 59] Phương pháp chiết có thể mô tả theo sơ đồ chung dưới đây (hình 1.4):
Hình 1 3: Quy trình tóm tắt công nghệ chiết Polyphenol chè xanh trên thế giới
Catechin, một hợp chất phân cực thường có trong chè xanh, dễ tan trong nước nóng và các dung môi hữu cơ phân cực cao như ethanol và methanol, vì vậy các dung môi này thường được sử dụng để chiết xuất catechin Kết quả cho thấy rằng khi chiết chè xanh bằng dung môi phân cực, hoạt tính chống ôxy hóa của sản phẩm thu được mạnh hơn so với việc sử dụng dung môi có độ phân cực thấp như n-hexane hoặc ether Tuy nhiên, trong dịch chiết vẫn tồn tại nhiều hợp chất không mong muốn và các glycosid có thể bị thủy phân khi sử dụng dung môi là dung dịch nước axít.
Các dung môi phân cực yếu có ưu điểm vượt trội trong việc tinh chế dịch chiết từ các dung môi phân cực Hầu hết các catechin và aglycon có phân tử lượng thấp đều tan trong các dung môi này, mang lại hiệu quả cao trong việc chiết xuất Đặc biệt, các hợp chất này nổi bật với tính chất chống ôxy hóa mạnh mẽ Một số phương pháp chiết catechin từ chè xanh bằng dung môi hữu cơ có thể tham khảo để áp dụng hiệu quả.
Phương pháp ngâm chiết của Delaunay J.C và các cộng sự sử dụng 100 g lá chè ngâm trong 1 lít dung dịch Nước/Acetone (3:2, v/v) ở nhiệt độ phòng trong 12 giờ Dịch chiết sau đó được cô kiệt dưới chân không ở 40°C và chiết bằng n-hexane để loại bỏ tạp chất Cuối cùng, catechin được chiết bằng ethyl acetate và chế phẩm được làm đông khô thành bột mịn Sản phẩm này được phân tích để xác định các catechin và cafein thông qua các phương pháp sắc ký như sắc ký lỏng cao áp kết nối khối phổ hoặc sắc ký điện di.
Các tác giả Xuejun Pan và Guoguang Niu đã tiến hành so sánh hiệu quả của các phương pháp chiết catechin bằng Soxhlet với các kỹ thuật chiết kết hợp viba và siêu âm, như được trình bày trong bảng 1.7.
Bảng 1 7: So sánh lượng catechin chiết từ chè xanh theo các kỹ thuậtsử dụng viba, siêu âm và Soxhlet [56].
A - % Catechin so với nguyên liệu ban đầu;
B - % caffeine so với nguyên liệu ban đầu;
C - Hàm lƣợng % Catechin trong dịch chiết;
D - Hàm lƣợng % caffeine trong dịch chiết.
Phương pháp chiết xuất MAE sử dụng viba để hỗ trợ quá trình chiết Dung môi được sử dụng là hỗn hợp Ethanol và nước với tỷ lệ 1:1 (v/v), trong đó tỷ lệ dung môi so với nguyên liệu là 20/1 Thời gian tác động của viba là 4 phút, kèm theo phương pháp ngâm tĩnh.
UE: Phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm Dung môi Ethanol/nước (1:1, v/v) tỷ lệ dung môi/nguyên liệu là 20/1 Thời gian chiết 90 phút, nhiệt độ chiết 20 - 40°C.
Soxhlet: Chiết hồi lưu trên phễu Soxhlet trong 45 phút, nhiệt độ chiết 85°C.
Các phương pháp thu nhận catechin hiện nay đều có hiệu suất cao và phù hợp với các quốc gia phát triển có công nghệ tiên tiến, cho phép tự chủ về dung môi và hóa chất Những yếu tố kỹ thuật này không chỉ giúp giảm giá thành sản phẩm mà còn đặc biệt quan trọng đối với các quốc gia và vùng lãnh thổ thiếu nguyên liệu chè phế loại.
1.4.2 Sắc ký lỏng hiệu năng cao trong phân tích và phân tách catechin
Năm 1976, Hoefler và Coggon lần đầu tiên áp dụng sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) để phân tích thành phần trong chè xanh và chè đen Hệ thiết bị này đã mở ra hướng nghiên cứu mới trong việc xác định các hợp chất có trong trà.
Hoefler và Coggon đã sử dụng cột sắc ký pha đảo Bondapak đ C18 (10 µm) với hệ dung môi rửa giải isocratic Năm 1983, Robertson và Bendall đã cải tiến thiết bị bằng cách thay thế cột sắc ký bằng Hypersil ODS 5 µm, giúp tăng diện tích bề mặt tiếp xúc và lượng mẫu hấp phụ lên pha tĩnh, từ đó tối đa hóa hiệu quả tách Mặc dù hệ thống này đạt hiệu quả tách tốt, nhưng khả năng tái sinh định lượng vẫn rất thấp.
Cuối thập kỷ 80, hệ thống HPLC với đầu dò photodiode array (PDA) đã trở thành công cụ phân tích quan trọng trong nghiên cứu hóa học của chè HPLC đã được ứng dụng để phân tích các sản phẩm trong hệ thống lên men in vitro, đặc biệt là trong nghiên cứu thearubigin Bailey và cộng sự đã thành công trong việc phân tích polyphenol chè xanh bị oxy hóa trong mô hình lên men hóa học, sử dụng HPLC với đầu dò PDA và hệ dung môi rửa giải gradient Hệ thống HPLC đã được cải tiến để trở thành công cụ phân tích hữu hiệu cho nhiều loại mẫu khác nhau, giúp phân lập các chất gần nhau và tách thearubigins đã bị polyme hóa trong nghiên cứu hóa học.
Hệ thống phân tích HPLC cải tiến đã cho phép phân lập và xác định một loạt các sắc tố mới từ quá trình ôxy hóa ECG, trong đó có Theaflavate A, một dẫn xuất benzotropolone từ chè đen Sự thành công trong việc phân lập Theaflavate A không chỉ thể hiện sự phức tạp của các hợp chất theaflavin mà còn chỉ ra một con đường phản ứng mới cho sự hình thành thearubigin Hệ thống HPLC cũng đã được áp dụng hiệu quả trong việc theo dõi quá trình oxy hóa polyphenol chè xanh như EGCG và ECG, thông qua việc xác định các polyphenol và các hợp chất oxy hóa tương ứng Những nghiên cứu này khẳng định rằng HPLC là công cụ hữu ích trong phân tích flavonoid và polyphenol trong chè.
THỰC NGHIỆM
ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Lá chè xanh - Camellia sinensis (L.) O.Kuntze được thu mua từ các hộ sản xuất chè tại huyện Đại Từ, Thái Nguyên Sau khi thu hoạch, chè được thái nhỏ và sấy khô ở nhiệt độ thích hợp để giữ nguyên hương vị và chất lượng.
110 o C trong 15 phút để diệt men, sau đó sấy lại đồng nhất hóa đến độ ẩm trung bình 5 - 10
% sau đó xay mịn đến kích thước dưới rây 1,5 mm rồi đóng vào túi HDPE kín, hút chân không, bảo quản trong tối ở nhiệt độ < 25 o C.
Hình 2 1: Chè nguyên liệu b/ Catechin tổng số từ chè xanh :
Catechin tổng số chiết xuất từ chè xanh trong quá trình thực hiện luận án có màu vàng nhạt và hàm lượng tổng hợp chất phenolic đạt trên 90% theo phương pháp HPLC Sản phẩm được bảo quản trong lọ thủy tinh kín màu nâu để tránh ánh sáng, với nhiệt độ bảo quản dưới mức tối ưu.
25 o C Hàm lƣợng EGCG trong catechin tổng số đạt ít nhất 50 %. c/ Các catechin chè xanh:
Các catechin chè xanh đƣợc phân lập từ catechin tổng số trong quá trình thực hiện luận án, bao gồm:
Tên viết tắt EC; CAS: (2R, 3R)-2-(3,4-Dihydroxyphenyl)-3,4-dihydro-2H-1- benzopyran-3,5,7-triol;
Dạng tinh thể hình kim màu vàng sáng; Điểm nóng chảy: 173 - 177 o C;
Tan tốt trong nước nóng, ethanol, methanol.
Tên viết tắt EGC; tên CAS: (2R,3R)-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)-3,4-dihydro- 2H-chromene-3,5,7-triol
Dạng bột vô định hình màu trắng hồng;Tan tốt trong nước nóng, ethanol, methanol.
Tên viết tắt EGCG; CAS: 3,4,5-Trihydroxybenzoic acid, (2R,3R)-3,4-dihydro- 5,7-dihydroxy-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)-2H-1-benzopyran-3-yl ester;
Dạng bột tinh thể màu trắng; Điểm nóng chảy: 214 - 218 o C;
Tan tốt trong nước nóng, ethanol, methanol.
CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
The article discusses various chemicals used in experimental processes, including methanol, ethanol, ethyl acetate, n-hexane, sodium sulfate, concentrated sulfuric acid, pyridine, silica gel Merck 60 (15 - 40 µm), Sephadex LH 20, and Diaion HP 20 These chemicals are sourced from reputable suppliers such as Merck and Sigma Aldrich, as well as technical-grade chemicals from Vietnam, China, and Singapore.
Dụng cụ thủy tinh bao gồm thiết bị cô quay chân không Buechi R 210, cột sắc ký, hệ chưng cất phân đoạn để thu hồi và tinh chế dung môi, cùng với cốc thủy tinh và phễu lọc hút.
Buechner, pipet, ống đong, ống nghiệm, bình cầu, bình tam giác
Các thiết bị thử nghiệm lƣợng lớn bao gồm hệ thống chiết Soxhlet với dung tích 20 lít, thiết bị cô quay chân không Heidolph Laborota LR 20 cũng 20 lít, hệ thống sắc ký lỏng cao áp Pilot Labomatic HD 3000, hệ thống chiết phân bố hồi lưu lỏng/lỏng 80 lít, và hệ thống chiết lỏng/rắn ngược dòng với công suất 100 kg nguyên liệu/giờ.
2.2.2 Các phương pháp chiết chè xanh
2.2.2.1 Phương pháp chiết đun hồi lưu sử dụng cồn Đây là phương pháp chiết phân tích polyphenol chè xanh chung được áp dụng ở Trung Quốc và trên thế giới, phương pháp này được tóm tắt như sau:
Chè vụn được nghiền nhỏ và chiết xuất bằng phương pháp Soxhlet 20 lít với ethanol trong thời gian thích hợp Sau khi chiết xuất, dịch chiết được làm nguội, lọc sạch và cô đặc ethanol dưới áp suất thấp để thu được chè có chất lượng cao.
Cao chè được chiết xuất và phân bố loại tạp ít phân cực (defat) bằng n-hexane, trong khi phần dịch nước được chiết xuất và phân bố với ethyl acetate để thu nhận các catechin.
Caffeine có thể được tách ra khỏi Polyphenol tổng số bằng phương pháp đun hồi lưu với chloroform trong một khoảng thời gian nhất định Sau khi loại bỏ caffeine, bột cao chiết còn lại được gọi là Catechin tổng số.
2.2.2.2 Phương pháp chiết ngược dòng liên tục dùng nước làm dung môi
Trong hệ thống chiết ngược dòng liên tục, bột chè ướt được nghiền mịn thành bùn nhão và kết hợp với dung môi chiết Nguyên liệu và dung môi di chuyển ngược chiều nhau trong thiết bị chiết dạng ống, tạo điều kiện cho nguyên liệu tiếp xúc tối đa với dung môi Quá trình khuếch tán diễn ra liên tục nhờ vào chênh lệch nồng độ giữa hai pha rắn và lỏng Khi nguyên liệu di chuyển xa hơn, nồng độ chất chiết trong dung dịch tăng lên Khi đạt được nồng độ tối ưu, quá trình chiết kết thúc, dịch chiết đậm đặc chảy ra từ một đầu bình, trong khi bã gần như không còn dung môi được tháo ra từ đầu bên kia.
2.2.3 Các phương pháp phân tách catechin
Các catechin và EGCG đã được phân tách bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp trên hệ thống bán công nghiệp, sử dụng cột Diaion HP 20 kết nối trực tuyến với cột Sephadex LH 20 tại Trung tâm Hóa Dược, Viện Hóa học công nghiệp Việt Nam.
Hình 2 2: Hệ thống Pilot Prep HPLC và cột tách Sephadex ID 100 x L 800 mm
2.2.4 Phương pháp acetyl hóa catechin
Phản ứng acyl hóa là quá trình thay thế nguyên tử hydro trong nhóm chức -OH hoặc -NH2 bằng nhóm R-CO- Để thực hiện phản ứng này, cần có amine có tính bazo mạnh và chất phản ứng cũng phải có proton.
Phản ứng acyl hóa bằng anhydrit acetic đƣợc thực hiện theo cơ chế :
Anhydrit acetic là một loại acid có tính chất mạnh hơn acid carboxylic, do đó, nó thực hiện phản ứng acyl hóa mạnh mẽ hơn so với carboxylic Điều này dẫn đến việc phản ứng này là một chiều và không thể tái tạo lại phenol.
2.2.5 Các phương pháp phân tích sản phẩm
Sắc kí lớp mỏng (SKLM)
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên lớp mỏng Silica gel sử dụng hệ dung môi Chloroform/Methanol/Axít citric 0,5% theo tỷ lệ 3:2:0,2 (v/v) Phương pháp chỉ thị sử dụng ánh sáng UV/Vis ở bước sóng 360 nm và thuốc hiện Von’s (Ce/NH4/MoO4).
Sắc ký lỏng hiệu năng cao kết nối phổ khối lượng
Các sản phẩm catechin được chiết xuất từ chè xanh Việt Nam đã được phân tích định tính và định lượng thông qua phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết nối khối phổ (HPLC-MS) Phân tích này được thực hiện trên hệ thiết bị LC/MSD-Trap-SL Agilent 1100 tại Viện Hóa học, thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
EGCG cùng với các hợp chất khác từ trà xanh như EC, EGC và caffeine đã được xác định cấu trúc bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H và 13C NMR Các phân tích này được thực hiện trên máy NMR Brucke AVAN 500 MHz tại Viện Hóa học, thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2.6 Thiết kế nghiên cứu của luận án
Mục tiêu của luận án là nghiên cứu công nghệ tách catechin từ chè xanh Việt Nam (Camellia sinensis L.), chuyển hóa và tạo ra dẫn xuất, đồng thời khảo sát hoạt tính sinh học của các sản phẩm thu được Chúng tôi đã thiết kế nghiên cứu và thực hiện các bước nghiên cứu thực nghiệm và lý thuyết.
Hình 2 3: Thiết kế nội dung nghiên cứu
Cụ thể các bước nghiên cứu thực nghiệm và lý thuyết được thực hiện:
THỰC NGHIỆM
2.3.1 Nghiên cứu quy trình chiết suất các catechin tổng số từ chè xanh
2.3.1.1 Nghiên cứu quy trình chiết suất các catechin tổng số từ chè xanh bằng ethanol
Tiến hành chiết xuất 5 kg chè vụn nghiền nhỏ bằng máy nghiền ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút và sàng lọc qua lưới 1,5 mm Sau đó, cho chè vào túi chiết trong bầu chiết Soxhlet có thể tích 20 lít Quá trình chiết diễn ra bằng cách đun sôi với ethanol trong 16 giờ ở nhiệt độ hồi lưu 75°C, với tốc độ hồi lưu được điều chỉnh để dịch trong bầu chiết rút xuống bình đun khoảng 10 - 15 phút mỗi lượt.
Hình 2 4: Thiết bị chiết Soxhlet 20 lít
Sau 16 giờ hồi lưu ở nhiệt độ trên, dịch chiết được để nguội xuống nhiệt độ phòng, lọc sạch và cô kiệt loại ethanol trên thiết bị cô quay chân không Pilot 20 lít Heidolph LR 20 (hình 2.5) ở nhiệt độ 60°C, áp suất 200 mbar thu đƣợc cao chè.
Hình 2 5: Thiết bị cô quay chân không 20 lít Heidolph Laborota LR 20
Đưa cao chè vào thiết bị chiết phân bố tuần hoàn 80 lít và tiến hành chiết bằng hỗn hợp dung môi n-hexane và nước theo tỷ lệ 1:1 (v/v) Sau đó, tách riêng phần dịch chiết nước và phần dịch chiết n-hexane Phần dịch nước sẽ được chiết phân bố thêm với ethyl acetate 3 lần, sau đó gộp các dịch ethyl acetate lại và cô kiệt dung môi ở áp suất giảm để thu được Catechin tổng số thô.
Hình 2.6 mô tả quá trình chiết catechin tổng số thô bằng thiết bị chiết tuần hoàn 80 lít, sử dụng chloroform với tỷ lệ 1:10 (w/v) trong 4 giờ ở nhiệt độ hồi lưu 61°C Sau khi chiết xuất, dịch chloroform được thu bằng phương pháp lọc hút chân không (hình 2.7) Phần bột cao chè còn lại trên phễu lọc được sấy khô và nghiền mịn để thu được catechin tổng số.
Hình 2 7: Lọc hút chân không thu catechin tổng số
Thành phần và hàm lượng tương đối của các Catechin được phân tích bằng phương pháp HPLC-MS với điều kiện phân tích:
+ Cột Sắc ký Zorbax Eclipse XDB C18 (4,6 x 150 mm);
+ Detector ESI-MS: quét từ 100 - 600 m/z cả hai chế độ Ion dương (Positive mode) và âm (negative mode);
+ Tốc độ dòng 0,4 ml/phút;
+ Pha động Methanol/H2O+0.5% formic acid rửa giải theo cách gradient.
2.3.1.2 Nghiên cứu quy trình chiết suất các catechin tổng sốtừ chè xanh bằng nước trên thiết bị chiết ngược dòng liên tục
Hệ thống chiết ngƣợc dòng liên tục rắn/lỏng (hình 2.8); chiều dài thân ống chiết
3000 mm; chiều dài thân ống ép 1500 mm; nạp liệu bằng vít tải Hệ thống nhận nguyên
Hình 2 8: Hệ thống chiết lỏng/rắn ngƣợc dòng liên tục
Mô tả hệ thống thiết bị(hình 2.9):
Máy chiết ngƣợc dòng liên tục chế tạo bằng thép SSU 304 dạng ống ID 400 ×
Vít tải và ép có chiều dài 5500 mm, với cấu trúc kéo dài dọc theo trục ống chiết Vít tải được chia thành 2 đoạn: đoạn chiết dài 3 m với bước xoắn không đổi là 340 mm, và đoạn vớt nộn ộp dài 2 m với bước xoắn giảm dần, bắt đầu từ P và giảm đều 10 mm.
Hình 2 9: Thiết kế máy chiết lỏng/rắn ngƣợc dòng liên tục
+ Năng lực sản xuất: 200 ~ 300 lít/giờ tương đương với 0,3 ~ 0,5 tấn/giờ; + Nhiệt độ chiết nguyên liệu 25°C - 30°C;
+ Thời gian nguyên liệu dừng trong máy (thời gian chiết): 95 ~ 120 phút;
+ Tốc độ quay của trục chính 0.3 ~ 1 vòng/phút;
+ Điều kiện hoạt động chịu ăn mòn và mài mòn: hoạt động ở điều kiện mang tính axit hoặc dung môi hữu cơ;
+ Mật độ dƣợc liệu trong máy ~1,2 tấn/m 3 ;
+ Hàm lượng nước trong bã 40 % - 50 %.
Tiến hành nghiền 100kg chè vụn nhỏ hơn 1,5 mm, sau đó trộn với 500 lít nước và 50 gam axit citric để tạo thành khối nguyên liệu nhão Nguyên liệu này được nạp vào phễu nạp của máy chiết, chiết với tốc độ khoảng 125 kg/giờ Dung môi chiết, là dung dịch axit citric 0.05, được bơm bằng bơm định lượng vào máy chiết với tốc độ nhất định.
150 lít/giờ theo đường cấp dịch ngược chiều dịch chuyển nguyên liệu Tổng cộng sau
Trong vòng 5 giờ, quy trình chiết xuất 600 kg bột chè nhão được hoàn thành Bã chiết có độ ẩm từ 40-50% được vắt khô bằng máy ly tâm với tốc độ 1400 vòng/phút, sau đó được ép trên máy ép thủy lực với áp suất 75 kg/cm² để tạo thành bánh chè có độ ẩm cuối cùng dưới 10%.
Các dịch chiết, dịch lọc và dịch ép được kết hợp tổng cộng khoảng 1000 lít và được bơm vào thiết bị phản ứng hồi lưu có khuấy và gia nhiệt Chlohydric acid 1N được bổ sung đến pH khoảng 2 - 3, sau đó gia nhiệt đến 85°C và khuấy liên tục trong 4 giờ Khi phản ứng kết thúc, dịch chiết được làm nguội xuống nhiệt độ phòng và toàn bộ dịch chè cùng bã được lọc sạch bằng máy lọc ép để thu hồi dịch thủy phân.
Dịch thủy phân được đưa vào hệ thống chiết phân bố tuần hoàn với chloroform theo tỷ lệ 2:1 (dịch chiết/chloroform) và được chiết - bơm khuấy trộn bằng bơm ly tâm cao tốc (200 lít/phút) trong 15 phút để tách lớp dịch nước và dịch chloroform Cuối cùng, dịch nước được chiết lại 3 lần với ethyl acetate trong hệ thống chiết phân bố tuần hoàn Dịch chiết ethyl acetate được gộp lại, làm khan bằng Na2SO4 khan và cô cất chân không để thu nhận.
“Catechin tổng số” và thu hồi ethyl acetate Phần dịch chloroform đƣợc cô kiệt ở 50°C,
350 mbar thu nhận cao diệp lục màu xanh đen tối, chủ yếu chứa caffeine và chlorophyll, là nguyên liệu thô để tách tinh chế caffeine và chlorophyll, với chlorophyll là sản phẩm phụ cho nghiên cứu tiếp theo Quá trình thu nhận catechin tổng số từ dịch thủy phân được minh họa trong hình 2.10.
DỊCH THỦY PHÂN Chiết với CHCl3
CATECHIN TỔNG SỐ Phân tích HPLC-MS
Hình 2 10: Sơ đồ quy trình thu nhận catechin tổng số từ dịch thủy phân
Thành phần và hàm lượng tương đối của các Catechin được phân tích bằng phương pháp HPLC-MS với điều kiện phân tích:
+ Cột Sắc ký Zorbax Eclipse XDB C18 (4,6 x 150 mm);
+ Detector ESI-MS: quét từ 100 - 600 m/z cả hai chế độ Ion dương (Positive mode) và âm (negative mode);
+ Tốc độ dòng 0,4 ml/phút;
+ Pha động Acetonitrin/H2O+1% formic acid rửa giải theo cách gradient.
2.3.2 Nghiên cứu tách và tinh chế các catechin và EGCG từ catechin tổng số của chè xanh
2.3.2.1 Nghiên cứu lựa chọn chất hấp phụ có thể tái sử dụng làm pha tĩnh tách sắc ký điều chế EGCG từ catechin tổng số của chè xanh
Catechin tổng số là thành phần quan trọng được nghiên cứu với mục tiêu tối ưu hóa các điều kiện tách sắc ký, bao gồm lựa chọn pha tĩnh và dung môi (pha động) Nghiên cứu này được thực hiện trên thiết bị sắc ký trung áp điều chế MPLC tại Trung tâm Hóa Dược, Viện Hóa học công nghiệp Việt Nam.
Hình 2 11: Thiết bị tách sắc ký điều chế MPLC Điều kiện thiết bị tách sắc ký điều chế MPLC:
Bơm sắc ký: MPLC Pump MD 80/100 Labomatic AG;
Tốc độ dòng 0 - ~30 ml/phút; Áp lực nén trung bình: 0,5 - 20 bar.
Hệ thống cột sắc ký:
Sắc ký pha đảo: ID 50 x L 350 mm; Sephadex LH20
Sắc ký pha thường: ID 50 x L 450 mm; Silica gel 60 (Merck);
Sắc ký pha lƣỡng tính: ID 35 x L 230 mm; Silica gel CN (Merck);
Sắc ký trao đổi ion: ID 30 x L 400 mm; Diaion HP20SS;
Sắc ký hấp phụ: ID 10 x L 50 mm; pha tĩnh AP 6.
Kết quả khảo sát sẽ được áp dụng vào hệ thống sắc ký lỏng cao áp Pilot nhằm phân lập catechin từ chè xanh với khối lượng lớn, phục vụ cho việc sản xuất nguyên liệu bán tổng hợp và nghiên cứu cấu trúc cũng như hoạt tính chống ôxy hóa.
Hiệu suất tách EGCG từ catechin tổng số của chè xanh đƣợc xác định bằng công thức: m*100
% EGCG* M Trong đó: m là khối lƣợng (g) EGCG tách đƣợc từ catechin tổng số
M là khối lƣợng mẫu catechin tổng số
EGCG chiếm 50,62% trong tổng số catechin được chiết xuất bằng phương pháp chiết ngược dòng liên tục Nghiên cứu này nhằm khảo sát và đánh giá hiệu quả tách EGCG từ catechin tổng số bằng cách sử dụng cột silica gel biến tính trong quá trình sắc ký pha động.
Nghiên cứu xây dựng điều kiện tách sắc ký điều chế MPLC:
+ Cột tách: ID 50 × L 450 mm; pha tĩnh Silica gel 60 (Merck) cỡ hạt 15 - 40 àm;
+ Mẫu khảo sát: 5 g Catechin/10 ml methanol;
+ Tốc độ dòng pha động: 10 ml/phút;
+ Pha động chạy sắc ký: Chloroform/Methanol/Axít citric 0,5 % rửa giải theo cách gradient từ 10 % - 100 % thể tích methanol.
+ Phát hiện mẫu: Sắc ký lớp mỏng silica gel;
Dung môi Chloroform/Methanol/Axít citric 0,5 % với tỷ lệ 3:2:0,2 (v/v) được sử dụng để khảo sát và đánh giá hiệu quả tách EGCG từ catechin tổng số Phương pháp hiện được áp dụng là Von’s với các thành phần Ce/NH4/MoO4 trên cột silica gel pha lưỡng tính RP/NP.
Nghiên cứu xây dựng điều kiện tách sắc ký điều chế pha thường MPLC trên pha tĩnh cyanosilica gel nhƣ sau:
+ Cột tỏch: ID 35 x L 230 mm; pha tĩnh LichroPrep đ CN Merck (40 - 63 àm); + Mẫu khảo sát: 2 g Catechin/2 ml methanol;
+ Tốc độ dòng pha động: 10 ml/phút;
+ Pha động chạy sắc ký: Chloroform/Methanol rửa giải theo cách gradient từ 10
+ Phát hiện mẫu: Sắc ký lớp mỏng silica gel;
Dung môi Chloroform/Methanol/Axít citric 0,5 % - 3:2:0,2 (v/v); Thuốc hiện: Von’s (Ce/NH4/MoO4). c/ Khảo sát và đánh giá hiệu quả tách EGCG từ catechin tổng số trên cột Sephadex LH 20
Khảo sát tách sắc ký điều chế EGCG trên cột sắc ký nạp Sephadex LH 20 theo các điều kiện sau đây:
+ Pha tĩnh: Sephadex LH 20 (40 - 63 àm);
+ Mẫu khảo sát: 2 g Catechin/1 ml Ethanol;
+ Tốc độ dòng dung môi: 10 ml/phút;
+ Dung môi chạy sắc ký: Ethanol/Nước - 95 : 5 (v/v)
+ Phát hiện mẫu: Sắc ký lớp mỏng silica gel;
Dung môi sử dụng trong nghiên cứu bao gồm Chloroform, Methanol và Axít citric với tỷ lệ 0,5% - 3:2:0,2 (v/v) Thuốc hiện được sử dụng là Von’s (Ce/NH4/MoO4) Nghiên cứu tập trung vào việc khảo sát và đánh giá hiệu quả tách EGCG từ tổng số catechin trên vật liệu polyme xốp có lỗ trống mạng phân tử lớn, đặc biệt là thông qua việc khảo sát hiệu quả tách EGCG trên cột sắc ký Diaion HP20 SS.
Khảo sát tách sắc ký điều chế EGCG trên cột sắc ký Diaion HP20 SS theo các điều kiện sau đây:
+ Pha tĩnh: Mitsubishi Diaion HP20 SS (200 - 600 àm);
+ Mẫu khảo sát: 0,5 g Polyphenol/1 ml metanol;
+ Tốc độ dòng pha động: 5 ml/phút;
+ Dung môi chạy sắc ký: Metanol (A)/Nước (B); trong đó:
+ Phát hiện mẫu: Sắc ký lớp mỏng silica gel;
Dung môi Chloroform/Metanol/Axít citric 0,5 % - 3:2:0,2 (v/v);
Thuốc hiện: Von’s (Ce/NH4/MoO4). ii/ Khảo sát hiệu quả tách EGCG trên cột sắc ký nạp Polymeric AP 6
Khảo sát sơ bộ khả năng sử dụng polymer AP để tách hoặc tinh chế EGCG trên cartridge AP 6 theo các điều kiện sau đây:
+ Cột tách: Catridge AP 6 ID 10 x L 50 mm;
+ Pha tĩnh: Polymerics GmBH AP 6 (45 - 100 àm);
+ Mẫu khảo sát: 0,1 g Polyphenol/0,5 ml metanol;
+ Tốc độ dòng pha động: 1,5 ml/phút;
+ Dung môi chạy sắc ký: Metanol (A)/Nước (B); trong đó:
+ Phát hiện mẫu: Sắc ký lớp mỏng silica gel;
Dung môi: Chloroform/Metanol/Axít citric 0,5 % - 3:2:0,2 (v/v); Thuốc hiện: Von’s (Ce/NH4/MoO4).