TỔNG QUAN
VÀI NÉT VỀ CHÈ XANH
1.1.1 Cây chè - Camellia sinensis (L.) O.Kuntze
Cây chè, Camellia sinensis (L.) O.Kuntze thuộc chi Chè - Camellia, họ Chè -
Theaceae, thuộc ngành Hạt kín Angiospermatophyta, lớp Ngọc lan (hai lá mầm) Magnoliopsida, phân lớp Sổ Dilleniidae, bộ Chè Theales Năm 1753, Carl Von
Linnaeus, nhà tự nhiên học Thụy Điển, đã phân loại chè thành hai giống chính: Thea bokea (chè đen) và Thea viridis (chè xanh), có nguồn gốc từ Vân Nam, Trung Quốc, sau đó được lan rộng và phổ biến tại Việt Nam, Nhật Bản, Ấn Độ và nhiều quốc gia khác ở Châu Á.
Chè là cây xanh lưu niên, thường mọc thành bụi hoặc cây nhỏ, được xén tỉa để cao dưới 2 mét khi trồng lấy lá Lá chè có kích thước từ 4-15 cm chiều dài và 2-5 cm chiều rộng Cây chè có rễ cái dài và hoa màu trắng ánh vàng với đường kính khoảng 2,5 cm.
4 cm với 7 - 8 cánh hoa mọc ở kẽ lá, mùi thơm nhiều nhị Quả là một nang, thường có
3 ngăn nhƣng chỉ có một hạt do các hạt khác teo đi
Hàng năm, sản lượng chè toàn cầu đạt 2,5 triệu tấn, với 80% nguồn gốc từ Châu Á, chủ yếu là Trung Quốc, Ấn Độ và Sri Lanka Tại Việt Nam, chè được trồng ở 33 tỉnh, nổi bật là Phú Thọ, Tuyên Quang, Hà Giang, Thái Nguyên, Quảng Nam, Đà Nẵng, Lâm Đồng và Đắc Lắc Đến năm 2013, tổng diện tích trồng chè cả nước khoảng 125.000 ha, sản lượng đạt hơn 500.000 tấn, với nhiều loại chè thương phẩm, trong đó 70% là chè đen xuất khẩu và phần còn lại là chè xanh.
Hình 1.1: Búp chè xanh thế giới, xuất khẩu sang 110 thị trường khác nhau, kim ngạch xuất khẩu chè đạt trên
200 triệu đô la Mỹ Các thị trường lớn nhất của chè xanh Việt Nam là Pakistan, Đài Loan, Nga, Ba Lan, Trung Quốc, Hoa Kỳ [7-8]
1.1.2 Chè xanh trong thực phẩm và dƣợc phẩm Đồ uống trong văn hóa châu Á :
Chè là sản phẩm được chế biến từ búp, cuống và các lá non thu hái từ cây chè Dựa vào các phương pháp chế biến khác nhau, chè được phân thành hai loại chính.
Chè xanh là loại trà có màu nước pha xanh vàng, mang vị đậm dịu và hương thơm tự nhiên đặc trưng Để chế biến chè xanh, nguyên liệu chè được xử lý bằng cách diệt men tự nhiên có sẵn, sau đó được vo lại và sấy khô.
Chè đen được chế biến qua quá trình lên men, không sử dụng men, tạo ra những biến đổi sinh hóa cần thiết giúp sản phẩm có màu sắc và hương vị đặc biệt Nước pha chè đen có màu đỏ nâu sáng, vị dịu và hương thơm nhẹ nhàng.
Ngoài hai loại chè chính được tiêu thụ hiện nay, còn có chè đỏ và chè vàng, phụ thuộc vào công nghệ chế biến Các loại chè có thể được ướp hương gọi là chè hương, trong khi chè ở dạng cánh rời được gọi là chè rời, chè dạng bánh là chè bánh, và chè dạng bột (nước pha chè cô đặc rồi sấy khô) được gọi là chè bột hay chè hòa tan Những loại chè này cũng có ứng dụng trong lĩnh vực dược và thực phẩm.
Nghiên cứu về cơ chế tác dụng sinh lý của chè đã gia tăng mạnh mẽ từ thế kỷ 20, trước đây thường chỉ xem xét tác dụng của caffeine và vitamin C Từ thập niên 1970, các nghiên cứu hóa sinh đã chỉ ra rằng các hợp chất catechin trong chè có nhiều tác dụng dược lý và sinh lý quan trọng Nhiều công bố đã chứng minh tác dụng của polyphenol trong chè xanh đối với các bệnh ung thư, tim mạch, tiết niệu và tiêu hóa.
Alzheimer, bệnh Parkison, v.v ; ngoài ra polyphenol chè xanh còn có tác dụng làm giảm sự nhiễm độc do kim loại, do phóng xạ…[1, 10, 11]
Nghiên cứu tại trung tâm dinh dưỡng Unilever ở Vlaerdingen, Hà Lan, cho thấy một số bệnh viện đã công nhận trà là thực phẩm có lợi cho sức khỏe Các nhà khoa học phát hiện rằng việc uống 3 chén trà mỗi ngày giúp giảm đáng kể khối lượng và hoạt động của gốc tự do ôxy hóa trong huyết thanh.
Chè xanh không chỉ giúp giải khát mà còn cung cấp dinh dưỡng và ngăn ngừa bệnh nhờ vào các hợp chất sinh học cao trong lá chè Đây là nguyên liệu quan trọng trong nhiều món ăn và đồ uống như bánh kem chè xanh, bánh gatô chè xanh và sandwich chè xanh, được ưa chuộng ở Việt Nam, Nhật Bản, Hàn Quốc, Anh, Mỹ và Úc Nhật Bản nổi bật với nhiều loại thực phẩm và đồ uống chế biến từ chè xanh, trong đó có chế phẩm Thea-flan giàu catechin và polyphenol từ chè xanh.
Bảng 1 1: Ứng dụng của chế phẩm polyphenol chè xanh trong chế biến thực phẩm
Lĩnh vựcsử dụng Công dụng đối với các sản phẩm
Hàm lƣợng sử dụng Thea-flan Polyphenol
Chất bảo quản chống ôxi hóa
-Dầu ăn thông thường (dầu thực vật, dầu đậu tương, dầu cọ, mỡ lợn );
- Thực phẩm chứa dầu (snack food, thực phẩm rán, margarin );
- Dầu có chứa các axít béo bão hòa phân tử lƣợng lớn; 0,1 - 1,0 % 0,2 - 0,3 %
- Kéo dài thời gian sử dụng của các thực phẩm chế biến từ hải sản; 0,01-0,5%
- Thực phẩm khô nhƣ bột cá; 0,01 - 0,1 % -Chống nhạt màu của các chất màu tự nhiên 0,01-0,5% 0,05-0,3%
- Tất cả thực phẩm thông thường
Khử mùi - Thực phẩm chống hôi miệng (bánh kẹo, kẹo cao su) 0,1 - 0,5 % ≤ 0,2 %
- Đồ uống cho sức khỏe 0,1 - 0,3 %
- Chống sâu răng, viêm lợi (kẹo, bánh);
-Ức chế tăng cholesterol (sử dụng trong hămbơgơ, thịt băm, xúc xích, thực phẩm rán cho người ăn kiêng)
THÀNH PHẦN HOẠT CHẤT CỦA CHÈ XANH
Thành phần hóa học của nguyên liệu chè bao gồm tannin, caffeine, protein, tinh dầu, men, sắc tố, pectin, vitamin, chất khoáng và axít hữu cơ Trong đó, tannin, caffeine, sắc tố, dầu thơm và pectin là những thành phần quan trọng quyết định màu sắc và hương vị của sản phẩm Tannin, chủ yếu là catechin, là một hợp chất polyphenol quan trọng Trong quá trình sản xuất chè xanh, men polyphenol oxidase oxy hóa các polyphenol đã bị bất hoạt bởi nhiệt độ, nên hàm lượng polyphenol trong chè xanh không thay đổi so với lá chè Các hợp chất phenol được coi là thông số quan trọng và là chất chỉ thị của chè, đặc biệt là trong chè đen, giúp đánh giá giá trị thị trường và các giống chè khác nhau.
Chất lượng chè theo mùa được ảnh hưởng bởi các hợp chất như theaflavin trong chè đen và catechin cùng các gallate trong chè xanh Các hợp chất phenol tổng số là chỉ số quan trọng để đánh giá chất lượng và giá trị của chè Do đó, phân tích các hợp chất phenol trong chè là cần thiết để xác định và mô tả tính chất của sản phẩm chè.
1.2.1 So sánh chất lƣợng nguyên liệu theo vùng trồng chè xanh ở Thái Nguyên, Phú Thọ, Mộc Châu [73]
Nghiên cứu tiến hành lựa chọn và lấy mẫu đọt chè tươi 1 tôm 3 lá vào buổi sáng sớm trong vụ mùa năm 2010 tại các vùng trồng chè miền Bắc như Thái Nguyên, Phú Thọ và Mộc Châu Phân tích thành phần cơ giới và hàm lượng polyphenol trong chè xanh được thu hái từ các vùng và vụ khác nhau đã cho kết quả cụ thể, thể hiện trong bảng 1.2 và bảng 1.3.
Bảng 1 2 : Thành phần cơ học nguyên liệu 1 tôm 3 lá
Vùng chè Tôm Lá 1 Lá 2 Lá 3 Cuộng Tổng g % g % g % g % g % (g)
Bảng 1 3 : Thành phần polyphenol nguyên liệu chè theo vùng và vụ thu hái
Thu 20,45 16,78 20,18 Đông 18,1 15,2 17,85 Đơn vị: % tính theo hàm lượng khô
Kết quả phân tích từ bảng 1.2 và bảng 1.3 cho thấy, không có sự khác biệt đáng kể về trọng lượng và tỷ lệ các thành phần của đọt chè giữa các mẫu từ Thái Nguyên, Phú Thọ và Mộc Châu Tuy nhiên, chè Mộc Châu và Thái Nguyên nổi bật hơn về độ đồng đều màu sắc, tỷ lệ già/bánh tẻ và hương vị so với chè Phú Thọ Do đó, chè xanh Thái Nguyên đã được chọn làm đối tượng nghiên cứu cho luận án.
Catechin và các hợp chất gallate của chúng, được gọi chung là catechin chè xanh, chiếm khoảng 30% trọng lượng khô Những hợp chất này thuộc phân lớp flavan-3-ol, hay còn gọi là flavanol, trong nhóm flavonoid Chúng có cấu trúc C6-C3-C6 độc đáo, bao gồm ba vòng phenol được ký hiệu là A, B và C, với mức độ hydroxyl hóa khác nhau Cấu trúc này cùng với sự định hướng tương đối của các thành phần phân tử quyết định hoạt tính sinh học của catechin và các chất chuyển hóa liên quan.
Catechin là một hợp chất có cấu trúc phức tạp, trong đó có thể tồn tại tới 24 dạng khác nhau dựa trên cấu hình tuyệt đối và các nhóm thế Tuy nhiên, hiện tại chỉ có 12 loại catechin đã được phân lập và xác định cấu trúc từ chè xanh.
Catechin trong chè xanh bao gồm các cấu trúc chính như EC, C, EGC, và GC, cùng với catechin gallat như ECG, CG, GCG, và EGCG Ngoài ra, hai catechin digallat là epicatechin digallat (ECDG) và epigallocatechin digallat (EGCDG) cũng thuộc nhóm catechin gallat Gần đây, các hợp chất mới như (-)-epicatechin-3-(3-O-methylgallate) và (-)-epigallocatechin-3-(3-O-methylgallate) đã được phát hiện trong chè Tỷ lệ mol và hàm lượng của các catechin này khác nhau giữa các loại chè và các bộ phận khác nhau của chè xanh, được trình bày trong các bảng 1.4, 1.5 và 1.6.
Bảng 1 4: Các catechin đã được phân lập trong chè xanh
Stt Tên Viết tắt Tỉ lệ (% mol)
Catechin Epicatechin Gallocatechin Epigallocatechin Epicatechin gallate Epigallocatechin gallate
Catechin gallate Gallo catechin gallate Epicatechin digallate Epigallocatechin digallate
Bảng 1 5: Hàm lượng các catechin chủ yếu trong các loại chè khác nhau
Chè xanh Chè đen Chè 0oLong
Caffeine 3.83 4.74 2.91 Đơn vị: % tính theo hàm lượng khô Bảng 1 6: Thành phần catechin trong các bộ phận chè xanh [16]
Catechin Lá thứ 1 Lá thứ 2 Lá thứ 3 Lá già Cuộng
222,08 68,79 65,65 292,93 87,98 Tổng lƣợng catechin 886,69 910,31 786,11 701,82 737,40 Đơn vị: mg/g chế phẩm chiết bằng ethyl acetate
Kết quả phân tích cho thấy hàm lượng catechin trong chè xanh cao hơn so với chè đen và chè ôlong, với Epigallocatechin gallat (EGCG) là thành phần polyphenol chính, chiếm khoảng 10 - 50% tổng lượng catechin EGCG, chất có khả năng chống ôxy hóa mạnh mẽ, gấp 100 lần vitamin C và 25 lần vitamin E, hỗ trợ trong việc ức chế các tác nhân gây ung thư và điều trị bệnh tim mạch, đồng thời giúp phòng ngừa xơ vữa động mạch nhờ vào khả năng giảm tích tụ gốc tự do.
EGCG trong trà xanh giúp ngăn chặn quá trình ôxy hóa lipid trong máu, giảm mức LDL-cholesterol và tăng cường HDL-cholesterol Nhờ vào những lợi ích này, trà xanh được cho là có khả năng chống lão hóa mô và kéo dài tuổi thọ con người.
Tính chất hóa học chung của các c atechin [32-36]:
Các nghiên cứu hóa học cho thấy rằng catechin và các hợp chất gallate của chúng có khả năng hấp phụ quang phổ tử ngoại trong vùng bước sóng từ 266 nm.
Trong dung môi ethanol, các catechin có bước sóng hấp phụ cực đại lần lượt là: EC tại 280 nm, GCG tại 275 nm, ECG từ 279 đến 280 nm, EGC tại 271 nm và EGCG tại 275 nm.
Catechin là một hợp chất không màu, thường tồn tại dưới dạng tinh thể hình kim hoặc hình lăng trụ Chất này có vị chát với mức độ khác nhau và để lại hậu vị ngọt Đặc biệt, hai loại catechin là EGC và EGCG có vị chát hơi đắng khi ở dạng tự do, nhưng khi chuyển thành dicatechin, vị chát sẽ trở nên dịu hơn.
Catechin là hợp chất có khả năng tan trong nước nóng, ancol, acetone và ethyl acetate, nhưng không tan trong benzene và chloroform Tính tan tốt của catechin trong nước và ethyl acetate đã được ứng dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp sản xuất catechin từ hỗn hợp tannin trong chè xanh.
Các chất catechin phản ứng với FeCl 3, tạo ra màu sắc khác nhau tùy thuộc vào các nhóm hydroxyl trong phân tử, cho màu xanh lá cây hoặc xanh da trời.
Các chất catechin có tính khử mạnh nên dễ dàng bị ôxy hóa bởi dung dịch
KMnO 4 trong môi trường axit và bởi dung dịch I2 trong môi trường kiềm, chúng có thể tự ôxy hóa trong không khí ẩm
Dưới tác động của men peroxydase hoặc nhiệt độ cao, catechin trong lá chè bị oxy hóa, dẫn đến sự hình thành các sản phẩm oxy hóa thứ cấp Những sản phẩm này tham gia vào nhiều chuyển hóa hóa học, tạo ra mùi thơm đặc trưng cho các loại chè Cuối cùng, các sản phẩm oxy hóa tích tụ lại thành các hợp chất màu vàng, dần chuyển sang màu đỏ đặc trưng của nước chè đen.
HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA EGCG VÀ CÁC CATECHIN CHÈ XANH
Chè xanh và các catechin trong chè xanh có hoạt tính chống oxy hóa, đã được nghiên cứu về hiệu quả trong các bệnh liên quan đến các loại oxy phản ứng (ROS), bao gồm ung thư, bệnh tim mạch và thoái hóa thần kinh Nhiều nghiên cứu dịch tễ học và trên mô hình động vật cho thấy chè xanh có khả năng bảo vệ chống lại nhiều loại ung thư như ung thư vú, ung thư da, ung thư tuyến tiền liệt và ung thư phổi Bên cạnh đó, chè xanh và EGCG còn được chứng minh có hoạt tính chống sinh thành mạch, ngăn chặn sự hình thành mạch máu trong khối u, cũng như hoạt tính chống gây đột biến.
Chè xanh có tác dụng giảm cholesterol và ngăn chặn sự phát triển của xơ vữa động mạch Nghiên cứu cho thấy chè xanh có khả năng bảo vệ cơ thể chống lại các bệnh lý liên quan đến tuổi tác và các bệnh thoái hóa thần kinh như Parkinson, Alzheimer, và tai biến do thiếu máu cục bộ Ngoài ra, chè xanh cũng cho thấy hiệu quả chống bệnh tiểu đường trong các mô hình động vật kháng insulin.
[42, 43] và thúc đẩy tiêu hao năng lƣợng [44] Ngoài ra chè xanh còn là chất kháng khuẩn [45], chống HIV [46], chống lão hóa [47] và chống viêm [48]
Chè xanh mang lại nhiều lợi ích sức khỏe chủ yếu nhờ vào hoạt tính chống oxy hóa và khả năng tiêu diệt gốc tự do của catechin Sự hiện diện của các nhóm phenolic hydroxy trên vòng B của catechin (EC và ECG) và trên các vòng B và D của gallocatechin (EGC và EGCG) là yếu tố quan trọng cho hoạt tính này Ba nhóm hydroxy trên vòng B đã được chứng minh là cần thiết cho khả năng chống oxy hóa và tiêu diệt gốc tự do của catechin Ngoài ra, khả năng bắt giữ kim loại của catechin cũng đóng vai trò quan trọng trong hoạt tính chống oxy hóa Nghiên cứu gần đây của Mandel chỉ ra rằng rối loạn chuyển hóa sắt có thể là nguyên nhân chính gây bệnh Parkinson, do đó, khả năng bắt giữ kim loại của EGCG rất quan trọng trong việc bảo vệ tế bào thần kinh khỏi căn bệnh thoái hóa này.
Chè xanh không chỉ có tác dụng chống oxy hóa mà còn ảnh hưởng đến các phân tử và tế bào tham gia vào con đường truyền tín hiệu liên quan đến quá trình chết tế bào lập trình (apoptosis) Nghiên cứu đã chỉ ra rằng những tác động này xuất hiện ở cả tế bào thần kinh và tế bào biểu mô/nội mô khối u Tuy nhiên, vẫn chưa rõ liệu các tác dụng này có phải là kết quả của sự cân bằng giữa các chất pro-oxidant và antioxidant trong tế bào hay do tác động trực tiếp của EGCG và catechin lên các phân tử đích, không phụ thuộc vào hoạt tính chống oxy hóa của chúng Hơn nữa, hầu hết các cơ chế phân tử hiện nay đều dựa trên nghiên cứu nồng độ EGCG in vitro, mà nồng độ này vượt xa mức độ có trong cơ thể sống.
Các catechin trong chè xanh có khả năng kháng u bằng cách kìm hãm sự tăng sinh tế bào khối u và ức chế các con đường phân tử liên quan đến chu kỳ tế bào, quá trình tạo thành mạch, xâm lấn và tăng sinh do hormon EGCG cho thấy tác dụng điều trị bằng cách ức chế các yếu tố tăng trưởng và protein p21, p27 ở tế bào ung thư vú và tiền liệt tuyến Ngoài ra, EGCG cũng ức chế yếu tố phiên mã NF-κB và AP-1, góp phần giải thích hoạt tính chống oxy hóa của catechin Hoạt tính tiêu diệt gốc tự do của catechin chè xanh làm giảm hoạt hóa NF-κB, từ đó ức chế biểu hiện gen pro-inflammatory và chống apoptotic Hơn nữa, EGCG trực tiếp ức chế hoạt tính proteasome, dẫn đến tích lũy các protein ức chế NF-κB và các protein pro-apoptosis như Bax Cơ chế này cũng tương tự như việc ức chế nitric oxide syntase, một enzym quan trọng trong hoạt động chống viêm Cuối cùng, chè xanh còn ức chế hình thành mạch và xâm lấn của khối u bằng cách bất hoạt metalloproteinaza và giảm biểu hiện thụ thể yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu.
Các catechin trong tế bào thần kinh có khả năng bảo vệ tế bào ở nồng độ thấp hơn nhiều so với nồng độ cần thiết để tiêu diệt các tế bào ung thư.
Catechin, đặc biệt là EGCG, có khả năng bảo vệ tế bào thần kinh nhờ vào hoạt tính chống oxy hóa và khả năng bắt giữ kim loại Nghiên cứu cho thấy EGCG ở nồng độ 1-10 µM có thể ngăn chặn sự chết tế bào thần kinh do β-amyloid và 6-hydroxydopamine thông qua việc kích hoạt protein kinase C (PKC), một yếu tố quan trọng cho sự sống còn của tế bào thần kinh Khi PKC bị bất hoạt, sẽ dẫn đến sự tích tụ amyloid-β và các độc tố thần kinh khác EGCG cũng làm giảm biểu hiện của các gen proapoptotic như BAX, BAD, caspase, và p21, từ đó thể hiện hoạt tính bảo vệ hệ thần kinh ở cấp độ tế bào Hơn nữa, EGCG ảnh hưởng đến quá trình chế biến protein tiền chất amyloid (APP) bằng cách thúc đẩy con đường α-secretase không tạo amyloid và kìm hãm con đường β-secretase, giảm tổng hợp sợi β-amyloid.
Ảnh hưởng của EGCG và các catechin trong chè xanh lên cấp độ tế bào phụ thuộc vào liều lượng và loại tế bào, đóng vai trò quan trọng hơn chỉ là hoạt tính chống oxy và tiêu diệt gốc tự do Hiệu quả in vivo của chè xanh phụ thuộc vào liều lượng và dược động học Mối liên hệ giữa hoạt tính và liều lượng, cũng như loại tế bào khối u và tế bào thần kinh chịu tác động là rất cần thiết, và các nghiên cứu vẫn đang tiếp tục khám phá Chè xanh đã được sử dụng hàng thế kỷ ở châu Á mà không gây độc tính, cùng với nhiều truyền thuyết về lợi ích sức khỏe, cho thấy rằng catechin, đặc biệt là EGCG, có tiềm năng trở thành một lớp dược chất mới Các hoạt chất lý tưởng nên bắt chước tác dụng bảo vệ của chè xanh để mang lại lợi ích mà không cần thay đổi lối sống.
1.3.2 Hoạt tính chống ôxy hóa[11, 49]
Hoạt tính chống ôxy hóa của catechin không galloyl (như EC và EGC) và catechin galloyl (như ECG và EGCG) chủ yếu được xác định bởi các nhóm hydroxy phenyl trên vòng C Cấu trúc 3,4,5-trihydroxyphenyl trên vòng C đóng vai trò quan trọng nhất trong khả năng dọn gốc tự do của các hợp chất này, với thứ tự hoạt độ chống ôxy hóa là EGCG > ECG > EGC > EC Nghiên cứu của Rice-Evans đã chỉ ra rằng hoạt tính dọn gốc tự do của EGCG vượt trội hơn hẳn so với vitamin C và E.
1.3.3 Hoạt tính diệt khuẩn, kháng viêm, kháng virus [45,46,48]
Tháng 8/1996 giáo sư T Shimamura tại trường đại học y khoa Showa (Nhật
Bản) đã có công trình diễn thuyết "về tác động diệt khuẩn E-coli-157" tại hội thảo chuyên đề diệt khuẩn của chè xanh
Catechin, hợp chất chính tạo nên vị đắng của chè xanh, có khả năng tiêu diệt hầu hết các loại vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm và loại bỏ độc tố mà chúng tiết ra, đặc biệt là độc tố veratoxin của E.coli -157.
Uống chè xanh trong và sau bữa ăn có thể tối ưu hóa tác dụng của chất catechin, giúp tiêu diệt vi khuẩn Các nghiên cứu cho thấy chè xanh ngâm trong nước muối với nồng độ 2,5% - 5% mang lại hiệu quả cao hơn so với trà thông thường Ngâm chè xanh trong nước nóng cũng làm gia tăng sự giải phóng catechin, từ đó cải thiện khả năng diệt khuẩn Tuy nhiên, các chuyên gia khuyến cáo không nên uống chè xanh, đặc biệt là trà nóng, trước bữa ăn vì điều này có thể làm giảm cảm giác thèm ăn do dịch vị tiết ra trong miệng.
Chè xanh đã được biết đến với khả năng ngăn ngừa sâu răng trong nhiều thập kỷ, nhưng gần đây, EGCG đã thu hút sự chú ý nhờ khả năng ức chế lây nhiễm HIV và các chủng kháng đa thuốc Staphylococcus aureus EGCG ức chế sự nhân bản của HIV-1 bằng cách ngăn chặn enzyme sao chép ngược HIV reverse transcriptase và làm rối loạn quá trình bám của vỏ virus Nghiên cứu của Kawai cho thấy EGCG ngăn chặn sự bám dính của các virion HIV-1, gp120 và phân tử CD4 lên bề mặt tế bào miễn dịch T-help, từ đó ngăn ngừa bước khởi đầu của sự lây nhiễm HIV-1 Ngoài ra, nghiên cứu của Chang và các cộng sự đã chứng minh rằng các catechin như epigallocatechin, epicatechin gallat và epigallocatechin gallat được chiết xuất từ chè xanh có tác dụng tích cực trong việc này.
Camellia sinensis L - có tác dụng ức chế, gây miễn nhiễm với vi rút HIV, IC 50 của epigallocatechin là 7,8; của epicatechin gallat là 0,32 và của epigallocatechin gallat là 0,63 mmol [46]
1.3.4 Một sốnghiên cứu ứng dụng các catechin phòng và trị ung thƣ [32,33]
Chè xanh chứa nhiều polyphenol, đặc biệt là hoạt chất EGCG, đóng vai trò quan trọng trong việc phòng ngừa bệnh ung thư EGCG có khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ, giúp ngăn chặn các peroxidase kích hoạt quá trình sao chép nhân bản ở tế bào ung thư.
Trong giai đoạn đầu của tế bào ung thư, EGCG có khả năng ức chế AP-1, một chất dẫn truyền khơi mào sự phát triển của tế bào ung thư da Nó cũng ngăn chặn protein kinase, enzyme kích hoạt tế bào trong quá trình phát triển của ung thư, đồng thời ức chế hoạt động của telomerase, làm giảm thời gian sống của tế bào ung thư.
EGCG có khả năng can thiệp vào quá trình ung thư bằng cách ức chế hoạt động của urokinase, một enzyme quan trọng trong sự phát triển và biến đổi của tế bào ung thư Nó cũng có thể phá hủy các dạng biến đổi đặc thù của tế bào do adenovirus gây ra và ngăn chặn quá trình tổng hợp AND trong các loại ung thư như hepatoma, leukemia và ung thư phổi.
CÁC NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ HÓA HỌC CHIẾT, TÁCH VÀ ĐIỀU CHẾ CÁC CATECHIN VÀ DẪN XUẤT
CHẾ CÁC CATECHIN VÀ DẪN XUẤT
1.4.1 Các kỹ thuật công nghệ chiết catechin từ chè xanh
Hiện nay, các phương pháp chiết xuất catechin từ chè xanh, hay còn gọi là polyphenol chè xanh, đang được áp dụng phổ biến tại Trung Quốc và trên toàn thế giới.
[9, 50 - 59] Phương pháp chiết có thể mô tả theo sơ đồ chung dưới đây (hình 1.4):
Hình 1 3: Quy trình tóm tắt công nghệ chiết Polyphenol chè xanh trên thế giới
Catechin, một hợp chất phân cực thường có trong chè xanh, được chiết xuất hiệu quả bằng các dung môi phân cực như ethanol và methanol Các nghiên cứu cho thấy chiết xuất chè xanh bằng dung môi phân cực mang lại hoạt tính chống ôxy hóa cao hơn so với dung môi có độ phân cực thấp như n-hexane hay ether Tuy nhiên, quá trình chiết xuất cũng dẫn đến việc thu được nhiều hợp chất không mong muốn và glycosid có thể bị thủy phân khi sử dụng dung dịch nước axít làm dung môi.
Các dung môi phân cực yếu có ưu điểm vượt trội trong việc tinh chế dịch chiết từ dung môi phân cực Hầu hết các catechin và aglycon với phân tử lượng thấp đều hòa tan trong các dung môi này, mang lại tính chống ôxy hóa cao Một số phương pháp chiết catechin từ chè xanh bằng dung môi hữu cơ có thể tham khảo như sau [56-59]:
Phương pháp ngâm chiết của Delaunay J.C và các cộng sự sử dụng 100 g lá chè ngâm trong 1 lít dung dịch Nước/Acetone (tỉ lệ 3:2) ở nhiệt độ phòng trong 12 giờ Sau đó, dịch chiết được cô đặc chân không ở 40°C và chiết bằng n-hexane để loại bỏ tạp chất Cuối cùng, catechin được chiết bằng ethyl acetate và chế phẩm được đông khô thành bột mịn Sản phẩm này sau đó được phân tích để xác định các catechin và cafein bằng các phương pháp sắc ký, bao gồm sắc ký lỏng cao áp kết nối khối phổ và sắc ký điện di.
Các tác giả Xuejun Pan và Guoguang Niu đã thực hiện một nghiên cứu so sánh các phương pháp chiết catechin, trong đó bao gồm kỹ thuật Soxhlet và các phương pháp chiết kết hợp viba cũng như siêu âm (bảng 1.7).
Bảng 1 7: So sánh lượng catechin chiết từ chè xanh theo các kỹ thuậtsử dụng viba, siêu âm và Soxhlet [56]
A - % Catechin so với nguyên liệu ban đầu;
B - % caffeine so với nguyên liệu ban đầu;
C - Hàm lƣợng % Catechin trong dịch chiết;
D - Hàm lƣợng % caffeine trong dịch chiết
Phương pháp MAE (Microwave-Assisted Extraction) sử dụng sóng vi ba để chiết xuất, với dung môi là hỗn hợp Ethanol và nước theo tỷ lệ 1:1 (v/v) Tỷ lệ dung môi so với nguyên liệu là 20/1, và thời gian tác dụng của sóng vi ba là 4 phút cùng với quá trình ngâm tĩnh.
UE: Phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm Dung môi Ethanol/nước (1:1, v/v) tỷ lệ dung môi/nguyên liệu là 20/1 Thời gian chiết 90 phút, nhiệt độ chiết 20 - 40°C
Soxhlet: Chiết hồi lưu trên phễu Soxhlet trong 45 phút, nhiệt độ chiết 85°C
Các phương pháp thu nhận catechin nêu trên mang lại hiệu suất cao và phù hợp với các quốc gia phát triển có công nghệ tiên tiến, cho phép tự chủ về dung môi và hóa chất Điều này không chỉ giúp giảm giá thành sản phẩm mà còn đặc biệt quan trọng đối với các khu vực thiếu nguyên liệu chè phế loại.
1.4.2 Sắc ký lỏng hiệu năng cao trong phân tích và phân tách catechin
Năm 1976, Hoefler và Coggon lần đầu tiên áp dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để phân tích thành phần của chè xanh và chè đen, sử dụng cột sắc ký pha đảo Bondapak đ C18 (10 µm) với hệ dung môi rửa giải isocratic Đến năm 1983, Robertson và Bendall cải tiến hệ thiết bị bằng cách sử dụng cột sắc ký Hypersil ODS 5 µm, giúp tăng diện tích bề mặt tiếp xúc và lượng mẫu hấp phụ lên pha tĩnh, từ đó tối đa hóa hiệu quả tách Mặc dù hệ thống này mang lại hiệu quả tách tốt, nhưng khả năng tái sinh định lượng vẫn rất thấp.
Cuối thập kỷ 80, hệ thống HPLC với đầu dò photodiode array (PDA) đã trở thành công cụ phân tích quan trọng trong nghiên cứu hóa học của chè HPLC được ứng dụng để phân tích các sản phẩm trong hệ thống lên men in vitro, đặc biệt là thearubigin Nghiên cứu của Bailey và cộng sự đã thành công trong việc phân tích polyphenol chè xanh bị oxy hóa trong mô hình lên men hóa học, sử dụng HPLC với đầu dò PDA và hệ dung môi rửa giải gradient Hệ HPLC đã được cải tiến, trở thành công cụ phân tích hiệu quả cho nhiều loại mẫu khác nhau, giúp phân lập các chất gần nhau và tách biệt thearubigins bị polymer hóa trong nghiên cứu hóa học thearubigin.
Một hệ thống phân tích HPLC cải tiến đã cho phép phân lập và xác định nhiều sắc tố mới từ quá trình ôxy hóa ECG Theaflavate A, một dẫn xuất benzotropolone, được tạo ra từ sự kết hợp giữa nhóm este alloyl của ECG và vòng B của một phân tử khác từ chè đen Việc phân lập thành công Theaflavate A không chỉ làm nổi bật tính phức tạp của các hợp chất theaflavin trong chè đen mà còn mở ra một con đường phản ứng mới cho quá trình hình thành thearubigin Hệ thống HPLC cũng đã được áp dụng hiệu quả trong việc điều khiển quá trình oxy hóa polyphenol EGCG và ECG trong chè xanh, thông qua việc xác định các polyphenol và hợp chất oxy hóa tương ứng Những nghiên cứu này khẳng định rằng hệ thống HPLC là công cụ quan trọng trong việc phân tích flavonoid và polyphenol trong chè.
THỰC NGHIỆM
ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Lá chè xanh, hay còn gọi là Camellia sinensis (L.) O.Kuntze, được thu mua từ các hộ sản xuất chè tại huyện Đại Từ, Thái Nguyên Sau khi thu hoạch, chè được thái nhỏ và sấy khô ở nhiệt độ thích hợp để bảo quản hương vị và chất lượng.
110 o C trong 15 phút để diệt men, sau đó sấy lại đồng nhất hóa đến độ ẩm trung bình 5 - 10
Sau khi xay mịn nguyên liệu đến kích thước nhỏ hơn 1,5 mm, cần đóng gói vào túi HDPE kín và hút chân không Sản phẩm nên được bảo quản trong điều kiện tối, với nhiệt độ dưới 25 độ C Catechin tổng số từ chè xanh là một thành phần quan trọng cần được lưu ý.
Catechin tổng số chiết xuất từ chè xanh có màu vàng nhạt, với hàm lượng phenolic đạt trên 90% theo phương pháp HPLC Để bảo quản, catechin được lưu trữ trong lọ thủy tinh kín màu nâu, tránh ánh sáng và nhiệt độ dưới 25°C Đặc biệt, hàm lượng EGCG trong catechin tổng số đạt tối thiểu 50%.
Các catechin chè xanh đƣợc phân lập từ catechin tổng số trong quá trình thực hiện luận án, bao gồm:
Tên viết tắt EC; CAS: (2R, 3R)-2-(3,4-Dihydroxyphenyl)-3,4-dihydro-2H-1- benzopyran-3,5,7-triol;
Dạng tinh thể hình kim màu vàng sáng; Điểm nóng chảy: 173 - 177 o C;
Tan tốt trong nước nóng, ethanol, methanol
Tên viết tắt EGC; tên CAS: (2R,3R)-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)-3,4-dihydro- 2H-chromene-3,5,7-triol
Dạng bột vô định hình màu trắng hồng;
Tan tốt trong nước nóng, ethanol, methanol
Tên viết tắt EGCG; CAS: 3,4,5-Trihydroxybenzoic acid, (2R,3R)-3,4-dihydro- 5,7-dihydroxy-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)-2H-1-benzopyran-3-yl ester;
Dạng bột tinh thể màu trắng; Điểm nóng chảy: 214 - 218 o C;
Tan tốt trong nước nóng, ethanol, methanol.
CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
The article discusses the use of various chemicals in experimental processes, including methanol, ethanol, ethyl acetate, n-hexane, sodium sulfate, concentrated sulfuric acid, pyridine, silica gel Merck 60 (15 - 40 µm), Sephadex LH 20, and Diaion HP 20 These chemicals are sourced from reputable suppliers such as Merck and Sigma Aldrich, as well as technical-grade chemicals from Vietnam, China, and Singapore, ensuring the use of high-purity pA chemicals for reliable results.
Dụng cụ thủy tinh bao gồm thiết bị cô quay chân không Buechi R 210, cột sắc ký, hệ chưng cất phân đoạn để thu hồi và tinh chế dung môi, cùng với cốc thủy tinh và phễu lọc hút.
Buechner, pipet, ống đong, ống nghiệm, bình cầu, bình tam giác
Các thiết bị thử nghiệm lƣợng lớn bao gồm hệ thống chiết Soxhlet với dung tích 20 lít, thiết bị cô quay chân không Heidolph Laborota LR 20 cũng 20 lít, hệ thống sắc ký lỏng cao áp Pilot Labomatic HD 3000, hệ thống chiết phân bố hồi lưu lỏng/lỏng 80 lít, và hệ thống chiết lỏng/rắn ngƣợc dòng liên tục với công suất 100 kg nguyên liệu mỗi giờ.
2.2.2 Các phương pháp chiết chè xanh
2.2.2.1 Phương pháp chiết đun hồi lưu sử dụng cồn Đây là phương pháp chiết phân tích polyphenol chè xanh chung được áp dụng ở Trung Quốc và trên thế giới, phương pháp này được tóm tắt như sau:
Chè vụn được nghiền nhỏ và chiết xuất qua hệ thống Soxhlet 20 lít bằng ethanol trong thời gian phù hợp Sau khi chiết, dịch được làm nguội, lọc sạch và cô ethanol ở áp suất thấp để thu được chè tinh khiết.
Cao chè được chiết tách bằng n-hexane để loại bỏ các tạp chất ít phân cực Tiếp theo, phần dịch nước được chiết với ethyl acetate nhằm thu nhận các hợp chất Catechin.
Caffeine được tách ra khỏi tổng số polyphenol bằng phương pháp hồi lưu với chloroform trong thời gian hợp lý Sau khi loại bỏ caffeine, bột chiết còn lại được gọi là Catechin tổng số.
2.2.2.2 Phương pháp chiết ngược dòng liên tục dùng nước làm dung môi
Trong hệ thống chiết ngược dòng liên tục, bột chè ướt được nghiền mịn thành bùn nhão, sau đó kết hợp với dung môi chiết tại hai đầu đối diện của thiết bị Nguyên liệu chiết, thường ở dạng bùn mịn, di chuyển lên trên trong ống chiết, tiếp xúc với dung môi chuyển động ngược chiều Quá trình khuếch tán diễn ra khi chất tan từ nguyên liệu tiếp xúc với dịch chiết có nồng độ thấp hơn, làm tăng nồng độ chất chiết theo chiều dịch chuyển Khi đạt nồng độ tối ưu, dịch chiết đậm đặc chảy ra từ một đầu bình, trong khi bã gần như không còn dung môi được tháo ra từ đầu kia.
2.2.3 Các phương pháp phân tách catechin
Catechin và EGCG được phân tách bằng hệ thống sắc ký lỏng cao áp bán công nghiệp, sử dụng cột Diaion HP 20 kết nối trực tuyến với cột Sephadex LH 20 tại Trung tâm Hóa Dược, Viện Hóa học công nghiệp Việt Nam.
Hình 2 2: Hệ thống Pilot Prep HPLC và cột tách Sephadex ID 100 x L 800 mm
2.2.4 Phương pháp acetyl hóa catechin
Phản ứng acyl hóa là quá trình thay thế nguyên tử hydro trong nhóm chức -OH hoặc -NH2 bằng nhóm R-CO- Quá trình này yêu cầu amine có tính bazo mạnh và chất phản ứng cần có proton.
Phản ứng acyl hóa bằng anhydrit acetic đƣợc thực hiện theo cơ chế :
Anhydrit acetic là một acid có tính chất mạnh hơn acid carboxylic, do đó nó tham gia vào các phản ứng acyl hóa với cường độ cao hơn so với acid carboxylic Hơn nữa, phản ứng này diễn ra theo chiều một chiều và không thể tái tạo lại phenol.
2.2.5 Các phương pháp phân tích sản phẩm
Sắc kí lớp mỏng (SKLM)
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên lớp mỏng Silica gel với hệ dung môi Chloroform/Methanol/Axít citric 0,5 % theo tỷ lệ 3:2:0,2 (v/v) Phương pháp chỉ thị sử dụng ánh sáng UV/Vis ở bước sóng 360 nm và thuốc hiện là Von’s (Ce/NH4/MoO4).
Sắc ký lỏng hiệu năng cao kết nối phổ khối lượng
Các sản phẩm catechin được chiết xuất từ chè xanh Việt Nam đã được phân tích định tính và định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp với khối phổ (HPLC-MS) trên thiết bị LC/MSD-Trap-SL Agilent 1100 tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
EGCG và các hợp chất khác từ chè xanh như EC, EGC, Caffeine đã được xác định cấu trúc bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H và 13C NMR Phân tích này được thực hiện trên máy NMR Brucke AVAN 500 MHz tại Viện Hóa học, thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2.6 Thiết kế nghiên cứu của luận án
Mục tiêu của luận án là nghiên cứu công nghệ tách catechin từ chè xanh Việt Nam (Camellia sinensis L.), chuyển hóa tạo dẫn xuất và khảo sát hoạt tính sinh học của các sản phẩm thu được Chúng tôi đã xây dựng thiết kế nghiên cứu và thực hiện các bước nghiên cứu thực nghiệm cũng như lý thuyết.
Hình 2 3: Thiết kế nội dung nghiên cứu
Cụ thể các bước nghiên cứu thực nghiệm và lý thuyết được thực hiện:
THỰC NGHIỆM
2.3.1 Nghiên cứu quy trình chiết suất các catechin tổng số từ chè xanh
2.3.1.1 Nghiên cứu quy trình chiết suất các catechin tổng số từ chè xanh bằng ethanol
Tiến hành nghiền 5 kg chè vụn bằng máy nghiền ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút, sử dụng sàng 1,5 mm Sau đó, cho chè vào túi chiết trong bầu chiết Soxhlet có thể tích 20 lít Tiến hành đun chiết với ethanol trong 16 giờ ở nhiệt độ hồi lưu 75°C, với tốc độ hồi lưu điều chỉnh sao cho dịch trong bầu chiết rút xuống bình đun khoảng 10 - 15 phút mỗi lượt.
Hình 2 4: Thiết bị chiết Soxhlet 20 lít
Sau 16 giờ hồi lưu ở nhiệt độ trên, dịch chiết được để nguội xuống nhiệt độ phòng, lọc sạch và cô kiệt loại ethanol trên thiết bị cô quay chân không Pilot 20 lít Heidolph LR 20 (hình 2.5) ở nhiệt độ 60°C, áp suất 200 mbar thu đƣợc cao chè
Hình 2 5: Thiết bị cô quay chân không 20 lít Heidolph Laborota LR 20
Đầu tiên, chè được đưa vào thiết bị chiết phân bố tuần hoàn 80 lít và tiến hành chiết bằng hỗn hợp dung môi n-hexane/nước theo tỷ lệ 1:1 (v/v) Sau đó, phần dịch chiết nước và dịch chiết n-hexane được tách riêng Phần dịch nước tiếp tục được chiết phân bố với ethyl acetate ba lần, sau đó gộp các dịch ethyl acetate lại và cô đặc dưới áp suất giảm để thu được catechin tổng số thô.
Chiết xuất catechin tổng số được thực hiện trên thiết bị chiết tuần hoàn 80 lít bằng cách đun hồi lưu với chloroform theo tỷ lệ 1:10 (w/v) trong 4 giờ ở nhiệt độ 61°C Sau đó, phần dịch chloroform được thu bằng phương pháp lọc hút chân không Phần bột cao chè còn lại trên phễu lọc được sấy khô và nghiền mịn để thu được catechin tổng số.
Hình 2 7: Lọc hút chân không thu catechin tổng số
Thành phần và hàm lượng tương đối của các Catechin được phân tích bằng phương pháp HPLC-MS với điều kiện phân tích:
+ Cột Sắc ký Zorbax Eclipse XDB C18 (4,6 x 150 mm);
+ Detector ESI-MS: quét từ 100 - 600 m/z cả hai chế độ Ion dương (Positive mode) và âm (negative mode);
+ Tốc độ dòng 0,4 ml/phút;
+ Pha động Methanol/H 2 O+0.5% formic acid rửa giải theo cách gradient
2.3.1.2 Nghiên cứu quy trình chiết suất các catechin tổng sốtừ chè xanh bằng nước trên thiết bị chiết ngược dòng liên tục
Hệ thống chiết ngƣợc dòng liên tục rắn/lỏng (hình 2.8); chiều dài thân ống chiết
3000 mm; chiều dài thân ống ép 1500 mm; nạp liệu bằng vít tải Hệ thống nhận nguyên
Hình 2 8: Hệ thống chiết lỏng/rắn ngƣợc dòng liên tục
Mô tả hệ thống thiết bị(hình 2.9):
Máy chiết ngƣợc dòng liên tục chế tạo bằng thép SSU 304 dạng ống ID 400 ×
Vít tải và ép có chiều dài 5500 mm, với cấu trúc kéo dài dọc theo trục ống chiết Vít tải được chia thành 2 đoạn: đoạn chiết dài 3 m với bước xoắn không đổi là 340 mm, và đoạn vớt nộn ộp dài 2 m có bước xoắn biến đổi giảm đều xuống còn (P-10) mm.
Hình 2 9: Thiết kế máy chiết lỏng/rắn ngƣợc dòng liên tục
+ Năng lực sản xuất: 200 ~ 300 lít/giờ tương đương với 0,3 ~ 0,5 tấn/giờ;
+ Nhiệt độ chiết nguyên liệu 25°C - 30°C;
+ Thời gian nguyên liệu dừng trong máy (thời gian chiết): 95 ~ 120 phút;
+ Tốc độ quay của trục chính 0.3 ~ 1 vòng/phút;
+ Điều kiện hoạt động chịu ăn mòn và mài mòn: hoạt động ở điều kiện mang tính axit hoặc dung môi hữu cơ;
+ Mật độ dƣợc liệu trong máy ~1,2 tấn/m 3 ;
+ Hàm lượng nước trong bã 40 % - 50 %
Tiến hành nghiền 100kg chè vụn nhỏ hơn 1,5 mm và trộn với 500 lít nước pha 50 gam axit citric để tạo thành hỗn hợp nhão Hỗn hợp này được nạp vào phễu của máy chiết với tốc độ khoảng 125 kg/giờ Dung môi chiết là dung dịch axit citric 0,05% được bơm vào máy chiết bằng bơm định lượng.
Với công suất 150 lít/giờ theo đường cấp dịch ngược chiều dịch chuyển nguyên liệu, quá trình chiết xuất 600 kg bột chè nhão được hoàn thành sau 5 giờ Bã chiết có độ ẩm từ 40 - 50 % được xử lý bằng máy vắt ly tâm với tốc độ 1400 vòng/phút, sau đó được ép trên máy ép thủy lực với áp suất 75 kg/cm², cho ra bánh chè có độ ẩm cuối cùng dưới 10%.
Các dịch chiết, dịch lọc vắt và dịch ép được gom lại khoảng 1000 lít, sau đó được bơm vào thiết bị phản ứng có khuấy và gia nhiệt Chlohydric acid 1N được bổ sung đến pH khoảng 2 - 3, gia nhiệt đến 85°C và khuấy liên tục trong 4 giờ Sau khi phản ứng hoàn tất, dịch chiết được làm nguội đến nhiệt độ phòng và toàn bộ dịch chè cùng bã được lọc sạch bằng máy lọc ép để thu hồi dịch thủy phân.
Dịch thủy phân được chiết xuất bằng hệ thống chiết phân bố tuần hoàn với chloroform theo tỷ lệ 2:1, sử dụng bơm ly tâm cao tốc trong 15 phút để tách riêng phần dịch nước và chloroform Sau đó, dịch nước được chiết lại ba lần với ethyl acetate, gộp lại và làm khan bằng Na2SO4 khan, rồi cô cất chân không để thu nhận "Catechin tổng số" và thu hồi ethyl acetate Phần dịch chloroform được cô kiệt ở 50°C, 350 mbar để thu nhận cao diệp lục màu xanh đen tối, chủ yếu chứa caffeine và chlorophyll, làm nguyên liệu thô cho việc tách tinh chế caffeine và chlorophyll trong các nghiên cứu tiếp theo Quá trình thu nhận catechin tổng số từ dịch thủy phân được minh họa trong hình 2.10.
Hình 2 10: Sơ đồ quy trình thu nhận catechin tổng số từ dịch thủy phân
Thành phần và hàm lượng tương đối của các Catechin được phân tích bằng phương pháp HPLC-MS với điều kiện phân tích:
+ Cột Sắc ký Zorbax Eclipse XDB C18 (4,6 x 150 mm);
+ Detector ESI-MS: quét từ 100 - 600 m/z cả hai chế độ Ion dương (Positive
PHẦN CHIẾT NƯỚC PHẦN CHIẾT CHLOROFORM
DỊCH THỦY PHÂN Chiết với CHCl 3
DỊCH CHIẾT CATECHIN CAFFEINE THÔ
Phân tích HPLC-MS CATECHIN TỔNG SỐ
2 Cô loại kiệt ethylacetate mode) và âm (negative mode);
+ Tốc độ dòng 0,4 ml/phút;
+ Pha động Acetonitrin/H2O+1% formic acid rửa giải theo cách gradient
2.3.2 Nghiên cứu tách và tinh chế các catechin và EGCG từ catechin tổng số của chè xanh
2.3.2.1 Nghiên cứu lựa chọn chất hấp phụ có thể tái sử dụng làm pha tĩnh tách sắc ký điều chế EGCG từ catechin tổng số của chè xanh
Catechin tổng số là một thành phần quan trọng đã được nghiên cứu để tối ưu hóa điều kiện tách sắc ký, bao gồm việc lựa chọn pha tĩnh và dung môi (pha động) trên thiết bị sắc ký trung áp điều chế MPLC tại Trung tâm Hóa Dược, Viện Hóa học công nghiệp Việt Nam.
Hình 2 11: Thiết bị tách sắc ký điều chế MPLC Điều kiện thiết bị tách sắc ký điều chế MPLC:
Bơm sắc ký: MPLC Pump MD 80/100 Labomatic AG;
Tốc độ dòng 0 - ~30 ml/phút; Áp lực nén trung bình: 0,5 - 20 bar
Hệ thống cột sắc ký:
Sắc ký pha đảo: ID 50 x L 350 mm; Sephadex LH20
Sắc ký pha thường: ID 50 x L 450 mm; Silica gel 60 (Merck);
Sắc ký pha lƣỡng tính: ID 35 x L 230 mm; Silica gel CN (Merck);
Sắc ký trao đổi ion: ID 30 x L 400 mm; Diaion HP20SS;
Sắc ký hấp phụ: ID 10 x L 50 mm; pha tĩnh AP 6
Kết quả khảo sát sẽ được sử dụng trong hệ thống sắc ký lỏng cao áp điều chế Pilot để phân lập catechin từ chè xanh với số lượng lớn, nhằm phục vụ cho việc sản xuất nguyên liệu bán tổng hợp và nghiên cứu cấu trúc cũng như hoạt tính chống ôxy hóa của chúng.
Hiệu suất tách EGCG từ catechin tổng số của chè xanh đƣợc xác định bằng công thức:
H% Trong đó: m là khối lƣợng (g) EGCG tách đƣợc từ catechin tổng số
M là khối lƣợng mẫu catechin tổng số
EGCG chiếm 50,62% trong tổng số catechin được chiết xuất bằng phương pháp chiết ngược dòng liên tục Nghiên cứu này nhằm khảo sát và đánh giá hiệu quả tách EGCG từ tổng số catechin trên cột silica gel biến tính bằng phương pháp sắc ký pha động.
Nghiên cứu xây dựng điều kiện tách sắc ký điều chế MPLC:
+ Cột tách: ID 50 × L 450 mm; pha tĩnh Silica gel 60 (Merck) cỡ hạt 15 - 40 àm;
+ Mẫu khảo sát: 5 g Catechin/10 ml methanol;
+ Tốc độ dòng pha động: 10 ml/phút;
+ Pha động chạy sắc ký: Chloroform/Methanol/Axít citric 0,5 % rửa giải theo cách gradient từ 10 % - 100 % thể tích methanol
+ Phát hiện mẫu: Sắc ký lớp mỏng silica gel;
Dung môi sử dụng là Chloroform/Methanol/Axít citric với tỷ lệ 0,5% - 3:2:0,2 (v/v) Thuốc hiện được sử dụng là Von’s (Ce/NH4/MoO 4) Nghiên cứu này nhằm khảo sát và đánh giá hiệu quả tách EGCG từ catechin tổng số trên cột silica gel pha lưỡng tính RP/NP.
Nghiên cứu xây dựng điều kiện tách sắc ký điều chế pha thường MPLC trên pha tĩnh cyanosilica gel nhƣ sau:
+ Cột tỏch: ID 35 x L 230 mm; pha tĩnh LichroPrep đ CN Merck (40 - 63 àm); + Mẫu khảo sát: 2 g Catechin/2 ml methanol;
+ Tốc độ dòng pha động: 10 ml/phút;
+ Pha động chạy sắc ký: Chloroform/Methanol rửa giải theo cách gradient từ 10
+ Phát hiện mẫu: Sắc ký lớp mỏng silica gel;
Dung môi Chloroform/Methanol/Axít citric 0,5 % - 3:2:0,2 (v/v); Thuốc hiện: Von’s (Ce/NH 4 /MoO 4 ) c/ Khảo sát và đánh giá hiệu quả tách EGCG từ c atechin tổng số trên cột Sephadex LH 20
Khảo sát tách sắc ký điều chế EGCG trên cột sắc ký nạp Sephadex LH 20 theo các điều kiện sau đây:
+ Pha tĩnh: Sephadex LH 20 (40 - 63 àm);
+ Mẫu khảo sát: 2 g Catechin/1 ml Ethanol;
+ Tốc độ dòng dung môi: 10 ml/phút;
+ Dung môi chạy sắc ký: Ethanol/Nước - 95 : 5 (v/v)
+ Phát hiện mẫu: Sắc ký lớp mỏng silica gel;
Dung môi sử dụng trong nghiên cứu bao gồm Chloroform, Methanol và Axít citric với tỷ lệ 0,5 % - 3:2:0,2 (v/v) Thuốc hiện được áp dụng là Von’s (Ce/NH4/MoO4) Nghiên cứu này nhằm khảo sát và đánh giá hiệu quả tách EGCG từ catechin tổng số trên vật liệu polyme xốp có lỗ trống mạng phân tử lớn, đặc biệt là thông qua việc khảo sát hiệu quả tách EGCG trên cột sắc ký Diaion HP20 SS.
Khảo sát tách sắc ký điều chế EGCG trên cột sắc ký Diaion HP20 SS theo các điều kiện sau đây:
+ Pha tĩnh: Mitsubishi Diaion HP20 SS (200 - 600 àm);
+ Mẫu khảo sát: 0,5 g Polyphenol/1 ml metanol;
+ Tốc độ dòng pha động: 5 ml/phút;
+ Dung môi chạy sắc ký: Metanol (A)/Nước (B); trong đó:
+ Phát hiện mẫu: Sắc ký lớp mỏng silica gel;
Dung môi Chloroform/Metanol/Axít citric 0,5 % - 3:2:0,2 (v/v);
Thuốc hiện: Von’s (Ce/NH 4 /MoO 4 ) ii/ Khảo sát hiệu quả tách EGCG trên cột sắc ký nạp Polymeric AP 6
Khảo sát sơ bộ khả năng sử dụng polymer AP để tách hoặc tinh chế EGCG trên cartridge AP 6 theo các điều kiện sau đây:
+ Cột tách: Catridge AP 6 ID 10 x L 50 mm;
+ Pha tĩnh: Polymerics GmBH AP 6 (45 - 100 àm);
+ Mẫu khảo sát: 0,1 g Polyphenol/0,5 ml metanol;
+ Tốc độ dòng pha động: 1,5 ml/phút;
+ Dung môi chạy sắc ký: Metanol (A)/Nước (B); trong đó:
+ Phát hiện mẫu: Sắc ký lớp mỏng silica gel;
Dung môi: Chloroform/Metanol/Axít citric 0,5 % - 3:2:0,2 (v/v); Thuốc hiện: Von’s (Ce/NH 4 /MoO 4 )
2.3.2.2 Nghiên cứu và thử nghiệm quy trình công nghệ tách EGCG lƣợng lớn trên hệ thống sắc ký lỏng MP/HPLC Pilot a/ Khảo sát và thử nghiệm xác định ảnh hưởng của tốc độ dòng pha động đến quá trình tách sắc ký sản xuất EGCG