KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHẾ BIẾN TRÀ TÚI LỌC TỪ MỘT SỐ THẢO DƯỢC CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG α – GLUCOSIDASENgười thực hiện:VƯƠNG PHAN NGỌC QUỲNHMã SV:636551Khóa:63Ngành:CÔNG NGHỆ THỰC PHẨMGVHD:TS. VŨ THỊ HUYỀNTS. LẠI THỊ NGỌC HÀ
TỔNG QUAN
Tổng quan về các loài thảo dược lựa chọn
2.1.1 Giới thiệu về cây khổ qua
2.1.1.1 Đặc điểm thực vật học
Khổ qua còn được gọi là mướp đắng, ổ qua (miền nam), mướp mủ (dân tộc Mường, Thanh Hóa) hoặc karela Tên khoa học của khổ qua là Momordica charantia
L là một cây leo mọc ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới thuộc họ Bầu bí, có quả ăn được, thuộc loại đắng nhất trong các loại rau quả
Thân cây khổ qua là dạng thân leo nhỏ, dài và có lông, bên trong chứa bọng nước, có thể dài tới 5m và phát triển nhiều cành nhánh Lá khổ qua có nhiều lông nhỏ, nhám, thường xẻ thành 5-7 thùy đều nhau với viền răng cưa và hình trứng Lá cây mọc đơn, so le và phát triển từ thân chính cùng các nhánh.
Khổ qua có cuống dài 3-4cm, hoa màu vàng nhạt với 5 cánh và nhụy vàng đậm, thường mọc đơn độc ở nách lá, trong đó có cả hoa đực và hoa cái Sau khi hoa đực héo rụng, hoa cái sẽ được thụ phấn và đậu quả Quả khổ qua có nhiều hình dạng như hình thoi, hình trụ, hình cầu nhọn hai đầu hoặc hình quả lê, với màu sắc thay đổi từ trắng, xanh nhạt đến xanh đậm và khi chín chuyển sang vàng, da cam và nứt ra Bề mặt quả có những u vấu nổi lên màu xanh đậm Một số giống khổ qua thương mại có chiều dài lên tới 25 cm, trong khi giống hoang dã chỉ dài khoảng 5cm Khổ qua rừng thuộc cùng họ với khổ qua thương mại nhưng có kích thước nhỏ hơn, bề ngoài sần sùi hơn và vị đắng cao hơn.
Khổ qua, một loại rau quả có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới châu Á như Trung Quốc, Ấn Độ và các nước Đông Nam Á, cũng có thể xuất phát từ châu Phi và châu Mỹ Hiện nay, cây khổ qua được trồng phổ biến ở Việt Nam và nhiều quốc gia khác, đặc biệt là Ấn Độ.
Quả khổ qua rừng được phân bố rộng rãi tại nhiều quốc gia như Philippines, Malaysia, Trung Quốc, Australia, các nước châu Phi, Tây Á và Mỹ La Tinh Tại Việt Nam, cây khổ qua được trồng phổ biến ở khắp các vùng từ đồng bằng, trung du đến các tỉnh miền núi phía Bắc.
2.1.1.2 Thành phần hóa học a Thành phần dinh dưỡng
Khổ qua là một trong những cây rau ăn quả có giá trị dinh dưỡng và hàm lượng vitamin cao (Bakare và cs.,2010).
Bảng 2 1 Thành phần dinh dưỡng của lá, quả, hạt khổ qua
Tỷ lệ (%) Lá Quả Hạt Độ ẩm 17,97 ± 1,00 10,74 ± 2,29 20,69 ± 5,85
Năng lượng kcal/100 g 213,26 241,66 176,61 b Hoạt chất
Khổ qua chứa nhiều hoạt chất chính như triterpene, proteid, steroid, alkaloid, hợp chất vô cơ, lipid và phenolic, có tác dụng hiệu quả trong việc chống đái tháo đường (Snee và cs., 2010; Budart và cs., 2008).
Nghiên cứu về thành phần hóa học của cây khổ qua cho thấy hợp chất saponin trong vị đắng của nó chứa Charantin (giống insulin) và Alkaloid Khổ qua còn giàu dưỡng chất có lợi cho sức khỏe như alkaloids, charantin, cryptoxanthin, cucurbitins, cucurbitacins, diosgenin, galacturonic acids, gentisic acid, goyaglycosides, goyasaponins, gypsogenin, lanosterol, lauric acid, linoleic acid, linolenic acid, momorcharasides, momorcharins, momordenol, momordicilin, momordicins, momordicosides, momordin, oleanolic acid, oleic acid, oxalic acid, peptides, petroselinic acid, polypeptides, rubixanthin, chất đạm, chất sợi, và các vitamin A, C, folic acid (Trần Khắc Thi và Ngô Thị Hạnh, 2008).
2.1.1.3 Sử dụng quả khổ qua
Quả khổ qua khô là vị thuốc quý trong y học cổ truyền, được sử dụng để chữa trị nhiều bệnh như tiểu đường, nóng trong người, ho và viêm họng Khổ qua xanh có tác dụng giải nhiệt, tiêu đàm, sáng mắt, mát tim, nhuận tràng, bổ thận, nuôi can huyết, giúp giảm mệt mỏi, trừ nhiệt độc, lợi tiểu và giảm đau nhức xương Trong khi đó, khổ qua chín có tính chất bổ thận, kiện tỳ và dưỡng huyết Tổng quát, quả khổ qua là một loại thuốc bổ máu, giúp giải nhiệt, giảm ho, trị giun, nhuận tràng, sát trùng và hỗ trợ hạ đường huyết.
Nghiên cứu khoa học đã chỉ ra rằng quả khổ qua có nhiều tác dụng tích cực, bao gồm khả năng chống đái tháo đường, kháng vi rút, kháng u và kháng bạch cầu Ngoài ra, nó còn có tác dụng kháng khuẩn, chống nhiễm trùng, giảm cholesterol và triglycerid trong máu, hạ huyết áp, cũng như kích thích hệ miễn dịch Những hoạt chất có trong quả khổ qua được chứng minh có hiệu quả trong việc hỗ trợ sức khỏe tổng thể (Ng và cs., 1992; Raman và Lau, 1996; Basch và cs., 2003; Kumar và cs., 2010).
Hiện nay quả khổ qua được sử dụng nhiều trong lĩnh vực y dược, mỹ phẩm và thực phẩm (trà khổ qua, khổ qua sấy,…)
2.1.2 Giới thiệu về cây cỏ ngọt
2.1.2.1 Đặc điểm thực vật học
Cỏ ngọt có tên khoa học là Stevia rebaudiana, một loài thực vật có hoa thuộc họ
Cỏ ngọt, thuộc họ Asteraceae, còn được biết đến với các tên gọi như cỏ đường, cỏ mật và cỏ lạc Loài cây này lần đầu tiên được phát hiện vào năm 1908 bởi hai nhà khoa học Reseback và Dieterich.
Cỏ ngọt là cây thân thảo, phát triển quanh năm và có thể cao trên 1m, với thân và lá được bao phủ bởi lớp lông trắng mịn Lá cỏ ngọt mọc đối nhau, có hình mũi mác và mép răng cưa Hoa của cây có màu trắng ngà, hình ống dài khoảng 2cm, tỏa hương thơm nhẹ và nở thành từng cụm với nhiều bông hoa nhỏ.
Hoa cỏ sẽ nở rộ và kết thúc vào tháng 2 năm sau Tất cả các bộ phận của cây, bao gồm lá, cành, thân và rễ, đều có vị ngọt, trong đó lá là phần có vị ngọt đậm nhất.
Cỏ ngọt, có nguồn gốc từ châu Mỹ, hiện nay được trồng rộng rãi trên toàn cầu để làm chất tạo ngọt và làm thuốc Tại Việt Nam, cỏ ngọt được nhập giống vào năm 1988 và hiện có mặt chủ yếu ở các vùng như Lâm Đồng, Cao Bằng, Hà Giang và Đà Lạt, với sự phân bố tập trung nhiều nhất ở Amambay và Iquacu.
2.1.2.2 Thành phần hóa học a Thành phần dinh dưỡng
Cỏ ngọt là một loại thảo mộc giàu dinh dưỡng, với thành phần bao gồm 6,2% protein, 5,6% chất béo, 52,8% carbohydrate, 15% stevioside và khoảng 42% chất hòa tan trong nước.
Bảng 2 2 Thành phần dinh dưỡng của cỏ ngọt dựa trên nghiên cứu từ năm
2006-2011Thành phần Kết quả nghiên cứu qua các năm
Atteh và cs (2011) Độ ẩm ND 7,7 7 5,37 ND
(Ghi chú: ND có nghĩa là không xác định ) b Hoạt chất
Bridel và Lavielle (1931) đã phát hiện glycoside, một chất chuyển hóa thứ cấp, tạo nên vị ngọt của stevia Cấu trúc hóa học của glycoside diterpene được xác định vào năm 1952 Lá cây cỏ ngọt chứa tám glycoside diterpene ngọt tự nhiên, bao gồm isosteviol, stevioside, và các rebaudiosides (A, B, C, D, E, F), steviolbioside và dulcoside A (Rajasekaran và cs., 2008; Goyal và cs., 2010) Trong số đó, stevioside và rebaudioside A là hai chất chuyển hóa chính, có độ ngọt gấp 250 đến 300 lần so với sucrose (Mantovaneli và cs., 2004; Debnath).
2008) Ngoài ra, Phillips (1987) đã chỉ ra rằng cỏ ngọt cũng chứa một số tinh dầu, tanin là flavonoid.
2.1.2.3 Sử dụng cây cỏ ngọt
Lá của cây cỏ ngọt có nhiều ứng dụng y tế như kháng khuẩn (Satishkumar và cs.,
Research has shown various health benefits of certain compounds, including antiviral properties (Kedik et al., 2009), antifungal effects (Silva et al., 2008), and the ability to lower blood pressure (Chan et al., 1998; Lee et al., 2001; Hsieh et al., 2003) Additionally, these compounds may help regulate blood sugar levels (Jeppesen et al., 2002; Benford et al., 2006) and exhibit anti-tumor activities (Satishkumar et al.).
2008), chống HIV (Takahashi và cs., 1998), …
Trong công nghiệp thực phẩm, cỏ ngọt được dùng như một chất tạo ngọt tự nhiên trong sản xuất bánh, kẹo, nước giải khát,…
2.1.3 Giới thiệu về cây quế
2.1.3.1 Đặc điểm thực vật học
Tổng quan về các hợp chất phenolic
2.2.1 Giới thiệu về các hợp chất phenolic
Theo Harbourne (1989), "phenolic" hay "polyphenol" được định nghĩa hóa học là các chất có vòng thơm với một hoặc nhiều nhóm hydroxyl, bao gồm các dẫn xuất chức năng như este, metyl ete, glycoside và các hợp chất khác Các chất này phân bố rộng rãi trong thực vật và là sản phẩm trao đổi chất phong phú, với hơn 8.000 cấu trúc phenolic đã được phát hiện, từ các phân tử đơn giản như acid phenolic đến các polyme phức tạp như tanin.
Các hợp chất phenolic bao gồm phenol đơn giản, axit phenolic, dẫn xuất axit hydroxycinnamic và flavonoid.
Các hợp chất phenolic là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng và giá trị dinh dưỡng của thực phẩm thực vật Phản ứng nâu hóa do enzyme polyphenoloxidase xúc tác là một quá trình liên quan đến các hợp chất này Ngoài ra, các hợp chất phenolic còn đóng vai trò như chất oxy hóa tự nhiên, đồng thời có khả năng ức chế gây đột biến và ngăn ngừa sự phát triển của tế bào ung thư trong thực phẩm.
2.2.2 Một số nghiên cứu về phenolic tới việc ức chế enzyme α-glucosidase
Nhiều nghiên cứu hiện nay đã chỉ ra rằng một số hợp chất phenolic có khả năng ức chế enzyme α-glucosidase, bao gồm axit phenolic và polyphenol từ chiết xuất vỏ hạt kê (Shobana, 2009), axit ellagic, cyanidin diglucoside, pelargonidin-3-rutinoside và catechin từ quả mâm xôi 'Dinkum' (Zhang và cs., 2009), cùng với chebulanin, axit chebulagic và axit chebulinic từ chiết xuất metanol trong nước của quả Terminalia chebula khô (Gao và cs., 2007).
Enzyme alpha-glucosidase
2.3.1 Đặc điểm, cấu tạo hóa học
Alpha glucosidase (EC.3.2.1.20), còn được gọi là glucoinvertase, maltase, và nhiều tên khác, là một loại glucosidase nằm ở viền bàn chải của ruột non, chiếm khoảng 2% tổng số protein trong cơ thể Enzyme này có vai trò quan trọng trong việc xúc tác phản ứng chuyển đổi oligosacarid thành các phân tử đường nhỏ hơn, giúp chúng được hấp thu vào máu.
Cấu trúc cơ bản của α-glucosidase được phân loại thành hai họ, theo nghiên cứu của Chiba (1997) Gen mã hóa enzyme α-glucosidase lysosome ở người có chiều dài khoảng 20 kb và đã được nhân bản cũng như công nhận, như được chỉ ra bởi Hoefsloot và cộng sự (1990).
2.3.2 Cơ sở khoa học sử dụng các hợp chất ức chế enzyme α-glucosidase trong điều trị bệnh tiểu đường type 2
Enzym α-glucosidase đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa carbohydrate, và việc ức chế enzym này có thể làm chậm quá trình hình thành glucose từ carbohydrate, từ đó giảm hấp thu glucose vào máu sau bữa ăn (Kajimoto, 2009) Các chất ức chế α-glucosidase có khả năng gắn vào vị trí liên kết carbohydrate của enzym nhờ sự tương đồng với cấu trúc của disaccharide hoặc oligosaccharide, tạo thành phức hợp có ái lực mạnh hơn so với phức hợp carbohydrate-glucosidase (Truscheit, 1988).
Tổng quan về trà túi lọc
2.4.1 Giới thiệu về trà thảo mộc túi lọc
Trà thảo mộc túi lọc là sản phẩm từ nguyên liệu tự nhiên như cỏ, cây, hoa, lá và quả, mang lại lợi ích cho sức khỏe Nguyên liệu này được phơi hoặc sấy khô, băm nhỏ và đóng gói trong túi lọc, giúp người tiêu dùng tiết kiệm thời gian và công sức chế biến trà, đồng thời vẫn có thể thưởng thức tách trà ngon mọi lúc, mọi nơi.
2.4.2 Các sản phẩm trà túi lọc
Trên thị trường hiện nay, trà thảo mộc túi lọc đa dạng với nhiều loại, từ trà phổ thông như trà diệp hạ châu, trà khổ qua, trà đinh lăng, trà hoa cúc cho đến các dòng trà cao cấp như trà sâm, trà linh chi Sản phẩm có nguồn gốc từ cả trong nước và nhập khẩu từ các quốc gia như Thái Lan, Hàn Quốc và Nhật Bản.
Sản phẩm trà túi lọc từ khổ qua đang ngày càng phổ biến tại Việt Nam, với những thương hiệu nổi bật như trà khổ qua rừng Mudaru, trà khổ qua Panas Karantina, trà khổ qua Cầu Tre và trà khổ qua L'angfarm Những sản phẩm này không chỉ mang lại hương vị đặc trưng mà còn có nhiều lợi ích cho sức khỏe.
ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
CỨU 3.1 Đối tượng nghiên cứu
- Khổ qua rừng được thu hái ở Tam Đường, Lai Châu.
- Quế được thu hái ở Yên Bái.
- Cỏ ngọt được thu hái ở Hà Giang.
3.2.1 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
- Bình định mức, cốc đong, pipet, micropipet, ống nghiệm, ống falcon, bình hút ẩm, giấy lọc mịn, phễu thủy tinh, giấy bạc, cốc thủy tinh, bình thủy tinh,
- Bể ổn nhiệt của máy cô quay Buchi 300
- Máy đo độ ngọt điện tử ATAGO PAL-1 của hãng Atago, Nhật Bản
- Máy đo quang phổ UV-VIS Spectro UV-2550 xuất xứ tại Mỹ
- Máy cô quay Buchi 300 của hãng Buchi Thụy Sĩ
- Tủ sấy đối lưu tự nhiên Binder ED 53 của hãng Binder, Đức
- Các chất chuẩn 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramthylchromane-2-carboxylic axit (Trolox), 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), gallic acid, thuốc thử Folin- Ciocalteu được mua của hãng Sigma Aldrich.
- Các hóa chất khác như Na2CO3 có độ tinh khiết phân tích, dung môi methanol, ethanol được mua của Trung Quốc.
- Các chất hấp phụ silica gel (40–63 μm, Kieselgel 60, Merck, 7667) và bản mỏng silica gel (Merck silica gel 60F254).
- Nước cất 1 lần, 2 lần được cất từ thiết bị của bộ môn hóa, khoa Tài nguyên và Môi trường
3.2.3 Địa điểm nghiên cứu Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Hóa, Khoa Tài nguyên và Môi trường, Học viện Nông Nghiệp Việt Nam.
Thời gian nghiên cứu đề tài từ tháng 9/2021 đến tháng 3/2022.
Xác định hàm lượng phenolic và khả năng kháng OXH của quả khổ qua rừng Điều chế đường từ cây cỏ ngọt.
Xác định các thông số công nghệ phù hợp tạo sản phẩm có hàm lượng các hợp chất phenolic cao.
Xác định loại túi lọc phù hợp cho sản phẩm trà túi lọc.
Xác định thời hạn bảo quản của sản phẩm.
Xác định khả năng ức chế enzyme α – glucosidase của sản phẩm trà túi lọc.
3.4.1 Phương pháp xác định hàm lượng chất khô tổng số
Chất khô tổng số được xác định bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi ở 105ºC.
Nguyên tắc: Tiến hành xác định độ giảm khối lượng sau khi sấy ở nhiệt độ 105ºC.
Để tiến hành, cân khoảng 15 g mẫu với độ chính xác đến miligam vào đĩa sạch đã được sấy khô đến khối lượng không đổi (m0) Sấy mẫu trong 2 giờ ở nhiệt độ 105˚C ± 1˚C Sau đó, đặt mẫu vào bình hút ẩm và cân lại Tiếp tục sấy mẫu trong 30 phút, sau đó lại đặt vào bình hút ẩm và cân lần nữa Quá trình sấy được thực hiện cho đến khi khối lượng mẫu không đổi (m1).
Tính hàm lượng chất khô tổng số, bằng %, theo công thức sau:
Ts là hàm lượng chất khô tổng số, được tính bằng phần trăm (%) Trong đó, m0 là khối lượng ban đầu của mẫu (g), m1 là khối lượng của đĩa chứa mẫu đã sấy đến khối lượng không đổi (g), và m2 là khối lượng của đĩa đã sấy đến khối lượng không đổi (g).
3.4.2 Phương pháp xác định hàm lượng phenolic tổng số
Hàm lượng phenolic tổng số trong mẫu thực vật được xác định thông qua phản ứng oxy hóa các hợp chất phenolic bằng thuốc thử Folin – Ciocalteau, theo phương pháp của Singleton & Rossi (1965).
Phản ứng oxy hóa các hợp chất phenolic bằng thuốc thử Folin-Ciocalteau, với gallic acid làm chất chuẩn, cho phép xác định hàm lượng phenolic trong mẫu Trong môi trường kiềm, các hợp chất phenolic sẽ bị oxy hóa, tạo ra ion superoxide, sau đó phản ứng với molybdate để hình thành molybdenum oxide, một phức chất màu xanh lam hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 760 nm Bằng cách đo mật độ quang của dung dịch gallic acid chuẩn, có thể xác định chính xác hàm lượng phenolic trong mẫu.
- Xây dựng đường chuẩn gallic acid
Cân 100 mg axit gallic và hòa tan trong nước cất đến vạch trong bình định mức 100 ml để thu được dung dịch axit gallic có nồng độ 1 mg/ml (1000 µg/ml) Sau đó, lấy 1 ml dung dịch này cho vào bình định mức 10 ml, tiếp tục thêm nước cất đến vạch định mức 10 ml, tạo ra dung dịch axit gallic với nồng độ 100 µg/ml Cuối cùng, tiến hành xây dựng đường chuẩn bằng cách xác định các điểm chuẩn của đường chuẩn.
Các điểm chuẩn được xác định theo bảng sau đây.
Bảng 3 1 Nồng độ và cách pha dãy chuẩn gallic acid
0 ml dd 100àg/ml + 1ml nước cất
0,2 ml dd 100àg/ml + 0,8 ml nước cất
100 àg/ml + 0,6 ml nước cất
100 àg/ml + 0,4 ml nước cất
0,8 ml dd 100àg/ml + 0,2 ml nước cất
1 ml dd 100àg/ml + 0 ml dd nước cất
Để pha và đo dãy chuẩn, chuẩn bị 6 ống nghiệm sạch và đánh số theo nồng độ 0, 20, 40, 60, 80, 100 àg/ml Hút 0,5 ml dung dịch chuẩn vào mỗi ống nghiệm, sau đó thêm 2,5 ml dung dịch Foline - Ciocalteu (pha loãng 10 lần) và lắc trong 5 phút để dung dịch phản ứng Cuối cùng, sau khi lắc xong, thêm 2 ml dung dịch vào mỗi ống nghiệm.
Hòa tan Na2CO3 7,5% và lắc đều Để dung dịch ở nhiệt độ phòng trong bóng tối trong 30 phút Tiến hành đo màu ở bước sóng 760 nm và xây dựng đường chuẩn theo dạng y = ax + b.
- Xác định hàm lượng polyphenol tổng số
Lấy 0,5ml dung dịch chiết vừa pha loãng vào ống nghiệm, tiếp tục thực hiện các bước từ (iii) đến (vi)
Dựa vào đường chuẩn đã xây dựng xác định hàm lượng phenolic tổng được tính theo công thức:
Trong đó: P: hàm lượng phenolic tổng (mg GAE/g CK) a: giỏ trị x từ đường chuẩn với gallic acid (àg/ml)
V: thể tích dung dịch cao chiết (ml)
Kết quả được quy tương đương theo số mg gallic acid/gam mẫu nguyên liệu khô (mg GAE/g CK).
Hình 3 1 Đồ thị biểu diễn độ hấp thụ quang và nồng độ gallic acid
Kết quả đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 760 nm cho các nồng độ axit gallic khác nhau được trình bày trong hình 3.1, cho thấy hệ số tương quan R² = 0,9988, cho thấy độ tin cậy cao của dữ liệu.
3.4.3 Phương pháp xác định khả năng kháng oxi hóa
- Chuẩn bị dung dịch pha loãng của Trolox trong xây dựng đồ thị chuẩn
Để pha dung dịch Trolox 1000 µg/ml trong methanol, bạn cần cân chính xác 10 mg Trolox vào bình định mức 10 ml Sau đó, thêm methanol đến vạch định mức 10 ml để thu được dung dịch Trolox 1000 µg/ml Cuối cùng, hút chính xác 0,5 ml dung dịch Trolox 1000.
g/ml vào bình định mức 10 ml, sau đó thêm dung dịch methanol đến vạch định mức
10 ml thu được dung dịch Trolox 50 g/ml Từ dung dịch Trolox 50 g/ml pha thành các dung dịch nồng độ 0, 10, 20, 30, 40, 50 g/ml.
- Chuẩn bị dãy chuẩn và xây dựng đường chuẩn
Chuẩn bị các ống sạch và đánh số thứ tự tương ứng theo các nồng độ 0, 10, 20, 30,
Hút chính xác 0,5 ml dung dịch chuẩn với nồng độ 40 và 50 µg/ml vào từng ống nghiệm, sau đó thêm 2,5 ml DPPH 0,1mM Đối với mẫu có nồng độ 0, thay dung dịch chuẩn bằng 90% MeOH Lắc đều và để yên trong 30 phút trong điều kiện tối Cuối cùng, đo độ hấp thụ quang tại bước sóng 517 nm và xây dựng đường chuẩn với phương trình y = ax + b.
Khả năng kháng oxy hóa
Hoạt tính kháng oxy hóa của các hóa chất sinh học được đánh giá bằng cách đo khả năng trung hòa gốc tự do thông qua phản ứng mất màu của dung dịch DPPH trong methanol, theo phương pháp của Paulpriya và cộng sự (2015) Dung dịch DPPH được pha chế với nồng độ 0,1 mM trong methanol nguyên chất Cụ thể, 2,5 ml dung dịch DPPH được trộn với 1 ml mẫu dịch chiết và hỗn hợp này được ủ trong tối ở nhiệt độ phòng trong 30 phút, sau đó tiến hành so màu tại bước sóng 517 nm.
Hoạt tính chống oxy hóa đo bằng % khử gốc tự do DPPH được tính theo công thức sau:
Trong đó: A0 là độ hấp thụ quang của mẫu trắng không chứa dịch chiết (mẫu control);
Ax là độ hấp thụ quang của mẫu thử
Khả năng kháng oxy hóa được xác định thông qua đường chuẩn trolox.
Hình 3 2 Đồ thị biểu diễn độ kìm hãm của nồng độ trolox
Kết quả đo quang hấp thụ quang ở bước sóng 517 nm của nồng độ trolox khác nhau với hệ số tương quan R 2 = 0,9999 đạt độ tin cậy cao.
3.4.4 Phương pháp điều chế đường cỏ ngọt Đường cỏ ngọt được điều chế bằng phương pháp chiết xuất các hợp chất steviol glycoside từ Cỏ ngọt bằng nước tham khảo từ quy trình tinh chiết đường cỏ ngọt được mô tả bởi (Tôn Nữ Liên Hương và cs., 2015) Cân 200 g Cỏ ngọt xay nhỏ ngâm chiết 2 lần với nước cất, ở 4C, trong 24h, mỗi lần sử dụng 300 ml nước Lọc lấy dịch lọc, đuổi bớt dung môi đến thể tích khoảng 200ml, cô quay để thực hiện các quy trình tinh chế
Dịch chiết được acid hóa bằng acid citric đến pH 3 và khuấy nhẹ trong 30 phút Tiếp theo, kiềm hóa bằng Ba(OH)2 cho đến pH 10,5 ở nhiệt độ 50°C, khuấy đều trong 1 giờ Cuối cùng, trung hòa dung dịch sau khi lọc bằng acid citric đến pH mong muốn.
7 Cô quay dung dịch đến còn 250 ml Chiết lỏng lỏng với ethyl axetat để loại phần tạp còn lại, thu lấy lớp nước, sau đó cô quay đến khô dưới áp suất giảm thu được cao chiết chứa các hợp chất steviol glycoside (Hình 3.3).
Hình 3 3 Chiết lỏng lỏng dịch chiết nước cỏ ngọt bằng ethyl axetat loại tạp chất
Hợp chất steviosid được chiết xuất qua phương pháp sắc ký cột (SKC) với silica gel làm chất hấp phụ Quá trình rửa giải cột sử dụng dung môi ethanol 90% giúp thu được các phân đoạn chứa steviol glycoside.
Hình 3 4 Sắc kí cột tách các hợp chất steviol glycoside từ cao chiết cỏ ngọt