TỔNG QUAN CHUNG
T ng quan v acrylamide 2 ổ ề
Acrylamide (AA) là chất hóa học có công thức phân tử C 3 H 5 NO CAS 79-06-1, phân tử lư ng ợ là 71,079 g/mol và tên danh pháp quố ế IUPAC là propc t -2-enamide
+ Là tinh thể màu trắ , không mùi ng
+ Áp suất hơi: thấp (0,007 mmH g 25ở o C, 0,03 mmHg 40ở o C, 0,07 mmHg 50ở o C và 0,14 mmHg 55ở o C)
+ Nhiệ ột đ sôi: 87,2 C 2 mm Hg° tại
+ Ở điều kiện phân hủy không nhiệ ạo thành NHt t 3 , dưới tác dụng c a nhiủ ệt độ ẽ s phân ủy thành CO, CO h 2 , NO x …
+ Độ tan c a acrylamide trong dung môi phân c c và không phân củ ự ực như sau :
B ng 1ả : Độ tan của acrylamide trong các dung môi Tên dung môi Độ hòa tan (g/l) Tên dung môi Độ hòa tan (g/l)
Axit acrylic (AA) là một hợp chất hữu cơ nhỏ có nhóm vinyl electrophilic, có khả năng phản ứng với các tác nhân nucleophil AA có thể bị thủy phân, làm đứt liên kết CO-NH2 Nhóm vinyl của nó có thể tương tác với amoniac, ure, formaldehyd, amin bậc 2, phosphine, clo, brom, dithiocarbamates và cả protein.
+ Tính chấ ủ nhóm vinylt c a CH 2 =CH- :
Tác dụng v i hydrohalogenua ho c halogenua ớ ặ
H-X (X 2 ) + CH 2 =CH-CO NH- 2 CH 3 -XCH CO NH- - 2
Tác dụng v i h p ch t ch a hidro hoớ ợ ấ ứ ạt động
-(R H : -S-H, NH của axit amin và protein - hoặc OH- )
+ Tính chấ ủa nhóm amide: bị thủy phân trong môi trườt c ng kiềm đặc hoặc axit đặc đứt liên k t CO-NHế 2 Ứng d ng ụ [5,14]:
Acrylamide là một hóa chất công nghiệp được hình thành từ quá trình phân hủy của acrylonitrile Hóa chất này chủ yếu được sử dụng để tổng hợp các polymer như polyacrylamide, đóng vai trò quan trọng trong việc xử lý nước uống và nước thải sinh hoạt, cũng như trong sản xuất các sản phẩm như keo dán, bao bì và các ứng dụng trong ngành y tế Ngoài ra, một số loại acrylamide còn được sử dụng trong sản xuất thuốc nhuộm và các monome khác.
1.1.2 Ngu n gồ ốc và cơ chế hình thành acrylamide trong thực phẩm a Ng ồu n g c ố
Tháng 4 năm 2002 cơ quan quản lý thực ph m c a Thẩ ủ ụy Điển đã sử ụ d ng máy sắc ký lỏng ghép 2 lần kh i ph ố ổ (LC/MS/MS) để khảo sát 100 mẫu th c phự ẩm và công bố không tìm thấy AA trong các thực phẩm chưa qua ch bi n ế ế và thực ph m ẩ luộc [18] Trong các sản phẩm khoai tây chiên hoặc các sản ph m t tinh bẩ ừ ột được chiên hoặc nướng như bánh bích qu hàm lượi, ng AA nằm trong kho ng t 50-2300 ả ừ μg/kg Năm 2003, Australia đã tiến hành khảo sát 112 m u th c phẫ ự ẩm giàu tinh bột cho k t qu ế ả hàm lượng AA trung bình trong khoai tây chiên là 501 μg/kg [9 ] Năm
Năm 2002, K.S Leung và cộng sự đã sử dụng máy sắc ký lỏng LC-MS/MS để khảo sát 400 mẫu thực phẩm truyền thống tại Hồng Kông, phát hiện acrylamide (AA) chủ yếu trong các nhóm thực phẩm như gạo, sản phẩm từ ngũ cốc, bánh và các sản phẩm bột nhão Hàm lượng AA cao nhất được ghi nhận trong khoai tây chiên.
1500-1700 μg/kg Cơ quan an toàn thực phẩm Châu Âu (European Food Safety
Authority) đưa ra báo cáo ngày 30 tháng 4 năm 2009 khảo sát hàm lượng acrylamide năm 2007 trong các sản ph m thẩ ực phẩm như sau [12]:
B ng 2ả : Hàm lượng AA trong các sản ph m thẩ ực p ẩh m [12]
Loại thực phẩm S ố lượng m u ẫ Trung bình
Các sản ph m khoai ẩ tây nấ ại nhàu t
Các loại ngũ cốc dùng ăn điểm tâm
Thực phẩm ngũ cố c dành cho trẻ em
Bánh biscuit 227 313-317 4200 b Cơ chế hình thành
Acrylamide được hình thành chủ yếu qua hai cơ chế khác nhau trong các loại thực phẩm Nhiều giả thuyết đã được đặt ra để giải thích cơ chế này, cho thấy sự đa dạng trong quá trình hình thành acrylamide ở các loại thực phẩm khác nhau.
Acrylamide được hình thành qua phản ứng Maillard giữa asparagine (một loại axit amin có trong khoai tây và ngũ cốc) và đường tự nhiên trong thực vật khi chiên rán ở nhiệt độ cao (>120 °C) Sự hình thành acrylamide phụ thuộc vào nhiều yếu tố như lượng asparagine, lượng đường, và nhiệt độ chế biến Nghiên cứu cho thấy, lượng acrylamide tạo ra nhiều nhất từ các loại đường như glucose và fructose, trong khi các axit amin khác hầu như không tham gia vào phản ứng Maillard hoặc chỉ tạo ra lượng acrylamide rất thấp.
Sơ đồ 1 Chuyển hóa của AA trong th c ph m [20] ự ẩ
Cơ chế thứ hai liên quan đến việc hình thành acrylamide từ các loại dầu và hợp chất chứa nitrogen có trong thực phẩm ẩm Quá trình này bắt đầu với sự chuyển hóa acrolein thành axit acrylic, sau đó axit acrylic phản ứng với NH3 sinh ra từ nhiệt phân hợp chất nitrogen (như amino acid), dẫn đến sự hình thành acrylamide.
Sơ đồ : Cơ chế hình thành AA trong quá trình xử 2 lý nhi t th c ph m [20]ệ ự ẩ
Sơ đồ : Cơ chế hình thành củ 3 a AA t amino acid ừ và lipit [20]
1.1.3 Độc tính của acrylamide đố ới v i con người
Trong 10 năm gần đây đã có rất nhiều nghiên cứ đánh giá độc tính ủu c a acrylamide đối với con người Tuy nhiên vẫn chưa có bằng chứng đầy đủ để ế k t luậ trên con ngườ nhưng có đầy đủ ằn i b ng ch ng th c nghiứ ự ệm trên động v t ậ [34,35] WHO/FAO đưa ra khuyến cáo lượng acrylamide trung bình mỗi ngày (ADI: average daily food intake) cho mọi người là 0,3 – 0,8 g/kg th μ ể trọng [37] a Độc động h c ọ
Ramsay và cộng sự đã xác định rằng sự hấp thụ acrylamide qua da chiếm 25% liều dùng Nghiên cứu độc tính học trên người cho thấy thời gian bán hủy của acrylamide dao động từ 2,4 đến 7 giờ Acrylamide được chuyển hóa chủ yếu bởi enzyme Cytochrome P4502E1.
CYP2E1 tạo ra các dẫn xuất epoxit như glycidamide, có khả năng phản ứng với DNA và protein mạnh hơn so với chất ban đầu Glycidamide và AA, là chất chuyển hóa của nó, liên hợp với glutathione (GSH) và sau đó được bài tiết ra ngoài qua đường nước tiểu dưới dạng mercapturic acid Chất này có tính độc gen và có thể gây ung thư ở con người.
Acrylamide được Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và Cơ quan Quốc tế nghiên cứu ung thư (IARC) xếp vào nhóm "có thể gây ung thư cho người" Ủy ban khoa học về Thực phẩm Châu Âu (SCF) đã kết luận rằng acrylamide có khả năng gây ung thư và có thể ảnh hưởng đến di truyền, do đó khuyến cáo cần hạn chế tối đa acrylamide trong thực phẩm Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 9776:2013 đã đưa ra quy phạm thực hành nhằm giảm thiểu acrylamide trong thực phẩm.
Nghiên cứu cho thấy chuột ăn chế độ giàu acrylamide có nguy cơ mắc các bệnh ung thư, như ung thư vú, tuyến giáp và tuyến thượng thận, cao hơn so với chuột không ăn chất này Đối với con người, các nhà khoa học khẳng định chế độ ăn uống nhiều acrylamide có thể làm tăng nguy cơ mắc các loại ung thư như ung thư vú, ung thư buồng trứng, ung thư thực quản và ung thư tế bào thận.
Các nhà khoa học đã chỉ ra rằng cơ chế gây tổn thương DNA và protein liên quan đến axit amin (AA) thông qua phản ứng Michael Các nhóm chức như -SH của cystein, homocystein, và -NH2 của guanin, adenin, cùng với protein, là nguyên nhân chính dẫn đến sự tổn hại này Nghiên cứu cho thấy việc tiêu thụ AA với liều lượng 10, 20 và 30 mg/kg gây ra tổn thương DNA đáng kể, đồng thời có thể gây độc thần kinh.
Acrylamide đã được chứng minh là gây độc cho hệ thần kinh thông qua các thí nghiệm trên động vật, với liều dùng từ 0,5-50 mg/kg thể trọng Chất này gây thoái hóa hệ thần kinh ngoại vi, dẫn đến mất cảm giác ở tay chân, suy giảm chức năng vận động, giảm khả năng nhận thức và gây mất trí nhớ Tác động của acrylamide với liều thấp hơn trong thời gian dài vẫn đang được nghiên cứu Về độc tính sinh sản, liều không gây độc tính ở chuột là 2–5 mg/kg/ngày, cao hơn so với liều gây độc tính thần kinh Sử dụng acrylamide ở liều từ 0,5-10 mg/kg/ngày có thể gây chậm phát triển ở chuột và giảm trữ lượng tinh trùng Nghiên cứu của Wei cho thấy acrylamide cũng gây độc cho hệ sinh sản của chuột cái, làm giảm trọng lượng cơ thể và nồng độ progesterone huyết thanh một cách đáng kể.
Giới hạn nồng độ acrylamide được quy định b i mở ột số ổ t chức như sau:
B ng 3ả : Giớ ại h n nồng độ AA Nguồn Giớ ạn cho phépi h T ổ chức
Nước u ng ố 1,0 μg/l WHO-World Health
M phỹ ẩm chăm sóc cơ thể 0,1 mg/kg EU Commission 2002a Không khí nơi làm việc 30 μg/m 3 AFS 2005:17
Vật liệu bao gói thực ph m ẩ 10 μg/kg EU Commission, 2002b
1.1.5 Các phương pháp định lượng acrylamide đã được công bố Đã có rất nhiều các nghiên cứu đươc đăng tải trong h u hầ ết các tạp chí khoa học v ề phương pháp phân tích acrylamide trong thực ph m t ẩ ừ năm 2002 đến nay Các phương pháp xác định acrylamide dựa trên các thiế ị ắc ký khí và sắc ký lỏt b s ng v i ớ các đầu dò khác nhau (ECD; UV, DAD…) [5].
X ử lý mẫu Điều ki n s c ký ệ ắ
Chiết với nước đư c ợ axit hóa với axetic acid băng, loại protein v i ớ dung dịch Carrez I và
II, tạo d n xu t với ẫ ấ thuốc thử brom hóa (KBr, HBr, và nước
Br 2 ), b sung Naổ 2 S 2 O 3 , LLE v i EtAc/ n-hexan ớ 4: 1 (v/v), thổi khô ằ b ng
N2, SPE với Na2SO4 trên cột Florisil được kích hoạt Thổi khô b ng Nằ 2 , hòa tan ạ l i, b ổ sung TEA
151 cho d n xu t AA ẫ ấ và m/z 110, 154 cho [ 13 C 3 ]-AA d n xu ẫ ất.
GC NPD- Khoai tây chiên
- Chiết bằng nước, lọc, bão hòa với NaCl, LLE với EtAc, làm khan b ng ằ Na 2 SO 4, bay hơi
- Cột DB-WAX fused silica capillary column (30 ×0,32 mm, 0,25 μm) NPD 280◦C
WR: 1 100 ppm; – Độ thu h iồ : 106%
GC-MS Thực phẩm chế ế bi n
- Chiết bằng nước, loại béo bằng n-hexan, SPE với Sep-pak C18, SPE v i c Extrelut cho ớ ôt mẫu giàu amino acid, t o d n xu t vạ ẫ ấ ới xanthydrolin trong môi trường axit,
- Cột DB-5MS (30 m, 0,25 mm, 0,25 mm)
206 cho d n xu ẫ ất AA và m/z 254, 210 cho d3-AA
X ử lý mẫu Điều ki n s c ký ệ ắ
Chiết b ng h n hằ ỗ ợp nước và ACN, loại béo bằng n-hexan, làm sạch b ng PSA+ MgSOằ 4
C t ộ C18 Inertsil ODS 3V, 5 μm, 150 mm, 4.6 mm, c t b o ộ ả v ệ C18 Paleologos và
Chiết bằng nước, loại béo bằng n-hexan
Cột Aminex HPX- 87H (300 × 7,8 mm) MP: H 2 SO 4
LOD: 15 μg/L; WR: 45–2000 μg/LMP: H 2 SO 4 và ACN LOD: 1,5 μg/L; bim bim, bánh quy, cafe Độ thu h i: 95ồ – 105%
Chiết bằng nước, loại béo bằng n-hexan chứa aceton, bay hơi, t o d n xu t v DTAF-Cysa ạ ẫ ấ ới
- Cột: Luna Phenyl- Hexyl 100 (250 Å ×4,6 mm, 0,5 μm)
- Fluorescence: Ex480 nm, Em= 520 nm LOQ: 0,3 g/L μ
Chiết bằng nước, lọc qua màng PVDF, SPE với Oasis HLB và Bond Elut Accucat cartridges-
C Alltima C18 ột LC-MS (150 2,1mm, ×
UV 210 và 225 nm LOD: 6 μg/kg;
WR: 50 2000 g/L – μ Độ thu h i 78ồ : –107% Khoshnam và cộng s , ự
Loại béo bằng n-hexan, làm khô, chiết b ng acetone ằ và nước, l c, ọ bay hơi đến khô, hòa tan lại
UV 202 nm LOD: 2,46 ng/g WR: 20 400 ng/g – Độ thu h i:84,53ồ – 98,37%
Chiết bằng nước, lo i protein ạ b ng dung d ch Carrez I , II, loằ ị ại béo bằng n-hexan, t o d n xu t ạ ẫ ấ v i 0,1M KbrOớ 3 và KBr trong
UV 215 nm LOD: 15 μg/kg; giàu tinh bôt đã chế ế bi n môi trường axit, LLE v i EtOAc ớ và n-Hexan 4:1, bỏ ớp trên, bay l hơi ới khô, hòa tan lạt i
UV 254nm WR: 50 -500 g/L μ Độ thu h i: >90% ồ
Các nghiên cứ u acrylamide trong n n m ề ẫu bánh trung thu đã công bố
1.2.1 Phương pháp HPLC định lượng acrylamide trong thực phẩm nướng và chiên giòn ở Trung Qu c ố
Năm 2013 Haiyan Wang và cộng s ự công bố phương pháp HPLC định lượng acrylamide trong bánh Trung thu Trung Qu c ở ố như sau [15]:
Mẫu được mua t ừ các siêu thị Hualin tại Đại Đồng (t nh ỉ Sơn Tây, miền bắc Trung Quốc) đựng trong túi polyethylene gi 4ữ ở o C
Mẫu được chuẩn bị bằng cách lấy 2 gam mề gà, cho vào ống 50 ml và thêm 10 mL nước chiết trong 30 phút ở nhiệt độ 25°C Sau đó, thêm 50 μL Carrez I và 50 μL Carrez II vào ống ly tâm chứa mẫu để ủa protein, ly tâm ở tốc độ 8000 vòng/phút trong 5 phút Tiếp theo, 5 mL phần dịch phía trên được chuyển sang ống thủy tinh và bay hơi đến gần khô dưới dòng nitơ Phần còn lại sau bay hơi được hòa tan trong 2,0 ml nước cất, lọc qua bộ lọc 0,45 μm và làm sạch thêm bằng phương pháp SPE Trước khi phân tích bằng HPLC-UV, mẫu được làm sạch qua các bộ lọc tiêm PVDF 0,2 μm và pha loãng với pha động cần thiết.
Thiế ị hân tích HPLC HP 1010 đượ ị ộ ử khí, đầ dò mả
(Hewlett Packard, Wilmington, DE, USA) và buồng c t ộ có điều khi n nhiể ệt độ
Vòng mẫu 20 μL và cột Hypersil ODS-C18 250 mm 4,6 mm, 5 mm (Thermo
Nghiên cứu được thực hiện tại Waltham, MA, USA, ở nhiệt độ 30°C với bước sóng phát hiện là 210 nm Phương pháp tách rửa sử dụng gradient với pha động bao gồm hai dung môi A và B, với tốc độ dòng chảy 0,40 mL/phút Dung môi A là hỗn hợp 10% (v/v) acetonitril và 90%.
Nước ch a 0,10% (v/v) axit formic và dung môi B là acetonitril tinh khiết được sử dụng trong chương trình rửa giải Quy trình diễn ra như sau: bắt đầu với 100% dung môi A (0% B) trong 15 phút, sau đó giảm xuống còn 20% A từ 15 đến 17 phút và giữ ổn định ở mức 20% A trong 5 phút Tiếp theo, tăng trở lại 100% A từ 22 đến 24 phút và duy trì ở mức 100% A trong 16 phút Dưới các điều kiện sắc ký này, acrylamide và các thành phần thức phẩm ẩm khác trong mẫu được tách riêng và rửa giải hiệu quả.
Nghiên cứu cho thấy rằng việc sử dụng soda, baking soda và một số loại muối có thể giảm hàm lượng acrylamide lên đến 38% Điều này cho thấy rằng những phụ gia thực phẩm này có khả năng làm giảm đáng kể lượng acrylamide trong thực phẩm.
1.2.2 Nghiên cứu làm giảm lượng acrylamide trong khoai tây chiên và bánh Trung thu b ng enzym L-asparaginase ằ
Một phương pháp can thiệp hiệu quả để giảm lượng acrylamide trong thực phẩm mà không ảnh hưởng đến chất lượng và hương vị là sử dụng enzym L-asparaginase từ Paenibacillus barengoltzii Nghiên cứu của Ran Shi và cộng sự vào năm 2017 đã chỉ ra rằng enzym này có khả năng làm giảm hàm lượng acrylamide trong khoai tây chiên và bánh trung thu L-asparaginase (EC 3.5.1.1) là một loại enzyme có khả năng phân giải L-asparagine thành axit L-aspartic và amoniac, mà không làm thay đổi tính chất cảm quan của thực phẩm, nhờ vào sự hiện diện của các axit amin khác trong phản ứng Maillard, giúp tạo ra màu vàng mà không sinh ra các hợp chất gây ung thư như acrylamide.
Sau khi phân lập và tinh chế L-asparaginases, thí nghi m khệ ảo sát ảnh hưởng c a ủ nó tới giảm acrylamide như sau:
Bánh trung thu được chế biến từ các thành phần chính như bột gluten (100g), đường chuyển hóa (65g) và dầu (20g) Các thành phần này được trộn với các lượng enzyme PbAsnase khác nhau (0-80 U/g bột) và bột sau đó được nhào trộn và để yên trong 60 phút ở nhiệt độ 45°C Nhân bánh, chiếm khoảng 1/3 trọng lượng của bột, được cho vào khuôn và tạo hình Cuối cùng, bánh trung thu được nướng trong lò ở nhiệt độ 180°C trong 10 phút.
Acrylamide trong bánh Trung thu được chiết theo quy trình của Jia và cộng s ự
Cô đặc mẫu bằng cách hút chân không và hòa tan trong nước khử ion, sau đó được lọc qua màng PTFE trước khi phân tích bằng HPLC với cột C18 (AtlantisTM, 150 mm × 2,1 mm) và detector UV Nhiệt độ của cột được điều chỉnh ở 30°C, sử dụng dung dịch metanol 90% (v/v) chứa 0,01% axit formic (v/v) với tốc độ dòng 0,2 mL/phút Acrylamide được phát hiện qua detector UV ở bước sóng 205 nm.
Việc bổ sung enzyme PbAsnase vào bánh trung thu đã làm giảm đáng kể hàm lượng acrylamide, cụ thể là giảm 52% (w/w) Hàm lượng acrylamide giảm từ 654,6 μg/kg xuống còn 390 μg/kg khi liều lượng enzyme đạt 10 U/g Tuy nhiên, khi tăng liều lượng enzyme lên 80 U/g, hàm lượng acrylamide tiếp tục giảm xuống còn 316,2 μg/kg.
Hình 1: Mối liên quan nồng độ enzym và hàm lượng acrylamide [26]
T ng quan v ổ ề phương pháp HPLC
Sắc ký (chromatography) lần đầu tiên được giới thiệ vào năm 1903 do nhà thực u vật Michael C.Txvet người Nga [1] Định nghĩa của IUPAC (1993):
Sắc ký là phương pháp hóa lý quan trọng để tách các thành phần trong hỗn hợp Quá trình tách sắc ký dựa vào sự phân chia khác nhau của các chất trong hai pha không hòa lẫn, được gọi là pha tĩnh và pha động Trong thí nghiệm của Txvett, pha tĩnh được xác định là canxi cacbonat, trong khi pha động là ete dầu hỏa.
Hình 2: Qu á trình tách các sắc tố thực vật
Có nhiều cách phân loại
Sơ đồ : Phân loại các phương pháp sắ 4 c ký
1.3.3 C u tấ ạo cơ bản c a h ủ ệ thống sắc ký lỏng
Hệ thống gồm 7 phần chính [1]:
- Hệ thống bơm (Pump system)
- Hệ thống tiêm mẫu (Injection system)
- Buồng cột (Column ovent – điều chỉnh nhiệt độ cột)
- Cột sắc ký (Stationary phase – pha tĩnh)
- Pha động (Mobile phase – pha động (hỗn hợp) dung môi)
- Hệ thống xử lý số liệu
Sơ đồ 5: C u tấ ạo cơ bản c a h th ng sủ ệ ố ắc ký lỏng [1] a H ệ thống bơm cao áp
Hình 3: Bơm cao áp kiểu pittong [1]
Bơm tạo áp lực đóng vai trò quan trọng trong việc di chuyển pha động trong hệ thống, đảm bảo dòng chảy ổn định khi có sự thay đổi về thành phần pha động Áp lực của bơm phụ thuộc vào tốc độ dòng chảy, độ nhớt của pha động và kích thước của pha tĩnh Thiết bị này hoạt động với hai chế độ khác nhau để đáp ứng nhu cầu sử dụng.
- Chế độ đẳng dòng: thành phần pha động không thay đổi, thời gian phân tích dài, độ phân giải kém
- Chế độ gradient dòng: thành phần pha động thay thổi trong quá trình phân tích b H ệ thống tiêm mẫu
Dùng đưa mẫu vào hệ thống, bao gồm van 6 cổng, vòng mẫu (loop) cho phép tiêm một thể tích giống nhau vào thiết bị…
Hình 4: Van bơm mẫ ở ị trí loadu v [1]
Khi van ở vị trí nạp, mẫu được đưa vào vòng mẫu qua xilanh hoặc bơm mẫu tự động, phần thừa sẽ được thải qua cửa số 5 Dung môi từ đầu vào được bơm cao áp đẩy trực tiếp vào đầu cột qua cửa số 3 và 2.
Hình 5: Van bơm mẫ ở ị trí injeu v ct [1]
Khi xoay van đi 60 độ, van ở vị trí inject, lúc này bơm sẽ đẩy dung môi đi qua vòng mẫu, mang theo mẫu vào đầu cột c Buồng c t ộ
Dùng để ổn định nhiệt độ cột và dung môi qua cột trong quá trình phân tích d Cột sắc ký
Cột sắc ký lỏng là thiết bị đặc biệt được nhồi đầy các hạt nhồi (pha tĩnh) với kích thước chiều dài từ 5 đến 30 cm, đường kính trong từ 2 đến 5 mm, và kích cỡ hạt từ 1 đến 10 μm Trong sắc ký lỏng, có hai loại cột thường được sử dụng là cột pha thuận và cột pha đảo.
Reversed Phase Liquid Chromatography (RPLC) utilizes a stationary phase composed of silica dioxide molecules that are modified with non-polar functional groups and silanol groups This configuration is essential for effective separation and analysis in chromatography, making RPLC a vital technique in various scientific applications.
- Cột sắc ký pha thuận (Normal Phase Liquid Chromatography NPLC) Pha tĩnh - gồm các phân tử silic dioxyt có gắn các nhóm chức phân cực như gốc cyano, amino…
Hình 7: Cột pha thu n [1] ậ e Pha động
Là các dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi hữu cơ hoặc dung dịch đệm, yêu cầu:
- Độ tinh khiết cao (ví dụ Nước/đệm với MeOH/ACN)
- Không phản ứng với chất phân tích và pha tĩnh
- Không có bọt khí, không có bụi (đánh siêu âm, lọc) f Đầu dò (Detector)
Bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi mẫu và cung cấp tín hiệu ghi trên hệ thống sắc ký để thực hiện định tính và định lượng Việc lựa chọn đầu dò phù hợp phụ thuộc vào tính chất của các chất phân tích.
Tín hiệu đầu dò có thể bao gồm các thông số như độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ, cường độ điện thế, độ dẫn điện, độ ẩm, và nhiệt độ Những thông tin này sẽ được ghi nhận để phân tích và xử lý tín hiệu một cách hiệu quả.
Bộ phận này ghi nhận tín hiệu từ đầu dò phát hiện Đối với các hệ thống hiện đại, phần này được phân mềm trong hệ thống ghi nhận, lưu trữ các thông số đặc ký đồ và các thông số liên quan đến đỉnh như tính đối, sự sáng, hệ số phân giải, đồng thời thực hiện tính toán và xử lý các thông số liên quan đến kết quả phân tích.
1.3.4 C u tấ ạo đầu dò DAD
Sơ đồ 6: C u tấ ạo và nguyên lý của detector DAD [33]
5 Khe có thể được lập trình hoặc cố định
Nguyên tắc hoạt động của detector DAD sử dụng đèn phóng điện deuterium để phát ra dải bước sóng cực tím (UV) Ánh sáng được tập trung bởi gương và đi vào flow cell qua các ống dẫn sóng quang học Sau khi rời khỏi flow cell, ánh sáng được lấy nét qua gương gấp và cụm khe, sau đó phân tán lên mảng diode thông qua lưới ánh sáng ba chiều Điều này cho phép truy cập đồng thời tất cả thông tin bước sóng, giúp quét phổ trong vùng bước sóng rộng, chọn nhiều bước sóng khác nhau và định tính chính xác hơn giữa chất chuẩn và chất thử.
Phương pháp thẩm định
Thẩm định phương pháp là quá trình xác nhận và kiểm tra để cung cấp bằng chứng khách quan rằng phương pháp đáp ứng các yêu cầu đã đặt ra Kết quả của việc thẩm định phương pháp có thể được sử dụng để đánh giá chất lượng và độ tin cậy của kết quả phân tích Đây là một phần không thể thiếu nếu muốn có được kết quả phân tích đáng tin cậy Để đánh giá khả năng sử dụng của phương pháp thử, cần dựa vào các thông số cụ thể.
Các phương pháp phân tích sắc ký cần được đánh giá để đảm bảo hệ thống phù hợp cho phân tích Việc đánh giá sự phù hợp của hệ thống bao gồm các phép thử nhằm chứng minh rằng hệ thống hoạt động đúng theo mục đích sử dụng Đánh giá này cần được thực hiện hàng ngày, tùy thuộc vào độ ổn định của hệ thống và khối lượng mẫu phân tích hàng ngày.
Phép thử đánh giá sự phù hợp c a h th ng củ ệ ố ủa các phương pháp sắc ký được quy định theo nhi u t ch c (USP, USFDA) ề ổ ứ như sau:
Để đảm bảo độ chính xác trong phân tích sắc ký, cần kiểm soát thời gian lưu và diện tích pic Việc tiêm trực tiếp dung dịch chuẩn nhiều lần vào hệ thống sắc ký giúp xác định độ lệch chuẩn tương đối (RSD) Số lần bơm tối thiểu là 5 lần để đảm bảo RSD nhỏ hơn 2% Nếu RSD lớn hơn 2%, cần sử dụng 6 điểm chuẩn.
- Độ phân giải gi a hai ch t ữ ấ
- Các thông số khác: như độ trôi đường n n, nhiề ễu đường n n (khi gi i h n ề ớ ạ phát hiện đóng vai trò quan trọng trong phương pháp)
Tính đặc hiệu là khả năng phát hiện chất phân tích ngay cả khi có sự hiện diện của các tạp chất khác như tiền chất, chất chuyển hóa, chất tương tự và các tạp chất khác.
- Tính chọn lọc: ếN u ch t cấ ần xác định phân bi t rõ v i các ch t khác thì ệ ớ ấ phương pháp phân tích có tính chọn lọc.
Dựa trên khoảng tuyến tính trong tài liệu tham khảo và điều kiện thực tế, việc xây dựng đường chuẩn là cần thiết để xác định giá trị độ ốc của đường chuẩn trong công thức tính giá trị LOD và LOQ.
Hình Đư8: ờng chu n d ng y=a.x+b ẩ ạ Xây dựng đường chuẩn:
Phân tích các mẫu trắng với nồng độ khác nhau (ít nhất 6 nồng độ) trong kho ng tuyả ến tính ước lượng, mỗi nồng độ được thực hiện 3 lần Vẽ đường cong phụ thuộc giữa tín hiệu đo và nồng độ theo biểu thức: y = ax + b, trong đó a là giá trị độ dốc (slope), b là giá trị hoành độ gốc (intercept), và hệ số tương quan được ký hiệu là r.
Nếu 0,995 < R ≤ 1 : Có tương quan tuyến tính rõ rệt. y = a.x +b
Nồng độ (ng/g) Đường chuẩn
1.4.4 Độ ặ ại và độ l p l thu h i ồ Độ ặ ạ l p l i: tiến hành phân tích các ồng độ khác nhau (trung bình, thấ n p, cao) trong khoảng làm việc, m i nỗ ồng độ làm lặ ạp l i 6 lần Tính độ ệ l ch chuẩn SD và độ lệch chuẩn tương đối RSD theo các công thức sau [2]:
SD: độ ệ ẩ n: s lố ần thí nghiệm x i : Giá trị tính được của lần th nghiử ệm thứ “i” x: Giá trị trung bình của các lần th nghi m ử ệ l ch chu i
RSD% (Độ lệch chuẩn tương đối) và độ thu hồi là các chỉ số quan trọng trong phân tích mẫu Để xác định độ thu hồi, cần thêm một lượng chất chuẩn xác định vào mẫu thử hoặc mẫu trắng, sau đó phân tích các mẫu này ít nhất 6 lần bằng phương pháp khảo sát Kết quả độ thu hồi được tính theo công thức cụ thể để đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của phương pháp phân tích.
Trong đó: R%: Độ thu hồi, %
Cm+c: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn
C m : Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử
C c : Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết)
C tt : Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn
Thêm chất chuẩn ở ba mức nồng độ thấp, trung bình và cao trong khoảng nồng độ làm việc 0,5 lần, 1 lần và 2 lần giới hạn cho phép Sau khi đánh giá độ thu hồi, kết quả sẽ được so sánh với các giá trị trong bảng Độ thu hồi ở bốn nồng độ khác nhau sẽ có những kỳ vọng khác nhau.
B ng 4ả : Độ thu hồi và độ ệch chuẩn tương đối ở các khoả l ng nồng độ khác nhau Hàm lượng % T l ỉ ệ chất Đơn vị Độ thu h i % ồ RSD %
1.4.5 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ tối thiểu mà tại đó giá trị đo được có thể xác định vượt qua độ không đảm bảo của phương pháp Đây là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu mà có thể phát hiện nhưng chưa thể định lượng chính xác.
Cách xác định (dựa trên đường chu n) ẩ
LOD có thể được xác định dựa vào độ ố d c của đường chuẩn và độ ệ l ch chu n ẩ của tín hiệu đo. a
Trong đó: SD: Độ ệ l ch chu n cẩ ủa tín hiệu d ng chu n a: Độ ốc của đườ ẩ
SD đượ tính bằng cách phân tích lặ ạc p l i 10 l n m u trầ ẫ ắng thêm chuẩ ở ần g n nồng độ LOD ước lư ngợ
Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ tối thiểu của chất cần phân tích có trong mẫu thử mà chúng ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát, đảm bảo kết quả đạt độ chính xác mong muốn.
Nguyên tắc thực hiện phân tích mẫu là tiến hành vào các ngày khác nhau trong điều kiện thí nghiệm không thay đổi Độ tái lặp của phương pháp được đánh giá thông qua hệ số RSD, trong khi độ đồng nhất thống kê của các kết quả thí nghiệm ở hai ngày thực hiện cũng được xem xét thông qua phương pháp phân tích phương sai một yếu tố bằng Excel ANOVA SINGLE FACTOR.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vậ ệu và thiế ị t li t b
- Mẫu bánh Trung thu t ự làm được nướng 3 l n 180ầ ở o C
- Mẫu bánh Trung thu mua ngẫu nhiên ở chợ, siêu thị ửa hàng tạp hóa, bán online , c trên mạng
* M u tr ng: ẫ ắ bánh trung thu trước khi nướng
2.1.2 Hóa chất và thiế ịt b
* Các hóa chất tinh khi t: ế
- Aetone (tinh khiết dùng cho HPLC)
- Methanol (tinh khiết dùng cho HPLC)
- Nước cất 2 lần dùng cho phân tích
- Chất chuẩn acrylamide (Sigma Aldrich > 99,0%)
- H ệ thống sắc ký: Hệ thống Agilent 1260 Inifity II (USA)
+ Bơm cao áp 1260 Quat Pump (G7111B)
+ Ph n mầ ềm: OpenLAB software
- Máy Vortex (Model MS3D IKA USA)
- Máy ly tâm fancol 50 ml
- Máy ly tâm eppendoft: Eppendoft AG (22331 Hamburg Germany)
- Máy siêu âm GT-1620QTS (GTSonic)
- Cân phân tích CPA 224S (Germany)
- Thiết bị nghi n m u (PAXD-ề ẫ MX-AC400WRA, Panasonic)
N ội dung nghiên cứ u
Để đánh giá tác động của các yếu tố đến hàm lượng AA trong mẫu bánh Trung thu, chúng tôi đã phát triển một phương pháp phân tích định lượng sử dụng thiết bị HPLC-DAD Sau đó, phương pháp này được thẩm định và áp dụng để phân tích các mẫu bánh.
* Xây dựng phương pháp định lượng
- Khảo sát các điều ki n thiệ ết bị ắ s c ký lỏng: Pha động, tốc đ dòng, ột sắc ký.ộ c
- Khảo sát điều ki n x ệ ử lý mẫ : phương pháp chiếu t và dung môi chiết
- Thẩm định quy trình: Độ thích hợp h ệ thống, độ chọ ọ , độ ặ ại và độ n l c l p l thu h i, ồ LOD và LOQ
* Ứng dụng quy trình trên phân tích mẫu th tậ
- Mẫu bánh tự làm được nướng ở các nhiệ ột đ khác nhau
- Mẫu bánh mua ngẫu nhiên
* Đánh giá ảnh hư ng c a s lở ủ ố ần nướng tới hàm lượng acrylamide trong bánh Trung thu
* Mô hình ựth c nghi mệ
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp thu thập và xử lý mẫu
* Quy trình sản xuất bánh trung thu t ến hành như saui [2, 26]:
Sơ đồ : Quy trình làm bánh Trung thu 8 Quy trình làm bánh:
- Chọn b t ộ làm bánh là loại ột mì trắb ng mịn để có độ ẻ d o
- Trộn b t vộ ới nước đường, dầu ăn khu y k ấ ỹ để làm vỏ bánh.
- B t sau khi trộ ộn được nhào kỹ, cán mỏng mịn để làm vỏ bánh
- Nhồi nhân vào vỏ, đóng vào khuôn có sẵn
- Nướng bánh 3 lần, m i l n 5 ỗ ầ phút ở 180 o C Giữa m i lỗ ần nướng, bánh được xịt nước cho ngu i, tộ ạo độ ẩ m cho v ỏ sau đó cho vào nướng ti p ế
- Bánh nướng xong để nguội tự nhiên
* M u mua t cẫ ừ ửa hàng tạp hóa, siêu thị, ch ợ
M u ẫ được cắ ấ ớp vỏ dày 0,5 cm, xay mịn, đồt l y l ng nhất và đánh mã số ẫ m u
Để xử lý mẫu có chứa thành phần béo, cần loại bỏ các thành phần này bằng dung môi không phân cực n-hexan Sau đó, acrylamide được chiết xuất bằng hỗn hợp dung môi có khả năng hòa tan tốt, đồng thời giảm thiểu lượng tạp chất Để nâng cao hiệu quả chiết xuất, phương pháp chiết lỏng-lỏng được áp dụng và mẫu cần được làm lạnh ở nhiệt độ 0-5 °C trong 30 phút để loại bỏ hoàn toàn lớp n-hexan.
Dịch chiết đem cô khô, hòa tan lại bằng nước, lọc qua màng lọc 0,2 μ5 m và tiêm vào hệ sắc ký
2.3.2 Phương pháp phân tích b ng thi t b sằ ế ị ắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò DAD Acrylamide được xác định với hệ sắc ký bao gồm :
- Hệ sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Agilent
- Cột : Eclipse Plus C18 Agilent 5 μm, 250 mm x 4,6 mm
- Tốc độ dòng: 0,6 ml/ phút
Chuẩn bị dung dịch chuẩn có nồng độ 1 ppm từ dung dịch chuẩn gốc 20 ppm bằng cách pha loãng 20 lần trong dung dịch chiết mẫu Tiến hành tiêm lặp lại dung dịch chuẩn với nồng độ 1 ppm 6 lần bằng chương trình sắc ký đã được tối ưu Đánh giá độ thích hợp của hệ thống thông qua độ lệch chuẩn tương đối (RSD) Nếu RSD nhỏ hơn 2%, hệ thống được coi là phù hợp để phân tích.
Sử dụng phương pháp co-chromatography để chuẩn bị mẫu, bắt đầu bằng việc phân tích mẫu trắng trên thiết bị sắc ký để thu được các peak sắc ký Sau đó, thêm chuẩn vào mẫu trắng và tiến hành phân tích mẫu này Cuối cùng, so sánh sắc ký đồ của hai mẫu để đánh giá tính đặc hiệu và chọn lọc.
T dung d ch chu n gừ ị ẩ ốc 20 ppm trong nước tiến hành pha loãng thành các nồng độ 0,2 ; 0,4 ; 0,8 ; 1,0 ; 1,6 ; 2,0 ppm bằng dung d ch chi t m u tr ng ị ế ẫ ắ như sau :
B ng 5ả : Cách pha các dung dịch chu n ẩ Tên dung dịch Nồng độ (ppm) Cách pha
Để chuẩn bị các dung dịch chuẩn, thực hiện như sau: Chuẩn s 1 có nồng độ 2,0 ppm với 1 ml dung dịch chuẩn 20 ppm và 9 ml dung dịch chiết tách Chuẩn s 2 có nồng độ 1,6 ppm với 2 ml dung dịch chuẩn 20 ppm và 23 ml dung dịch chiết tách Chuẩn s 3 có nồng độ 1,0 ppm với 1 ml dung dịch chuẩn 20 ppm và 19 ml dung dịch chiết tách Chuẩn s 4 có nồng độ 0,8 ppm với 1 ml dung dịch chuẩn 20 ppm và 24 ml dung dịch chiết tách Chuẩn s 5 có nồng độ 0,4 ppm với 1 ml dung dịch chuẩn 20 ppm và 49 ml dung dịch chiết tách Cuối cùng, chuẩn s 6 có nồng độ 0,2 ppm với 1 ml dung dịch chuẩn 2 ppm và 9 ml dung dịch chiết tách.
Tiến hành phân tích bằng chương trình sắc ký đã chọn, kết quả thu được sẽ vẽ đường cong tín hiệu đo với trục tung là phản hồi và trục hoành là nồng độ Để đạt yêu cầu cho một đường chuẩn, hệ số tương quan R phải nằm trong khoảng 0,995 ≤ R ≤ 1 hoặc 0,99 ≤ R² ≤ 1.
2.3.3.4 Độ ặ ại và độ l p l thu h i ồ Để xác định độ ặ l p lại và độ thu h i bồ ằng cách phân tích lặp l i 6 lạ ần các dung dịch có nồng độ 0,4 ppm; 1,0 ppm và 2,0 ppm Tính toán độ ệ l ch chuẩn tương đối và độ thu h i ồ sau đó so sánh với tiêu chuẩn trong b ng 4 ả
2.3.3.5 Giới hạn phát hiện và giớ ạn định lượi h ng
Chuẩn b ị 6 điểm chuẩn có nồng độ 0,2; 0,4; 0,8, 1,0; 1,6; 2,0 ppm Xây dựng đường tuyến tính thể hi n m i quan h gi a nệ ố ệ ữ ồng độ AA và diện tích peak Xác định h s ệ ốa.
Chuẩn bị 10 dung dịch mẫu với nồng độ LOD ước lượng Tiến hành phân tích bằng chương trình sắc ký đã được tối ưu hóa và tính toán độ lệch chuẩn của tín hiệu đo (SD).
LOD, LOQ xác định bằng công thức: a
LOD 3 , LOQ 10 SD a Trong đó: SD: Độ ệ l ch chu n cẩ ủa tín hiệu a : Độ ố d c của đường chu n ẩ
2.3.3.6 Độ tái lặp phòng thí nghiệm
Chuẩn bị dung dịch có nồng độ 1 ppm pha trong dung dịch chiết mẫu trường Tiến hành phân tích lặp lại 6 lần vào hai ngày khác nhau Để đánh giá sự khác biệt kết quả thử nghiệm giữa hai ngày, sử dụng phương pháp ANOVA Một yếu tố.
Chương 3: ẾK T QUẢ TH C NGHI M Ự Ệ
3.1.1 Xây dựng phương pháp định lượng
3.1.1.1 Khảo sát điều ki n sệ ắc ký a L a chự ọn bước sóng
Dựa trên các tài liệu đã công bố và kết quả từ sắc ký đồ acrylamide với nồng độ 10 g/μmL, chúng tôi đã khảo sát nhiều bước sóng và lựa chọn bước sóng 202 nm do tín hiệu l n nh ớ ất thu được tại bước sóng này là tốt nhất.
Hình 9: Sắc ký đ dung môi nướ ở các bướồ c c s ng 202, 210, 226 nm ó
Hình 10: Sắc ký dồ AA 10 ppm ở các bước sóng 202, 210, 226 nm
B ng 6ả : Kết quả chọn bước sóng Bước sóng (nm) Diện tích peak (mAU* s)
Qua tham khảo các tài liệu [5] chúng tôi tiến hành chọn 2 pha động như sau để phân tích:
Hình 11: Sắc ký đồ của pha động Nước: MeOH = 96: 4 Ưu điểm: r a gi i đư c nhiử ả ợ ều thành phần ra kh i c t Peak ch t ra s m ỏ ộ ấ ớ
Nhược điểm: Do có nhiều peak tạp nên có thể ị b ch ng peak dồ ẫn đến sai l ch k t ệ ế qu ả phân tích
Hình 12: Sắc ký đồ với pha động nước Ưu điểm: R ti n, sẻ ề ẵn có Peak có hình dạng cân đối
Nhược điểm: Ch r a giỉ ử ải được các chất phân cực đến trung bình ra khỏ ột nên i c gây nhiễm b n c t ẩ ộ
Chúng tôi đã chọn nước làm pha động để phân tích acrylamide do tính sẵn có và giá thành rẻ Chương trình rửa cột được đề xuất sau khi chạy mẫu bao gồm: 50% MeOH và 50% H2O với tốc độ 1ml/phút trong thời gian 60 phút.
Dựa vào điều ki n th c t cệ ự ế ủa phòng thí nghiệm chúng tôi tiến hành khảo sát trên
2 c t Cộ : 8 InertSustain và Eclips plus C18 khi cùng phân tích mẫu trắng thêm chuẩn
Hình 13: Sắc ký đ khi phân tích bằồ ng c t C8 InertSustain ộ
Cột 2: Eclipse C18 Plus, 5 m, 250 mm x 4,6 mm μ
Hình 14: Sắc ký đ khi phân tích bằồ ng c t Eclipse Plus C18 ộ
Nhận xét: ộC t Eclipse C18 Plus cho peak cân đối hơn, diện tích peak lớn hơn
B ng 7ả : Kết quả ối ưu cột sắc ký t
Kết luậ chọn: n c t sộ ắc ký Eclipse C18 Plus và khảo sát tiế ốp t c đ dòng.ộ d Khảo sát tốc đ dòng ộ
Tiến hành phân tích cùng một m u acrylamide tẫ ở ốc độ 0,6 ml/phút, 0,8 ml/phút và 1 ml/phút cho thời gian lưu như sau:
Hình 15: Sắc ký đồ ớ ố v i t c đ dòng 0,6 ml/phútộ
Hình 16: Sắc ký đồ v i tớ ốc đ dòng 0,8 ml/phútộ
Hình 17: Sắc ký đồ v i tớ ốc đ dòng 1 ml/phútộ
Tốc đ dòngộ Thời gian lưu Diện tích peak
Nhận xét: Khi tốc độ dòng tăng, peak acrylamide được r a gi i ra sử ả ớm hơn, nhưng có xu hướng b lị ẫn vào peak tạp c a n n m u ủ ề ẫ
K t lu n: ch n tế ậ ọ ốc độ dòng 0,6 ml/phut thời gian phân tích 10 phút phù hợp, kh ả năng tách tốt e Điều ki n sệ ắc ký lựa chọn
Qua khảo sát các điều kiện chúng tôi chọn các thông số đã tối ưu như sau:
- Cột sắc ký: Eclipse Plus C18 Agilent
- Thời gian phân tích 10 phút.
3.1.1.2 Xây dựng quy trình chiết m u ẫ
Qua tham khảo tài liệ [5 và hóa chấu ] t thi t b ế ị có sẵn tai phòng thí nghiệm chúng tôi tiến hành hai quy trình chiết m u sau: ẫ
Chuẩn b ị dung môi acetone ch a 0,01% nước ứ (1)
Chuẩn b ị dung môi n-hexane đã bão hòa aceton ch a 0,01% nước ứ (2)
Cân chính xác 4,00 0,20 gam m u (ph n v ± ẫ ầ ỏ bánh dày 0,5 cm) đã xay mịn cho vào ố ng falcon 50 ml
Thêm 10 ml dung môi (1) vào ống falcon Vortex 5 phút Siêu âm 20 phút ở 40 o C
Thêm 10 ml dung môi (2) vào ống falcon, vortex 5 phút Ly tâm 4000 vòng/phút,
5 phút Để vào ngăn mát tủ ạ l nh 0-5 ở o C trong 30 phút Lo i b lạ ỏ ớp trên Chuy n ể dịch chiết sang ống falcon khác Làm 3 ầ l n với bước này.
Lấy 15 ml dịch chiết, thổi khô ằ b ng khí nitro.
Hòa tan cặn b ng ằ 1ml nước, rung siêu âm, lọc qua màng lọc
Sơ đồ : Quy trình chiế ố 9 t s 1
Hình 18: Sắc ký đồ d ch chi t m u trị ế ẫ ắng khi dùng dung môi chiết (1)
Cân chính xác 4,00 0,20 gam mẫu đã nghiền min đượ± c loại béo 2 lần v i 10 ớ ml n-hexan, lắc trong 5 phút Ly tâm 4000 vòng/phút Loạ ỏ ớp trên i b l
M u sau khi ẫ loại béo được làm khô ằng chân không b
Chiết acrylamide 3 l n b ng 10 ml aceton + 0,01% ầ ằ nước trong b ể siêu âm
15 ml d ch chi t ị ế đem bay hơi tới khô
Hòa tan c n b ng 1ặ ằ ml nước
Sơ đồ 10: Quy trình chiế ốt s 2
Hình 19: Sắc ký đồ d ch chi t m u tr ng kị ế ẫ ắ hi dùng dung môi chiết (2)
Nhậ xén t: dựa vào ắc ký đồ phương pháp chiế s 1 s , t ố ít tạp hơn so với phương pháp chiế ốt s 2
Kết luận: Chọn phương pháp chiế ốt s 1
3.1.2.1 Tính thích hợp c a h th ng ủ ệ ố
Tiến hành pha dung dịch chuẩn với nồng độ 1 ppm từ dung dịch gốc 20 ppm Sau đó, thực hiện tiêm lặp lại 6 lần theo chương trình đã chọn Kết quả thu được được trình bày trong bảng dưới đây.
B ng 8ả : Kết quả tính độ thích hợp h ệ thống
Lần tiêm Thời gian lưu
Bảng tính toán cho thấy độ lệch chuẩn của thời gian lưu là 0,0784% và độ lệch chuẩn của diện tích peak là 0,7607%, cả hai đều đạt yêu cầu (