đồ án 1_Nghiên cứu quy trình sản xuất enzyme mananase cố địnht trên Lactobacillus plantarum WCF1

Enzyme cố định. Enzyme mannanase. Lactobacillus plantarum WCF1. Nghiên cứu quá trình sản xuất enzyme mannanase cố định trên Lactobacillus plantarum WCF1 Biểu hiên enzyme mong muốn trên bề mặt tế bào vi sinh vật thông qua cơ chế phiên mã, dịch mã và tổng hợp protein tương ứng, thông qua một số cơ chế vận chuyển (hoặc cơ chế tiết) của tế bào để cố định protein hay enzyem mong muốn trên bề mặt của chúng, từ đó thực hiện các chức năng chuyển hóa cơ chất ở ngoại bào, cũng như tiền đề cho việc biểu hiện enzyme toàn tế bào

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT MANNANASE CỐ ĐỊNH TRÊN BẾ MẶT TẾ BÀO VI KHUẨN Lactobacillus plantarum WCFS1

Xử lí plasmid cần tạo dòng (và biểu hiện)

Tiến hành mở vòng plasmid bằng hai enzyme cắt hạn chế Bgl II và EcoRI, sau đó thay thế promoter PsppQ bằng promoter mạnh PslpA có trong đoạn gen được chuyển vào.

Xây dựng vector tái tổ hợp pSlpA_1261ManB

Để xây dựng plasmid pSlpA_1261, hai đoạn SlpA (~554 bp) và Lp1261- manB-myc đã được khuyếch đại PCR bằng cách sử dụng DNA từ bộ gen của

L.acidophilus ATCC4356 và plasmid pSIP_1261ManB làm mạch khuôn, tương ứng với việc sử dụng lần lượt hai cặp mồi đó là ATGCAGATCTATAAAGTTGTTTGATAAATGCTCAAC(M5)//TGCAG CTGTTTTGAAATTCATGTGGTCTTTTCCTCC(M6)vàGGAGGAAAA GACCACATGTGGTCTTTTCCTCC(M7)//ATGCGAATTCTTACAGAT CCTCTTCTGAGATG(M4) Hai đoạn kết quả được hợp nhất bằng PCR mở rộng chồng chéo, bao gồm hai bước PCR Bước PCR đầu tiên được thực hiện mà không cần thêm mồi trong các điều kiện sau: biến tính ban đầu ở 98°C trong 30 giây, tiếp theo là 15 chu kỳ biến tính ở 98°C trong 10 giây, ủ ở 65°C trong 20 giây, kéo dài ở 72°C trong 1 phút, và kéo dài thêm 5 phút ở 72°C Trong bước PCR thứ hai, cặp mồi M5//M4 được sử dụng để khuếch đại toàn bộ phần chèn chứa vị trí enzyme cắt giới giạn Bgl II đầu N và vị trí

EcoR I đầu cuối C Các mồi được thêm vào các ống phản ứng theo sau 20 chu kỳ như đã mô tả trong bước PCR đầu tiên nhưng nhiệt độ ủ là 51°C Sau đó, đoạn DNA hợp nhất chứa SlpA - lp1261- manB - myc (~1657 bp) được liên kết vào vector Bgl II- EcoR I pSIP409GusA (~5,4kb), tạo ra plasmid pSlpA_1261ManB (Hình 21) Vector này được tạo dòng trong E.coli NEB5α, trước khi được biêu hiện trong L.plantarum WCFS1

Hình 21: Cấu trúc vector tái tổ hợp pSlpA_1261ManB

Sự biểu hiện gen cấu trúc ở L.plantarum

Plasmid pSlpA_1261ManB được biến nạp vào tế bào L.plantarum

WCFS1 trờn mụi trường MRS cú chứa 5 àg/ml khỏng sinh erythromycin Để

Trong nghiên cứu này, 34 biểu hiện gen của L.plantarum WCFS1 được nuôi cấy qua đêm trong 50 ml môi trường MRS có chứa 5 µg/ml erythromycin, đạt mật độ tế bào với OD600 là 0,1 và ủ ở 37ᴼC mà không lắc Sau 4 giờ, tế bào được thu hoạch khi OD600 đạt khoảng 0,6-0,9 bằng phương pháp ly tâm ở 4000 x g trong 10 phút ở 4ᴼC Tiếp theo, dịch tế bào được rửa bằng đệm phosphate PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 2 mM).

Trong nghiên cứu này, mẫu tế bào được xử lý với dung dịch KH2PO4 và Na2HPO4, pH 7,4, sau đó được tái lơ lửng trong 1 ml PBS chứa 20 μl PMSF 50 mM Quá trình phá vỡ tế bào được thực hiện bằng máy nghiền thủy tinh Precelly 24 với kích thước hạt 0,1 mm Dịch chiết không chứa tế bào thu được sau 5 phút ly tâm ở 10.000 x g tại 4ᴼC, được sử dụng cho phân tích Western blot Kết quả cho thấy chủng mang plasmid pSlpA_1261ManB chứa gen neo lipoprotein mang mannanase (ManB) và promoter mạnh SlpA đã biểu hiện mannanase với khối lượng phân tử khoảng 51 kDa, được ghi nhận ở cột số 3.

Hình 22: Kích thước mannanase thu được ở tế bào chứa plasmid pSlpA_1261ManB (cột 3) bằng phân tích Western blot.

Sự hiển thị mannanase trên bề mặt tế bào L.plantarum

Để xác định sự hiện diện của mannanase, các nhà nghiên cứu đã sử dụng L.plantarum WCFS1 mang plasmid pSlpA_1261ManB Phương pháp được áp dụng bao gồm dòng chảy tế bào và phân tích bằng kính hiển vi huỳnh quang miễn dịch gián tiếp với mẫu 1 ml dịch nuôi cấy.

Sau khi thu hoạch 35 tế bào (OD600 ~ 0,5) sau 4 giờ ủ, tế bào được lưu trữ trong 50 µl PBS chứa 1% BSA (PBS-B) và 0,4 µl kháng thể đơn dòng Myc (pha loãng 1:5000 trong PBS-B) Sau 30 phút ủ ở nhiệt độ phòng, dịch huyền phù vi khuẩn được ly tâm ở 5000 x g trong 3 phút ở 4ᴼC và rửa ba lần với 500 µl PBS-B Tiếp theo, tế bào được ủ với 50 µl PBS-B và 0,8 µl IgG (pha loãng 1:2500 trong PBS-B) trong 30 phút ở nhiệt độ phòng trong bóng tối Sau khi ly tâm ở 4000 x g trong 3 phút ở 4ᴼC để thu nhận tế bào, các tế bào được rửa năm lần với 500 µl PBS Các tế bào nhuộm màu được phân tích bằng máy phân tích dòng chảy MACSQuant, cho thấy sự xuất hiện của mannanase cố định bên ngoài tế bào (đường màu xanh) Đối với kính hiển vi huỳnh quang miễn dịch gián tiếp, vi khuẩn nhuộm màu được quan sát dưới kính hiển vi quét laser Leica TCS SP5II với dòng laser argon tại bước sóng 488 nm, hình ảnh thu được bằng vật kính PL APO 63x/1.40.

Hình 23 minh họa sự cố định mannanase trên bề mặt tế bào L.plantarum WCFS1, sử dụng plasmid pSlpA_1261ManB Quá trình này được thực hiện thông qua hai phương pháp: phân tích dòng chảy tế bào và quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang.

Phân tích enzyme

2.6.1 Phân tích hoạt độ của enzyme cố định

Hỗn hợp phản ứng bao gồm 100 µl dịch huyền phù tế bào hiển thị mannanase trong PBS và 900 µl dung dịch galactomannan 0,5% (w/v) Dung dịch galactomannan được chuẩn bị bằng cách hòa tan LBG trong dung dịch đệm natri citrat Na3C6H5O7 50 mM (pH 6,0) ở nhiệt độ 50ᴼC trong 30 phút.

Tế bào hiển thị enzyme được thu nhận sau 4 giờ nuôi cấy bằng cách ly tâm ở 4000 x g trong 5 phút ở 4ᴼC Từ 50 ml dịch nuôi cấy, các tế bào được rửa hai lần bằng PBS và hòa lơ lửng trong 100 µl PBS Các tế bào cố định mannanase được ủ trong 900 µl dung dịch galactomannan ở 37ᴼC, trộn với tốc độ 600 vòng/phút trong 5 phút Sau đó, tế bào được loại bỏ bằng ly tâm (5000 x g trong 2 phút ở 4ᴼC), và lượng đường khử được giải phóng trong phần nổi sẽ được phân tích bằng kỹ thuật DNS Quá trình phân tích bao gồm việc trộn 100 µl phần nổi với 100 µl DNS, đun nóng ở 99ᴼC trong 10 phút, làm lạnh trong 5 phút, và pha loãng với 800 µl nước khử ion trước khi đo độ hấp phụ ở bước sóng 540 nm, sử dụng 1-5 µmol/ml D-mannose làm chất chuẩn.

2.6.2 Phân tích tính ổn định của mannanase cố định bằng neo lipoprotein Để xác định độ ổn định xúc tác của các tế bào hiển thị β-mannanase ở 37°C, các tế bào được thu thập từ các mẫu cấy 4 giờ sau khi cấy và được tái lơ lửng trong 100 àl PBS trước khi ủ ở 37°C Tại những khoảng thời gian nhất định, hoạt tính enzym của các tế bào hiển thị ManB được đo bằng cách sử dụng LBG 0,5% làm chất nền Tế bào thu được sau khi ủ với chất nền được rửa bằng 500 àl PBS và được thu thập bằng cỏch ly tõm ở 5000 ì g, ở nhiệt độ 4°C trong 2 phỳt Sau đú, cỏc tế bào được đỡnh chỉ lại trong 100 àl PBS và các hoạt động của mannanase được đo như mô tả ở (Hình 24) Quy trình này được lặp lại trong một số chu kỳ để đánh giá số chu kỳ sử dụng của bề mặt hiển thị β-mannanase

Hình 24: Tỉ lệ mannanase còn cố định lại trên màng tế bào sau các chu kì

Kết quả cho thấy enzyme β-mannanase được biểu hiện từ plasmid pSlpA_1261ManB đã giảm khoảng 51% so với mức ban đầu Tuy nhiên, hoạt động của mannanase trong L.plantarum mang plasmid này tại các chu kỳ khác nhau trong PBS ở 37ᴼC vẫn cho thấy sự ổn định đáng kể.

Hình 25: Sự ổn định của enzyme qua các khoảng thời gian ủ trên PBS

Đề xuất phương pháp sản xuất enzyme mannanase cố định bằng mô-típ neo

Thứ tự các bước Tên các bước

Xử lý vector cần tạo dòng và biểu hiện pSIP409

Mở vòng vector pSIP409 để chèn đoạn DNA tái tổ hợp SlpA - lp1261- manB - myc

2 Xây dựng và tạo plasmid tái tổ hợp pSlpA_1261ManB

Xây dựng DNA tái tổ hợp SlpA - lp1261- manB - myc và chèn vào vector pSIP409 đã mở vòng

Chuyển vector tái tổ hợp vào L.plantarum WCFS1

Biến nạp plasmid tái tổ hợp pSlpA_1261ManB vào L.plantarum WCFS1

Phát hiện tạo thành enzyme mannanase từ plasmid pSlpA_1261ManB

Phát hiện dòng mang pSlpA_1261ManB

Xác định hoạt độ enzyme cố định cũng như độ bền của liên kết giữa mannanase với neo lipoprotein

Phân lập và bảo quản giống

Sau khi tìm ra được chủng biểu hiện mong muốn, tiến hành phân lập để tạo giống thuần

Sau khi có được giống thuần thì tiến hành nuôi chiềm trong thùng nuôi cấy

WCFS1 mang enzyme cố định manananase

Cần chú ý đến các yếu tố như pH, nồng độ chất tan và mật độ L.plantarum, cũng như thời gian nuôi cấy, vì những yếu tố này có thể ảnh hưởng đến hoạt động và sự ổn định của enzyme mannanase gắn trên neo lipoprotein.