2.1. Vật liệu nghiên cứu
Vật liệu:
Để đánh giá mức độ đa dạng di truyền cả hai mức độ quần thể và loài, 148 mẫu lá từ 6 quần thể lồi Thơng đỏ bắc (Taxus chinensis) đã được thu thập (bảng 2.1). Xác định vị trí phân loại của 18 lồi Thơng thuộc bộ Thông (Coniferales) ở Việt Nam trên cơ sở xác định trình tự nucleotide của 3 vùng gen rpoC1, rbcL và matK, chúng tôi đã tiến hành thu thập một mẫu lá hoặc vỏ cây tươi cho mỗi lồi nghiên cứu với các thơng tin về địa điểm thu thập (bảng 2.2).
Các hóa chất dùng trong nghiên cứu bao gồm:
Hóa chất tách chiết và kiểm tra DNA tổng số: NaCl, CTAB, EDTA, Tris-
HCl, β-Mercaptoethanol, Isopropanol, Sodium acetate 3M, ethanol 100%, 70%, Enzym Rnase, Agarose 1%, đệm TAE 1X, Ethidium bromide.
Hóa chất nhân bản và điện di sản phẩm PCR: Đệm PCR, MgCl2, dNTP, Taq polymerase, Acrylamide, Bis – Acrylamide, Temed, Amonium fersunfate, TAE 10X, TAE 1X.
Hóa chất xác định trình tự nucleotide: Tinh sạch sản phẩm PCR dùng kít:
Quick Gel Extraction Kit QIAGEN, Dye Teminator Cycle Sequencing Kit.
Các thiết bị sử dụng:
Máy PCR Syste m 9700 (Applied Biosystem, Mỹ); máy ly tâm của hãng Hitachi (Nhật bản); bộ điện di Nytechnich (Anh); máy chụp ảnh gel (Cleaver,
Đức); máy ổn nhiệt (Memmert, .Đức). Giải mã trình tự trên máy ABI PRISM®
3100 Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Để đánh giá mức độ đa dạng di truyền giữa quần thể: 21 cặp mồi
microsatellite (cpSSR) được sử dụng thì có sáu cặp mồi cpSSR có kết quả rõ rệt, được sử dụng để đánh giá mức độ khác nhau về di truyền giữa các quần thể (bảng 2.3).
Để xác định vị trí phân loại giữa các taxon : Cặp mồi nhân bản vùng gen
lục lạp bao gồm: Cặp mồi rpoC1 được sử dụng theo thiết kế của Chương trình DNA barcodes giai đoạn 1. Cặp mồi rbcL được thiết kế dựa trên trình tự vùng gen rbcL của loài Taxus brevifolia lấy Ngân hàng gen Quốc tế (mã số: AF249666). Cặp mồi matK được thiết kế dựa trên trình tự vùng gen matK của loài Taxus wallichiana var. chinensis (HM590991). Trình tự nucleotide, kích
thước lý thuyết và nhiệt độ bắt mồi (bảng 2.4).
Bảng 2.1. Địa điểm và số mẫu thu thập cho phân tích cpSSR
Quần thể Số
mẫu Địa điểm Độ cao Vĩ độ Kinh độ
Thài Phìn Tủng 35 Thài Phìn Tủng, Đồng Văn, Hà Giang 1570 m 23o15’ Bắc 105o17’ Đông
Bát Đại Sơn 32 Bát Đại Sơn, Quản
Bạ, Hà Giang 1250 m
23o08’ Bắc
104o56’ Đông
Hoàng Liên 33 Hoàng Liên, Sa Pa,
Lào Cai 1950 m
22o12’ Bắc
103o05’ Đông
Bảo Lạc 6 Xuân Trường, Bảo
Lạc, Cao Bằng 1895 m
22o52’ Bắc
105o50’ Đông
Hang Kia 14 Hang Kia – Pà Cị,
Mai Châu, Hồ Bình 1047 m
20º44’ Bắc
104º55’ Đông
Mường Lựm 28 Mường Lựm, Yên
Châu, Sơn La 1550 m
21o01’ Bắc
104o30’ Đơng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 2.2. Danh sách các lồi Thơng dùng xác định vị trí phân loại
Loài Nơi thu thập Vùng gen
rpoC1 rbcL matK
Thuỷ tùng
Glyptostrobus pensilis EaRal, Đắk Lắk x x x Pơ mu
Fokienia hodginsii
Hang Kia- Pà Cị, Mai Châu, Hịa
Bình x x
Bách xanh núi đất
Calocedrus macrolepis
Vườn thực vật, phân Viện Lâm
sinh, Lâm Đồng x x
Bách xanh núi đá