Đoạn ITS1 – 5,8S – ITS2 được khuếch đại bằng cặp mồi mà nhiều nghiên cứu tiến hành để định tên loài nấm mốc thuộc chi Aspergillus là:
ITS 1: 5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG- 3'; ITS 4: 5'-TCCTCCGCTTATTGATATG-3'.
Thực hiện phản ứng PCR với các thành phần phản ứng thể hiện ở bảng 5.
Bảng 5. Thành phần phản ứng PCR để khuếch đại đoạn ITS1 – 5,8S – ITS2 Hóa chất Thể tích cho 1 phản ứng 50 μl Nước đề ion 36,2 µl 10X PCR buffer 5 µl 5mM dNTP 1 µl Primer I (10µM) 1,5 µl Primer II (10µM) 1,5 µl
Taq DNA Polymerase (5u/µl) 0,3 µl
25mM MgCl2 3 µl
DNA khuôn 100ng/µl 1,5 µl
Và chu trình nhiệt của phản ứng thực hiện theo bảng 6.
Bảng 6. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR cho khuếch đại đoạn ITS1-5,8S-ITS2
Nhiệt độ (oC) Thời gian
Nhiệt độ biến tính đầu 94 4 phút
Nhiệt độ biến tính ở mỗi chu kỳ 95 30 giây
Nhiệt độ bắt cặp mồi 50 30 giây
Nhiệt độ kéo dài 72 60 giây
Nhiệt độ kéo dài ở chu kỳ cuối 72 8 phút
Phản ứng PCR được thực hiện trong 35 chu kỳ. Kết thúc phản ứng hạ nhiệt độ xuống 4oC. Lấy 7 µl sản phẩm điện di trên gel agarose 1%. Kết quả thể hiện ở điện di đồ hình 13:
Hình 13. Điện di đồ sản phẩm của phản ứng PCR của chủng C1 và B7
Đoạn DNA mà cặp mồi ITS1 và ITS4 khuếch đại có chứa vùng ITS1-5,8S- ITS2 của nấm mốc Aspergillus có độ dài khoảng 620 bp, trên bảng điện di thấy rằng đoạn được nhân lên có kích thước nhỏ hơn 700 bp và lớn hơn 600 bp. Do đó có thể nhận định rằng đoạn DNA chứa vùng ITS1-5,8S-ITS4 đã được khuếch đại. Muốn biết chính xác hơn cần tiến hành giải trình tự của sản phẩm của phản ứng PCR này.