3.2.1.1 Xác định và sửa đổi trình tự gen EPSPS
Từ trình tự gen EPSPS của Agrobacterium chủng CP4 trên ngân hàng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ EPSPS. Trên cơ sở trình tự này một trình tự gen có khả năng biểu hiện phù hợp trong hệ thống thực vật được suy diễn bằng phần mềm của công ty Epochlifescience (Mỹ). Để trình tự thu được có độ chính xác cao chúng tôi đã tổng hợp nó tại hãng.
3.2.1.2. Phản ứng cắt đoạn gen SP-EPSPS-Cmyc từ vector pBluescript.
Để thiết kế vector chuyển gen, plasmid pBluescriptII SK(-)/EPSPS và vector chuyển gen pBI121 được cắt đồng thời bằng 2 enzyme XbaI/SacI.
Phản ứng được ủ ở 370 C trong vòng 6h. Bảng 3.1.Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme giới hạn STT Thành phần Thể tích (µl) 1 H2O deion 20,5 µl 2 Buffer Tango(10X) 5 µl 3 SP-EPSPS-Cmyc (50ng/µl) 20 µl
4 Enzyme Xbal (10u/µl) Enzyme Sac I (10u/µl)
2 µl 2,5 µl
3.2.1.3. Phương pháp thôi gel
Sản phẩm cắt SP-EPSPS-Cmyc bằng enzym giới hạn từ vector tạo dòng pBluescriptII SK(-)/EPSPS được tinh sạch để chuẩn bị lai tách dòng.
Quá trình thôi gel, tinh sạch được thực hiện theo quy trình và bộ hóa chất sử dụng cho tinh sạch của hãng QIAGEN (QIAquick DNA Gel Extraction Kit), gồm các bước sau:
- Thêm Buiding buffer và sản phẩm PCR tỉ lệ 1: 1, ủ 550C/10 phút. - Chuyển sang cột lọc tím li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút 30 giây. - Bổ sung Wash buffer li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút 30 giây. - Chuyển cột lọc tím sang ống eppendorf 1,5 ml mở nắp 5 phút.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ - Bổ sung nước khử ion để 5 phút li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút
30 giây thu dịch đáy bảo quản ở -200 C.
3.2.1.4. Ghép nối đoạn gen SP-EPSPS-Cmyc vào vector pBI121
Sản phẩm cắt SP-EPSPS-Cmyc từ vector plasmid pBluescript và vector pBI121 bằng 2 enzyme XbaI/SacI, được tinh sạch sau đó được ghép nối bằng T4 ligase tạo plasmid tái tổ hợp mang gen CP-EPSPS-Cmyc.
Bảng 3.2. Thành phần phản ứng lai STT Thành phần Thể tích (µl) 1 H2O deion 1 2 Buffer T4 ligase 10X 1 3 pBI121 (500 ng/µl) 4 4 CP-EPSPS-Cmyc (500 ng/µl) 3
5 Enzyme T4 ligase (10u/µl) 1
Tổng thể tích 10
Hỗn hợp phản ứng được ủ ở nhiệt độ 220
C trong 2 giờ.
Đặt phản ứng trong đá và chuẩn bị thực hiện quá trình biến nạp vào tế bào khả biến E. Coli DH5α.
3.2.1.4. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào E. Coli DH5α Nguyên lý
Dưới tác dụng của CaCl2 thành của tế bào vi khuẩn đang ở thời kỳ sinh trưởng sẽ trở nên xốp. Khi đó việc thay đổi nhiệt độ thích hợp sẽ làm xuất hiện các lỗ tạm thời trên màng tế bào, tạo điều kiện cho các phân tử DNA đi vào tế bào chất.
Phương pháp chuẩn bị tế bào khả biến E. Coli DH5α.
- Tế bào E.coli DH5α được cấy ria trên môi trường LB đặc và nuôi qua đêm ở 370
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ - Cấy 1 khuẩn lạc E.coli vào môi trường LB lỏng lắc 200 vòng/ phút, ở
37oC, qua đêm.
- Chuyển 0,5 ml dịch tế bào sang 50 ml môi trường LB, tiếp tục nuôi lắc 200 vòng/ phút, ở 37oC cho tới khi OD600 đạt 0,4 - 0.6. Sau đó, lấy mẫu ra và đặt vào đá khoảng 1h. Từ bước này tất cả các thao tác đều phải được tiến hành ở 4o
C.
- Ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút, thu tế bào. Hòa tế bào bằng 50 ml nước khử ion, lạnh vô trùng. Ly tâm 4000 vòng/ phút, thu tủa.
- Hòa tế bào thu được trong 50ml CaCl2 100 mM (lạnh, vô trùng). Ủ mẫu 15 phút và ly tâm thu tế bào ở 4000 vòng/phút trong 10 phút.
- Hòa tủa trong 25 ml CaCl2 100 mM, ủ mẫu 60 phút trong đá. - Ly tâm 4000 vòng/ phút trong 10 phút ở 4oC.
- Hòa tế bào trong 0,5 ml CaCl2 100 mM, bổ sung glycerol 15% trộn đều.
- Hút 0,1ml dịch tế bào trên vào mỗi ống eppendorf và bảo quản ở -80oC.
Biến nạp bằng sốc nhiệt
- Tế bào khả biến được lấy từ -80oC, làm tan dần trong đá trong khoảng 30 phút.
- Lấy 7 µl mẫu sản phẩm lai, đảo nhẹ nhàng để DNA phân bố đều trong dịch tế bào khả biến. Sau đó để mẫu trong đá 30 phút.
- Sốc nhiệt bằng cách chuyển mẫu vào bể ổn nhiệt với nhiệt độ là 42o C và ủ trong 90 giây.
- Lấy mẫu ra rồi đặt ngay vào đá trong 2 phút.
- Bổ sung khoảng 500 - 600 µl LB lỏng vào mẫu lắc ở 37o
C trong 45 – 50 phút.
- Ly tâm 5.000 vòng ở 250C trong 5 phút, loại bỏ gần hết dịch nổi, chỉ để lại khoảng 100µl dịch, trộn đều sinh khối lắng để thành dạng huyền phù tế bào.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ - Hút 100 µl dịch tế bào và cấy trải trên đĩa môi trường LB đặc bổ sung
kanamycine 50mg/l. - Nuôi qua đêm ở 37o
C.
3.2.1.5. Phương pháp tách chiết plasmid
Vector tái tổ hợp được tách chiết theo phương pháp tách chiết plasmid của Sambrook và Russell (2001)[31].
Bảng 3.3. Thành phần hóa chất tách chiết plasmid
STT Thành phần
Sol I 50 mM glucose, 25 mM Tris HCl pH 8, 10 mM EDTA pH 8
Sol II 0,2 NaOH, SDS 1 %
Sol III 60 ml potassium acetate 5M; 11,5 ml glacial acetic acid; 28,5 ml H2O
Các bước tiến hành tách plasmid:
- Lấy 10 ml dung dịch vi khuẩn nuôi trong LB lỏng 12 - 16 giờ. - Ly tâm 8000 v/p thu tế bào, có thể lặp lại 5 lần để thu hết cặn khuẩn
của 10 ml dịch khuẩn.
- Bổ sung 200 µl Sol I hòa tan tế bào hoàn toàn. - Bổ sung 400 µl Sol II trọn nhẹ trong 30 giây. - Bổ sung tiếp 300 µl Sol III trộn nhẹ trong 30 giây.
- Bổ sung 900 µl chloroform : isoamin (24 : 1) trộn đều trong 3 phút. - Ly tâm 13000v/p, hút nhẹ nhàng không cặn 900µl pha trên sang ống
effendorf mới.
- Cho 900 µl isopropanol 100% để ở nhiệt độ -4o
C trong 30 – 180 phút, ly tâm 13000 v/p, loại bỏ phần dịch lỏng, thu cặn.
- Cho 500 µl cồn 70% vào, ly tâm 7000 v/p trong 5 phút, sau đó loại bỏ cồn và làm đông khô trong 30 phút.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ - Hòa tan sản phẩm trong 50 µl nước khử ion.
- Bổ sung Rnase - Ủ ở 370
C trong 30 phút.
- Kiểm tra sản phẩm tách plasmid bằng điện di trên gel agarose 0,8%. Cắt sản phẩm tách plasmid bằng enzym cắt giới hạn XbaI và SacI, sau đó
sử dụng phương pháp PCR để kiểm tra sự có mặt của gen quan tâm với cặp mồi pUC18- F và pUC18- R với chu kì nhiệt 55o
C, cho phản ứng PCR như sau: Bảng 3.4. Thành phần phản ứng PCR STT Thànhphần Thểtích (µl) 1 H2O deion 12,5 2 Buffer (10x) 2,5 3 dNTPs (25mM) 2,5 4 MgCl2 (2,5 mM) 2,5 5 pBI121/EPSPS (100ng) 2
6 Taq polymerase (1u/µl) 1
7 pUC18- F (10 pM) 1 8 pUC18- R (10 pM) 1 Tổng 25 72oC ∞ 94oC 94oC 4 phút 45 giây 550C 45 giây 1 phút 15 giây 72oC 10 phút 4oC
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ - Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên agaro
1%.
A.tumefaciens CV58
3.2.2.1. Quy trình biến nạp vào A. tumefaciens bằng xung điện:
- Tế bào khả biến A. tumefaciens CV58 được giữ trong tủ -85 o C. - Làm lỏng tế bào khả biến trên đá 30 phút.
- Thêm 5 – 10 µl sản phẩm DNA tái tổ hợp, để trên đá 10 phút.
- Để trên đá 10 phút, cuvet được ngâm cồn, chiếu đèn tím khử trùng rồi làm lạnh trong đá 5 phút, sau đó bổ sung dịch tế bào khả biến chứa vector tái tổ hợp vào trong cuvet.
- Xung điện ở 25F, 2,5kV, 400Ω.
- Bổ sung 500µl LB lỏng vào cuvet, chuyển sang ống 2ml. - Nuôi lắc 28oC 1 giờ.
- Chuyển dịch ra đĩa môi trường LB đặc có bổ xung kanamycine 50mg/l và rifamycin 100 mg/l. Tiếp tục nuôi ở 28oC.
3.2.2.2. Quy trình chuyển gen vào thuốc lá
Quy trình chuyển gen vào giống thuốc lá K326 thông qua vi khuẩn
A.tumefacien CV58 được tiến hành theo phương pháp của Topping có cải tiến
[38]. Các bước chính như sau:
- Chuẩn bị chủng A.tumefacien CV58 mang cấu trúc pBI121/EPSPS: một ngày trước khi biến nạp, nuôi chủng A.tumefacien CV58 mang cấu trúc pBI121/EPSPS vào 5 ml LB lỏng có bổ sung kanamicine 400 mg/L, nuôi lắc 200 v/p ở 28oC.
- Chuẩn bị mảnh lá thuốc lá có kích thước 1 cm2
được làm tổn thương bằng lưỡi dao cắt bốn cạnh xung quanh, cho vào bình tam giác.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ hồi không kháng sinh 3 – 4h đến khi đo OD600 = 0,7 - 1 là có thể được sử dụng cho biến nạp. Ly tâm lạnh thu sinh khối, hòa tan sản phẩm sinh khối lắng vào ½ MS, lắc đều tạo dạng huyền phù tế bào vi khuẩn.
- Đổ dịch khuẩn vào bình tam giác có chứa các mảnh cấy lá thuốc lá ở trên.
- Sau 30 phút chuyển các mảnh cấy lên giấy thấm đã khử trùng, thấm khô và cấy lên môi trường MS. Sau 2 ngày chuyển sang môi trường MS có BAP để tạo mô sẹo và hình thành đa chồi, có bổ sung kháng sinh cefotaxim 400 mg/l và kanamycin 50 mg/l.
- Sau 2 - 4 tuần các mảnh cấy bắt đầu cảm ứng tạo chồi và chuyển sang môi trường MS có bổ sung cefotaxim 400 mg/l và kanamycine 50 mg/l. - Các chồi dài 2 – 3 cm được cắt và chuyển sang môi trường ra rễ RM50
có bổ xung cefotaxim 400mg/l và kanamycine 50mg/l.
- Khi cây con ra rễ nhiều và cao 5 – 10cm thì được ra trồng ngoài bầu trấu:cát = 1:1.
- Sau 7 – 10 ngày chuyển các cây con ra bầu đất trồng tại nhà lưới.
.
3.2.3.1. Tách DNA tổng số, PCR với cặp mồi đặc hiệu. * Tách DNA tổng số.
Quy trình tách chiết DNA tổng số từ lá cây thuốc lá:
- Cân 200g mẫu lá cây và nghiền nát trong nitơ lỏng bằng cối, chày sứ cho đến khi thành dạng bột mịn, sau đó cho vào ống eppendoff 2ml. - Bổ sung thêm 700 µl dung dịch đệm tách chiết DNA và trộn đều bằng
cách đảo nhẹ.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ - Thêm 600 µl dung dịch chloroform: isoamyl (24 : 1) và đảo đều, để 5
phút ở nhiệt độ phòng.
- Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 13000 v/p ở 4o
C, trong 15 phút. Dùng pipette hút lấy 500 µl dịch sang ống eppendoff 1,5 ml.
- Thêm 500 µl isopropanol lạnh, để ở nhiệt độ khoảng -200C, trong thời gian 30 phút.
- Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 13000 v/p ở 4o
C, trong 10 phút.
- Loại bỏ phần dịch nổi phía trên rửa DNA kết tủa dưới đáy ống bằng cồn 70% (1 lần). Ly tâm 13000 v/p và làm khô DNA kết tủa ở đáy ống eppendorf.
- Thêm 50 µl nước khử ion và 2 µl RNAse, ủ ở 370C trong 30 phút. Bảo quản DNA tổng số ở -200
C.
Bảng 3.5. Thành phần dung dịch đệm tách chiết DNA
STT Thành phần Nồng độ
1 Tris-HCl, pH = 8,0 0,1 M
2 NaCl 1,4 M
3 EDTA 0,02 M
4 CTAB 4%
* PCR kiểm tra sự có mặt của gen biểu hiện
Chúng tôi tiến hành phản ứng PCR để kiểm tra sự có mặt của gen quan tâm với cặp mồi EPSPS-F (GCATGCTTCACGGTGCAAGCAG) và CYMC-R (CGAGCTCTCAATTCAGATCCTCTTC)với thành phần:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Bảng 3.6. Thành phần chạy phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 H2O 12,5 2 Buffer (10X) 2,5 3 dNTP (25mM) 2,5 4 Mg2+ (25mM) 2,5 5 EPSPS-F(10 pM) 1 6 CYMC-R(10 pM) 1 7 Taq 1 8 EPSPS 2 Tổng 25
* Kiểm tra kết quả PCR bằng điện di trên gel agarose 0,8% 3.2.3.2. Phương pháp lai Western blot
Nguyên lý
Phương pháp lai western blot là phương pháp lai miễn dịch dựa trên phản ứng giữa kháng nguyên và kháng thể. Các protein sau khi điện di trên SDS- PAGE được chuyển sang màng PVDF, vị trí không có protein được phủ bằng cazein. Sau đó màng PVDF được phủ bằng kháng thể đặc hiệu với protein được gắn trên màng. Phức hệ protein – kháng thể được phát hiện thông qua một kháng kháng thể có gắn enzyme có tác dụng phân hủy cơ chất tạo màu.
Phương pháp
- Chạy điện di biến tính protein bằng SDS-page với 2 bản gel một để nhuộm comassie và một bản để thực hiện phản ứng lai western blot. - Gỡ bản gel chuyển sang bộ chuyển màng của hãng Bio-Rad có chứa
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Thứ tự đặt như sau: tấm xốp + giấy thấm + gel + màng PVDF + giấy thấm + tấm xốp. Trong đó màng PVDF được xử lý trước trong dung dịch methanol 100% trong 10 phút, được tráng lại bằng đện chuyển 1x.
- Chạy western blot với hiệu điện thế U = 100V (cường độ dòng điện 200-250 mA) trong 2h, ở 4oC, khuấy từ nhẹ.
- Sau khi chạy xong lấy màng PVDF ra và tráng màng bằng nước khử ion 2 lần.
- Phủ màng 2h ở 25oC bằng dung dịch sữa skim milk 5% trong TBS 1x. - Rửa màng bằng TTBS 1X, 3 lần, mỗi lần 5 phút.
- Rửa màng bằng TBS 1X, 3 lần, mỗi lần 5 phút.
- Phủ kháng thể 1 kháng Cmyc (từ chuột), kháng thể 1 pha loãng 500 lần trong sữa skim milk 5%, lắc ở nhiệt độ phòng trong 3h, lặp lại 2 bước rửa như trên.
- Phủ kháng thể 2, kháng thể 2 (anti-mouse-Ig, Horseradish peroxidase) pha loãng 10000 lần trong sữa skim milk 5% trong TBS 1X, lắc ở nhiệt độ phòng trong 1h, lặp lại 2 bước rửa như trên.
- Hiện màu trong dung dịch hiện màu alkaline.
- Ủ màng, lắc ở nhiệt độ phòng trong 10 phút, quan sát màu.
3.2.3.3. Phun thuốc trừ cỏ kiểm tra mức độ kháng thuốc của thuốc lá mang gen
- Cây thuốc lá chuyển gen được trồng tại nhà lưới sau 30 ngày. - Đánh dấu dòng theo mức độ phát triển của cây như sau:
WT: dòng K326 thuần chủng không mang gen chuyển. E1, E2, E3, E4, E5, E6.
- Các dòng thuốc lá trên được thử nghiệm bằng thuốc trừ cỏ VIFOSATE 240DD (công ty cổ phần thuốc sát trùng Việt Nam) có nồng độ glyphosate khoảng 2,4 g/l. Phun đều trên bề mặt lá.
- Sau 12 ngày kiểm tra mức độ kháng bằng sự sinh trưởng và phát triển của cây.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả
4.1.1. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc SP-EPSPS-Cmyc.
4.1.1.1. Kết quả tổng hợp và đổi mã gen biểu hiện EPSPS
Từ các nguồn tài liệu tham khảo [26, 29, 30] và kết quả so sánh trình tự EPSPS từ tế bào Agrobacterium chủng CP4 theo ngân hàng gen thế giới
NCBI, chúng tôi xác định đoạn gen mã hóa Enzyme 3-phosphoshikimate-1- carboxyvinyltransferase (EPSPS) có kích thước 1365 bp, trình tự như sau:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Gen mã hóa cho protein kích thước 454 aa và một mã kết thúc trình tự