CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu
Nấm men Rhodosporidium paludigenum đã được giữ giống trong môi trường Hansen chứa 50% glycerol, bảo quản ở -20oC.
- Phương pháp hoạt hóa
Từ ống giống tiến hành cấy ria trên đĩa thạch môi trường thạch Hansen, bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ.
Chủng Rhodosporidium paludigenum
Hoạt hoá
Nuôi cấy
Khảo sát ảnh hưởng của chất nền
Khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, thời gian
Tách chiết carotenoid
Xác định nồng độ đường khử
Thử khả năng kháng khuẩn Thử khả năng kháng oxy hoá
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm
21 - Phương pháp nuôi cấy
Từ các khuẩn lạc đơn thu được trên đĩa thạch, chọn một khuẩn lạc đơn cho vào nuôi cấy trong bình thủy tinh tam giác 250 mL chứa 50 mL môi trường Hansen. Bổ sung các yếu tố khảo sát. Tiến hành nuôi cấy lắc ở 28oC, trong 6 ngày.
2.3.2.2. Phương pháp chuẩn bị chất nền
Chất nền là vỏ trái cây được thu từ cửa hàng trái cây tại thành phố Đà Nẵng. Các chất nền được nấu theo tỉ lệ 1 : 1 (vỏ trái cây : nước cất) đem đi nấu ở 100oC trong 30 phút, dịch chiết được lọc bằng màng lọc và được sử dụng làm môi trường lên men (Gunjan Singh và cs, 2018).
2.3.2.3. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của chất nền đến khả năng sản xuất carotenoid của Rhodosporidium paludigenum
Rhodosporidium paludigenum hoạt hóa trong môi trường Hansen trong 24 giờ. 1 mL dịch cấy đã hoạt hóa được cấy vào các bình nón 250 mL, pH = 6, nhiệt độ 25oC, tốc độ lắc là 120 rpm, trong 6 ngày. Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của chất nền đến khả năng sản xuất carotenoid của Rhodosporidium paludigenum theo các nghiệm thức:
- Nghiệm thức 1: 50 mL (dịch chiết vỏ chuối + 3 g/L KH2PO4, 3 g/L MgSO4 .7H2O, 10 g/L peptone).
- Nghiệm thức 2: 50 mL (dịch chiết vỏ cam + 3 g/L KH2PO4, 3 g/L MgSO4 .7H2O, 10 g/L peptone).
- Nghiệm thức 3: 50 mL (dịch chiết vỏ dưa hấu + 3 g/L KH2PO4, 3 g/L MgSO4 .7H2O, 10 g/L peptone).
- Nghiệm thức 4: 50 mL (dịch chiết vỏ xoài + 3 g/L KH2PO4, 3 g/L MgSO4 .7H2O, 10 g/L peptone).
- Nghiệm thức 5: 50 mL (dịch chiết vỏ dứa + 3 g/L KH2PO4, 3 g/L MgSO4 .7H2O, 10 g/L peptone).
- Nghiệm thức 6: 50 mL môi trường Hansen lỏng (50 g/L D-glucose + 3 g/L KH2PO4, 3 g/L MgSO4 .7H2O, 10 g/L peptone).
- Nghiệm thức 7: 50 mL dịch chiết tối ưu.
22 Mỗi nhóm nghiệm thức được thực hiện trong ba lần
* Chỉ tiêu đánh giá: khối lượng sinh khối khô carotenoid, hàm lượng carotenoid, hàm lượng đường khử (Renna Eliana Warjoto và cs, 2020).
2.3.2.4. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, thời gian đến khả năng sản xuất carotenoid của Rhodosporidium paludigenum
Sử dụng chất nền tối ưu ở các nghiệm thức trên để khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt độ và thời gian nuôi cấy đến khả năng sản xuất carotenoid của Rhodosporidium paludigenum.
Mỗi nghiệm thức được cấy 106 tế bào/mL của R. paludigenum (Renna Eliana Warjoto và cs, 2020). Quá trình lên men để sản xuất carotenoid được thực hiện trong máy lắc ở 120 vòng/phút và 28oC, pH = 6,5 và nuôi trong 6 ngày. Mỗi nhóm nghiệm thức được thực hiện trong ba lần.
- Ảnh hưởng pH: pH môi trường ban đầu được điều chỉnh bằng cách sử dụng NaOH 1N và HCl 1N để được pH môi trường là 4, 5, 6, 7.
- Nhiệt độ: nuôi cấy nấm men của Rhodosporidium paludigenum trong các khoảng nhiệt độ khác nhau 20oC, 20oC, 30oC, 35oC.
- Thời gian nuôi cấy: nuôi cấy nấm men của Rhodosporidium paludigenum trong các khoảng thời gian khác nhau 5, 6, 7, 8 ngày nuôi cấy.
* Chỉ tiêu đánh giá: khối lượng sinh khối khô carotenoid, hàm lượng carotenoid.
2.3.2.5. Phương pháp tách chiết và định lượng carotenoid Phương pháp tách chiết
- Dịch nuôi cấy lỏng được ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút để thu tủa, tủa được rửa 2 lần với nước cất. Tủa được sấy ở 50oC đến khối lượng không đổi. Phần nổi phía trên được giữ lại để xác định nồng độ đường khử.
- Sắc tố được tách chiết từ sinh khối khô bằng cách sử dụng Dimethyl sulfoxide (DMSO) và acetone với các bước như sau:
+ Cân 0,2 (g) sinh khối, thêm vào 3 mL DMSO (ủ trước ở 55oC trong 15 phút), ủ trong 1 giờ, voxtex kĩ trong 3 phút.
23
+ Theo Fonseca và cộng sự (2011), thêm 6 mL acetone vào, tiến hành ly tâm ở 1800 vòng ở 25oC trong 10 phút. Thu dịch nổi (chiết liên tục 2-3 lần đến khi các tế bào mất màu).
+ Thu tất cả dịch chiết acetone và dịch nổi chứa DMSO rồi gộp chúng lại với nhau.
+ Thêm 10 mL NaCl 20% (w/v) và 10 mL Petroleum Ether (PE). Sau khi khuấy và tách pha, lượng nước dư thừa được loại bỏ bằng Na2SO4 để thu được carotenoid (Rodriguez – Amaya và cs, 2008). Thu dịch nổi sắc tố trong pha PE.
- Tổng nồng độ carotenoid được xác định bằng phép đo quang phổ (Biospectro, SP 220, Trung Quốc) đọc ở bước sóng 474 nm. Giá trị thu được bằng phương trình 1 với hệ số hấp thụ riêng trong Petroleum Ether, i. e., 2100 mol/L/cm (Domínguez - Bocanegra &
Torres-Munoz, 2004).
Phương pháp định lượng carotenoid
Từ dịch chiết sắc tố thu được tính hàm lượng carotenoid trên 1 gam sinh khối khô (μg/g) trong mẫu theo công thức (1):
C = 100𝐴474𝑉
21𝑚 (1) Trong đó:
C: Hàm lượng carotenoid (μg/g)
A474: Độ hấp thụ của dịch chiết sắc tố trong dung môi Petroleum Ether ở bước sóng 474 nm
V: Thể tích dịch chiết sắc tố (mL)
m: Khối lượng sinh khối khô nấm men dùng để chiết (g)
Hàm lượng sắc tố tính trên thể tích dịch nuôi cấy (μg/L) tính theo công thức (2):
T = C * m
T: Hàm lượng carotenoid tính trên thể tích dịch nuôi cấy (μg/L)
C: Hàm lượng carotenoid tính trên gam sinh khối khô (μg/g) (công thức (1)) m: Khối lượng sinh khối khô tính trên 1 lít dịch nuôi cấy (g/L)
2.3.2.6. Phương pháp xác định nồng độ đường khử
24
Nồng độ đường được đo trong sáu ngày bằng phương pháp định lượng đường khử của Bertrand. 10 mL dịch chiết cần được khảo sát được thêm vào với 10 mL thuốc thử Fehling, sau đó đem đun sôi trong khoảng 3 phút để thu kết tủa đỏ. Kết tủa đỏ được hoà tan bằng cách cho từ từ 5 mL dung dịch Fe2(SO4)3 trong H2SO4. Chuẩn độ dung dịch thu được bằng KMnO4 1/30N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền trong 20 - 30 giây. Từ lượng đường khử KMnO4 1/30N dùng để chuẩn độ, tra bảng để suy ra lượng đường khử có trong mẫu phân tích.
2.3.2.7. Phương pháp khảo sát hoạt tính chống oxy hoá
* Bắt gốc tự do ABTS+
Hoạt động loại bỏ gốc tự do được xác định bằng phương pháp khử màu ABTS+ mô tả bởi Nikolaos et al. (2004). Dung dịch ABTS+ được chuẩn bị bằng cách cho 10 mL dung dịch ABTS 7 mM và 10 mL dung dịch K2S2O8 2,45 mM. Ủ dung dịch trong bóng tối 16 giờ, sau đó pha loãng bằng ethanol, điều chỉnh độ hấp thu của dung dịch ở bước sóng 734 nm có mật độ quang là 0,7 ± 0,05. Tiến hành khảo sát hoạt động trung hòa gốc tự do ABTS+ bằng cách cho10 μL dịch chiết carotenoid vào 990 μL ABTS+ . Hỗn hợp phản ứng được ủ trong thời gian 6 phút. Sau đó, đo độ hấp thụ quang phổ ở bước sóng 734 nm. Kết quả so sánh với Vitamin C, từ đó kết luận carotenoid có hoạt tính bắt gốc ABTS+
Phần trăm bắt gốc tự do được tính theo công thức: [100* (A-B)]/A A là giá trị OD734 của mẫu đối chứng (thay mẫu bằng dung dịch đệm) B là giá trị OD734 của mẫu
2.3.2.8. Phương pháp khảo sát hoạt tính kháng khuẩn
* Phương pháp đục lỗ trên đĩa thạch
Carotenoid được hòa tan trong DMSO. Đối chứng âm được sử dụng chính là DMSO, đối chứng dương là kháng sinh. Sau đó hút 100 μL chất thử nghiệm cho vào lỗ thạch. Thao tác phải được tiến hành trong điều kiện vô trùng ủ các đĩa petri trong vòng 24 giờ ở nhiệt độ 37oC. Sau cùng, quan sát kết quả dựa vào vòng vô khuẩn. Nếu mẫu có tạo vòng vô khuẩn chứng tỏ chất thử nghiệm có khả năng kháng được chủng vi khuẩn được thử nghiệm ( Uma và cs, 2013).
25 2.3.2.9. Quy trình thí nghiệm
Vỏ trái cây Lọc Dịch chiết vỏ trái cây R. paludigenum
Máy đo uv-vis Dịch chiết carotenoid Sinh khối sau khi ly tâm
2.3.2.10. Phương pháp xử lý số liệu
Các thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần, lấy giá trị trung bình. Các số liệu được xử lý và xác định ý nghĩa thống kê bằng phần mềm xử lý số liệu SPSS 22.0.
Sinh khối lỏng
26